Investigación

 

Evaluación de la susceptibilidad a la oxidación microsomal de una serie de análogos de nifedipina

 

Alejandra De la Cerda,¹ Pedro A. Lehmann,¹ Cleva Villanueva,² Gabriel Marcelin,² Victor Pérez-Alvarez¹ y Zurisaddai Hernández-Gallegos^1,*

 

¹ Departamento de Farmacología y Toxicología, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, Instituto Politécnico Nacional, AP 14-740, México 07000, D.F. Tel. (5) 747-7000 ext. 5426, Fax (5) 747-7095. E-mail: zhernand@mail.cinvestav.mx

² Laboratorio de Farmacología, Escuela Militar de Graduados de Sanidad, Cerrada de Palomas s/n, Col. Lomas Altas, México 11620, D.F.

 

Recibido el 10 de octubre del 2000.
Aceptado el 25 de octubre del 2000.

 

Resumen

En el presente trabajo se reporta la síntesis y la velocidad de oxidación microsomal de la nifedipina y 27 de sus análogos. Se observó una importante influencia del efecto electrónico de los sustituyentes en el anillo aromático sobre la velocidad de oxidación. De las 1,4-dihidropiridinas estudiadas, el análogo 2,3-difluorofenil sustituido fue el que presentó la menor velocidad de oxidación microsomal.

Palabras clave: nifedipina, derivados, síntesis, oxidación microsomal.

 

Abstract

The synthesis and microsomal oxidation rate of nifedipine and 27 analogues are reported. It was found an important influence of the electronic effect of aromatic substituents on the oxidation rate. Of the 1,4-dihydropyridines studied, the 2,3-difluorophenyl analogue was the least susceptible to oxidation.

Keywords: nifedipine, derivatives, synthesis, microsomal oxidation.

 

Introducción

La nifedipina y otras 1,4-dihidropiridinas (DHPs) son fármacos utilizados frecuentemente en el tratamiento de la hipertensión, la angina de pecho y otros desórdenes cardiovasculares. Estos compuestos pertenecen al grupo de agentes farmacológicos conocidos como bloqueadores de la entrada de calcio (BECs; también llamados antagonistas de calcio). El mecanismo de acción de los BECs fue descrito por Fleckenstein en 1963 [1], quien determinó que estos compuestos ejercen su acción a través de suprimir la entrada de calcio a la célula. Estudios posteriores reafirmaron esta propuesta y precisaron que los BECs actuaban directamente sobre los canales de calcio operados por voltaje; en el caso particular de las DHPs, éstas actúan preferentemente sobre canales de calcio operados por voltaje de tipo L.

Las DHPs son bien absorbidas del tracto gastrointestinal pero están sujetas a un importante metabolismo de primer paso [2, 3]. Por ello, en general presentan baja biodisponibilidad y un efecto relativamente breve [4]. El metabolismo de las DHPs es realizado principalmente en el hígado por el sistema enzimático del citocromo P450 (isoformas UT-A y PCN-E en rata, y IIIA4 en humano) [5, 6]. La deshidrogenación del sistema DHP (oxidación a piridina) es el primer y más importante paso en el metabolismo de las DHPs y conduce a la inactivación de estos compuestos como BECs [7]. Por ello, el encontrar DHPs con menor susceptibilidad a la oxidación es una alternativa en la búsqueda de DHPs con una mejor biodisponibilidad.

Varios estudios de relación estructura-actividad han mostrado que la sustitución en el anillo aromático de la molécula de DHP influye de manera importante en la velocidad de oxidación microsomal de estos compuestos [6, 8]. En un trabajo anterior [9], encontramos que las sustituciones 3,5-difluro y 3-bromo-4-fluoro en el anillo aromático protegían a las DHPs de la oxidación (ésto en comparación de la sustitución 3-nitro), lográndose DHPs con prolongada actividad anti-hipertensiva. El presente trabajo es una continuación en la búsqueda de otros sustituyentes que pudieran disminuir la velocidad de oxidación microsomal de las DHPs.

 

Resultados y discusión

Síntesis de compuestos. Las DHPs (1a-28a) y sus correspondientes piridinas (1b-28b) fueron preparadas por procedimientos descritos en la literatura [10, 11] y que son mostrados en la Fig. 1. En la Tabla 1 se reportan la estructura y las propiedades físicas de los compuestos sintetizados. Sólo 3 de las DHPs (22a, 26a y 28a) y 20 de las piridinas (2b-5b, 7b-9b, 13b, 15b-22b, 24b-26b y 28b) son nuevos (no reportados en la literatura). Los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN 1H), así como el análisis elemental (C, H, N y halógenos), confirmaron la estructura propuesta para los compuestos nuevos sintetizados. En el caso de los compuestos conocidos, los puntos de fusión determinados fueron acordes a los reportados para cada compuesto.

Susceptibilidad de las DHPs a la oxidación. En este estudio sólo se trabajó con DHPs no quirales, ya que es bien sabido que pueden existir diferencias en la biotransformación de enantiómeros [12, 13]. Todas las DHPs estudiadas son análogos de nifedipina (10a), con diferentes sustituyentes en el anillo aromático.

Los resultados obtenidos en la determinación de la velocidad de oxidación microsomal, expresados como velocidad máxima aparente (V_max), son presentados en la Tabla 2. El análisis de los valores de V_max muestra algunos patrones en las diversas subseries de DHPs monosustituídas. Por ejemplo, en la comparación de los valores de V_max de las DHPs con sustituyente fluoro en posición para, meta u ortho (12a, 17a y 18a, respectivamente), puede verse un incremento en la velocidad de oxidación conforme el sustituyente se aleja del carbono aromático unido al anillo 1,4-dihidropiridina. Lo mismo puede observarse para las DHPs con sustituyente cloro o bromo (4a vs. 6a, y 19a vs. 3a). Un comportamiento inverso es presentado por las DHPs con sustituyente metilo (8a vs. 20a) que, a diferencia de los halógenos, es electrodonador. Esto sugiere que para reducir la oxidación de las DHPs es mejor que éstas presenten un sustituyente electroatractor en posición ortho. Lo anterior está de acuerdo con el mecanismo de oxidación de DHPs que propone la formación de un radical catiónico como paso inicial (y limitante) de la reacción [5, 14, 15], ya que la presencia de un átomo (o grupo) electroatractor en una posición cercana al sitio donde se lleva a cabo la oxidación (anillo 1,4-dihidropiridina) desestabilizará la formación del radical catiónico y con ello teóricamente se reducirá la velocidad de oxidación.

Un patrón diferente al presentado por las DHPs con sustituyentes halógenos (o grupo metilo) es el presentado por aquellas DHPs con un grupo nitro en el anillo aromático (10a, 11a y 27a), en donde la secuencia de V_max es meta > para > ortho. En este caso, es conocido que el grupo nitro, al igual que los halógenos, es electroatractor por su efecto inductivo pero, en adición a este, también presenta un importante efecto de resonancia en el mismo sentido. Una medida del efecto electrónico total (inductivo y de resonancia) de un sustituyente es la constante de Hammett (σ) [16], que en el caso del grupo nitro indica que el efecto electroatractor de este sustituyente es más fuerte cuando esta en posición para que en posición meta (σ de 0.78 vs. 0.71, respectivamente; no hay valores reportados para sustituyentes en posición ortho). Una consideración similar es aplicable a las DHPs sustituídas con un grupo hidroxilo (2a y 9a), en las que la sustitución para resultó en una mayor susceptibilidad a oxidación microsomal que la sustitución meta, y en donde los valores aplicables de s son −0.37 y 0.12, respectivamente. De esta manera, el comportamiento de las DHPs con grupo nitro o grupo hidroxilo está acorde con lo expuesto anteriormente para las DHPs mono-halogenadas, ya que a un efecto electroatractor mayor corresponde una menor velocidad de oxidación.

Los resultados obtenidos muestran una importante participación del efecto electrónico de los sustituyentes en el anillo aromático sobre la susceptibilidad de las DHPs a la oxidación. Sin embargo, no podemos descartar la posible participación de los efectos hidrofóbicos y/o estéricos de los sustituyentes en la oxidación, aunque no fue posible observar una clara relación de V_max con estos efectos.

En un trabajo publicado por Bäärnhielm y Westerlund [8], los autores hacen notar que dentro de la serie de DHPs que ellos estudiaron, aquellas que presentaban baja velocidad de oxidación microsomal también presentaban bajo o nulo efecto antihipertensivo. Esto pone de manifiesto la importancia de identificar sustituyentes que retarden la oxidación de las DHPs, pero que a la vez sigan teniendo una influencia positiva sobre la actividad biológica de las DHPs. Con el propósito de conocer cuales de los sustituyentes en el presente trabajo cumplían con estos requisitos, se procedió a analizar teóricamente su potencial influencia sobre la actividad anatagonista de las DHPs. Esto fue hecho con base en el trabajo publicado por Coburn y colaboradores [17], quienes estudiaron la influencia de los sustituyentes aromáticos sobre la actividad antagonista de calcio de una gran serie de análogos de nifedipina. De acuerdo a este trabajo, se esperaría que al menos tres de los sustituyentes estudiados que inducen baja oxidación (aquellos en 21a, 22a y 23a) lograrán DHPs con buena biodisponibilidad y significante actividad como BECs.

 

Parte experimental

Materiales

Todos los reactivos y solventes utilizados en el presente trabajo fueron obtenidos de la compañía Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Los puntos de fusión fueron determinados en un aparato MEL-TEMP y son no corregidos. Los espectros de RMN ¹H fueron obtenidos en un espectrómetro Varian EM360A a 60 MHz, empleando cloroformo deuterado o acetona deuterada como disolvente y tetrametilsilano como referencia interna. El análisis elemental de los compuestos nuevos fueron realizados por la compañía Galbraith Laboratories (Knoxville, TN, USA). Todos los compuestos fueron caracterizados por su espéctro de RMN ¹H y su punto de fusión (en el caso de encontrarse reportado), para confirmar la identidad de las estructuras propuestas.

Procedimiento general para la preparación de las DHPs (reacción de Hantzsch)

Una solución de acetoacetato de metilo (1.5 g, 13 mmol), hidróxido de amonio (0.5 ml de una solución acuosa al 40%; equivalentes a 0.11 g, 6.5 mmol de amoniaco) y el correspondiente benzaldehído sustituído (6.5 mmol) en metanol (5 ml) fue sometida a reflujo con agitación magnética por un lapso de 8 a 12 horas. El producto obtenido fue filtrado y recristalizado en metanol.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,3-difluorofenil)-1,4-dihidropiridina (22a). Sólido cristalino: pf 225-227 °C; RMN ¹H (acetona-d₆, 60 MHz) δ 2.4 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 5.3 (1H, s, H-4), 6.8-7.4 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos), 8.1 (1H, s, NH). Anal. C 60.1, H 5.2, N 4.0, F 11.1, calcd para C₁₇H₁₇NO₄F₂, C 60.5, H 5.1%, N 4.2, F 11.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(4-isopropilfenil)-1,4-dihidropiridina (26a). Sólido cristalino: pf 172-174 °C; RMN ¹H (CDCl₃, 60 MHz) δ 1.3 (6H, d, CH(CH₃)₂), 2.5 (6H, s, 2 CH₃), 2.4-3.1 (1H, m, CH(CH₃)₂), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 5.1 (1H, s, H-4), 6.1 (1H, s, NH), 7.3 (4H, d, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 70.5, H 7.4, N 4.1, calcd para C₂₀H₂₅NO₄, C 70.0, H 7.3, N 4.1.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(4-etoxifenil)-1,4-dihidropiridina (28a). Sólido cristalino: pf 158-160 °C; RMN ¹H (CDCl₃, 60 MHz) δ 1.4 (3H, t, OCH₂CH₃), 2.4 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 4.0 (2H, q, OCH₂CH₃), 5.0 (1H, s, H-4), 5.7 (1H, s, NH), 7.1 (4H, dd, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 66.0, H 6.8, N 4.1, calcd para C₁₉H₂₃NO₅, C 66.1, H 6.7, N 4.1.

Procedimiento general para la preparación de las piridinas

A una solución caliente de la DHP (5 mmol) en ácido acético se le adicionó trióxido de cromo (0.76 g, 5 mmol) en pequeñas porciones. Esta solución fue mantenida a reflujo y con agitación magnética por 30 min para posteriormente ser vertida sobre una solución acuosa fría de hidróxido de amonio (pH 10). La solución resultante fue extraída con cloruro de metileno para posteriormente separar la fase orgánica, misma que fue concentrada. El producto resultante (piridina) fue precipitado de la fase orgánica por adición de agua. El precipitado fue filtrado y recristalizado en etanol.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(4-hidroxifenil)-piridina (2b). Sólido cristalino: pf 177-179 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 6.7-7.4 (5H, m, 4 hidrógenos aromáticos + OH). Anal. C 64.5, H 5.5, N 4.1, calcd para C₁₇H₁₇NO₅, C 64.8, H 5.4, N 4.4.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-bromofenil)-piridina (3b). Sólido cristalino: pf 99-101 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 7.2-7.8 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 53.6, H 4.2, N 3.3, Br 21.2, calcd para C₁₇H₁₆NO₄Br, C 53.9, H 4.3, N 3.7, Br 21.1.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2-clorofenil)-piridina (4b). Sólido cristalino: pf 64-66 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.5 (6H, s, 2 OCH₃), 7.1-7.7 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 61.5, H 5.2, N 4.1, Cl 10.2, calcd para C₁₇H₁₆NO₄Cl, C 61.2, H 4.8, N 4.2, Cl 10.6.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-metoxifenil)-piridina (5b). Sólido cristalino: pf 70-72 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 3.8 (3H, s, OCH₃), 6.7-7.5 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 66.0, H 6.0, N 4.2, calcd para C₁₈H₁₉NO₅, C 65.6, H 5.8, N 4.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2-metoxifenil)-piridina (7b). Sólido cristalino: pf 81-82 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 3.8 (3H, s, OCH₃), 6.9-7.4 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 65.2, H 5.8, N 4.2, calcd para C₁₈H₁₉NO_5, C 65.6, H 5.8, N 4.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2-metilfenil)-piridina (8b). Sólido cristalino: pf 64-65 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.1 (3H, s, CH₃), 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.5 (6H, s, 2 OCH₃), 7.1-7.3 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 68.8, H 6.1, N 4.4, calcd para C₁₈H₁₉NO₄, C 69.0, H 6.1, N 4.5.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-hidroxifenil)-piridina (9b). Sólido cristalino: pf 188-190 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 6.8-7.4 (5H, m, 4 hidrógenos aromáticos + OH). Anal. C 64.3, H 5.5, N 4.3, calcd para C₁₇H₁₇NO₅, C 64.8, H 5.4, N 4.4.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,4-dinitrofenil)-piridina (13b). Sólido cristalino: pf 122-124 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 7.4-9.2 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 52.4, H 3.9, N 10.8, calcd para C₁₇H₁₇N₃O₈, C 52.5, H 3.9, N 10.7.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3,5-difluorofenil)-piridina (15b). Sólido cristalino: pf 131-132 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 6.7-7.1 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 61.0, H 4.5, N 4.1, F 11.1, calcd para C₁₇H₁₅NO₄F₂, C 60.9%, H 4.5, N 4.2, F 11.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-piridina (16b). Sólido cristalino: pf 102-104 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 7.2-7.7 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 51.6, H 4.0, N 3.7, Br 19.9, F 5.1, calcd para C₁₇H₁₅NO₄BrF, C 51.5, H 3.8, N 3.5, Br 20.2, F 4.8.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-fluorofenil)-piridina (17b). Sólido cristalino: pf 109-110 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 6.8-7.4 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 64.2, H 5.2, N 4.3, F 6.0, calcd para C₁₇H₁₆NO₄F, C 64.3, H 5.1, N 4.4, F 6.0.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2-fluorofenil)-piridina (18b). Sólido cristalino: pf 93-95 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 6.9-7.6 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 64.5, H 5.2, N 4.3, F 5.8, calcd para C₁₇H₁₆NO₄F, C 64.3, H 5.1, N 4.4, F 6.0.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2-bromofenil)-piridina (19b). Sólido cristalino: pf 82-83 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 7.1-7.8 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 54.1, H 4.4, N 3.7, Br 20.8, calcd para C₁₇H₁₆NO₄Br, C 53.9, H 4.3, N 3.7, Br 21.1.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(3-metilfenil)-piridina (20b). Sólido cristalino: pf 92-93 °C; RMN 1H (acetona-d₆, 60 MHz) δ 2.3 (3H, s, CH₃), 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 6.8-7.4 (4H, m, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 69.0, H 6.2, N 4.4, calcd para C₁₈H₁₉NO₄, C 69.0, H 6.1, N 4.5.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,6-difluorofenil)-piridina (21b). Sólido cristalino: pf 98-99 °C; RMN 1H (acetona-d₆, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 6.9-7.9 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 60.5, H 4.5, N 4.0, F 11.1, calcd para C₁₇H₁₅NO₄F₂, C 60.9, H 4.5, N 4.2, F 11.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,3-difluorofenil)-piridina (22b). Sólido cristalino: pf 76 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.7 (6H, s, 2 CH₃), 3.7 (6H, s, 2 OCH₃), 6.7-7.1 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 60.5, H 4.4, N 4.0, F 11.0, calcd para C₁₇H₁₅NO₄F₂, C 60.9, H 4.5, N 4.2, F 11.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,3-diclorofenil)-piridina (24b). Sólido cristalino: pf 105-107 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 7.1-7.7 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 55.1, H 4.3, N 3.7, Cl 18.7, calcd para C₁₇H₁₅NO₄Cl₂, C 55.5, H 4.1, N 3.8, Cl 19.3.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(2,5-dimetoxifenil)-piridina (25b). Sólido cristalino: pf 96-98 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 3.7 (3H, s, OCH₃), 3.8 (3H, s, OCH₃), 6.6-6.9 (3H, m, 3 hidrógenos aromáticos). Anal. C 63.4, H 5.7, N 3.7, calcd para C₁₉H₂₁NO₆, C 63.5, H 5.9, N 3.9.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(4-isopropilfenil)-piridina (26b). Sólido cristalino: pf 67-69 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 1.3 (6H, d, CH(CH₃)₂), 2.6 (6H, s, 2 CH₃), 2.4-3.1 (1H, m, CH(CH 3)₂), 3.6 (6H, s, 2 OCH3), 7.2 (4H, s, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 70.2, H 6.9, N 4.0, calcd para C₂₀H₂₃NO₄, C 70.4, H 6.8, N 4.1.

2,6-Dimetil-3,5-dimetoxicarbonil-4-(4-etoxifenil)-piridina (28b). Sólido cristalino: pf 92-94 °C; RMN 1H (CDCl₃, 60 MHz) δ 1.4 (3H, t, OCH₂CH₃), 2.4 (6H, s, 2 CH₃), 3.6 (6H, s, 2 OCH₃), 4.0 (2H, q, OCH₂CH₃), 7.7 (4H, dd, 4 hidrógenos aromáticos). Anal. C 66.6, H 6.2, N 3.6, calcd para C₁₉H₂₁NO₅, C 66.5, H 6.2, N 4.1.

Oxidación enzimática de DHPs

La oxidación microsomal de las DHPs fue medida siguiendo el procedimiento descrito por Niwa y colaboradores [3]. Para esto fueron usados microsomas hepáticos de ratas Wistar macho obtenidos por el método de Kamath y colaboradores [18]. Los microsomas (contenidos en 0.150-0.175 mg de proteína) fueron puestos en tubos que contenían solución amortiguadora de fosfatos (0.1 M, pH 7.85) y un sistema generador de NADPH (NADP+ 0.5 mM, glucosa-6-fosfato 10 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0.33 UI/ml, concentraciones finales). Los tubos fueron equilibrados a 37 °C por 3 min y la reacción fue iniciada por la adición de la DHP (5, 10, 20, 35 y 55 µM, concentraciones finales). La reacción fue continuada durante 1 a 10 min a 37 ° C y entonces fue detenida por la adición de 1 ml de cloruro de metileno.

Métodos analíticos

Nitrendipina (110 nM, concentración final; estándar interno) y 100 µl de buffer de carbonatos (1M, pH 10.5, conteniendo 2M de NaCl) se adicionaron a los tubos de reacción. El contenido de cada vial fue mezclado (usando un vortex) y las dos fases fueron separadas por centrifugación (3000 × g por 5 min). La fase orgánica fue transferida a otro tubo y el contenido del tubo de reacción fue extraído una vez mas con cloruro de metileno (1 ml). Las fases orgánicas fueron combinadas y evaporadas a sequedad con corriente de nitrógeno. El residuo fue disuelto en 50 µl de metanol y alicuotas de 20 µl fueron tomadas para la cuantificación por HPLC de la piridina formada. Las corridas cromatográficas fueron realizada en un cromatógrafo Beckman System Gold, acoplado a una columna Hypersil (ODS C18, 3 µm, 0.46 × 10 cm) y un detector de arreglo de diodos (Beckman, module 168). La fase móvil utilizada fue metanol/agua 64:36 (v/v) con una velocidad de flujo de 1.1 ml/min para las DHPs 2a, 3a, 10a, 12a, 15a-17a, 27a y 28a, y de 1.3 ml/min para el resto de DHPs. La detección fue hecha a 254 nm. La relación de altura de picos (piridina/estándar interno) fue interpolada en una curva de calibración, previamente obtenida con las piridinas sintetizadas, para calcular la cantidad de piridina formada. La velocidad de oxidación fue corregida por la concentración de proteína, determinada por el método de Lowry [19], y fue expresada como nanomolas de piridina formada por mg de proteína y por minuto. Finalmente, se calculó V_max de acuerdo a Hanes [20].

 

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Carlos M. Cerda del Departamento de Química del Cinvestav-IPN por los espectros de RMN 1H. Este trabajo fue financiado parcialmente por el CONACyT, donativos 3142P-N y 28082M.

 

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