Actividad antioxidante de Piper Piedecuestanum Trel. & Yunck. y Piper Subpedale Trel. & Yunck.

 

Ana María Mesa^a, Diana Cristina Rincón^a, John Fredy Toro^a, Angélica Tamayo^b, Silvia Blair^a, Benjamín A. Rojano^b,*

 

^a Grupo de Investigación Malaria. Sede de Investigación Universitaria (SIU). Facultad de medicina, Universidad de Antioquia. A.A 1226. Medellín, Colombia.

^b Laboratorio de Ciencias de los Alimentos. Escuela de Química. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. A.A 3840. Medellín, Colombia. Teléfax.: +57(4) 430 9381; Fax: +57(4) 430 9347. * Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. A.A 3840. Medellín, Colombia. Teléfax.: +57(4) 430 9381; Fax: +57(4) 430 9347. E-mail: brojano@unal.edu.co.

 

Received June 2011.
Accepted December 2011.

 

RESUMEN

El presente estudio tuvo como propósito investigar la actividad antioxidante de extractos de hexano, diclorometano, acetato de etilo y metanol obtenidos a partir de las hojas de Piper piedecuestanum TREL. & YUNCK. y Piper subped_.ale TREL. & YUNCK por diferentes métodos espectrofotométricos: ABTS^·+, DPPH^•, FRAP y en algunas muestras seleccionadas ORAC. Los extractos de las dos especies de Piper presentaron una buena actividad antioxidante en las metodologías evaluadas. La especie más activa Piper subpedale TREL. & YUNCK presentó los mejores valores por las técnicas evaluadas y la potencia del extracto de acetato de etilo fue determinada por el ensayo ORAC que presentó valores de capacidad antioxidante de equivalentes de trolox (TEAC)= 2195.91µmol Trolox /gramos de extracto. Las mediciones de la actividad antioxidante por diferentes técnicas, ofrecen ventajas en términos de la predicción de la capacidad antioxidante in vitro de estas dos plantas.

Palabras Clave: Antioxidante, Piper piedecuestanum TREL. & YUNCK. y Piper subpedale TREL. & YUNCK, ensayo de decoloración con el radical catiónico (ABTS^·+), ensayo de decoloración del radical α-α-difenil-β-picrilhidrazilo (DPPH^•), ensayo ferric reducing/antioxidant power (FRAP), ensayo de capacidad de captura de radicales de oxigeno (oxygen radical absorbance capacity, ORAC).

 

ABSTRACT

The present study aimed to investigate the antioxidant activity of extracts of hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol obtained from the leaves of Piper piedecuestanum TREL. & YUNCK. and Piper subpedale TREL. & YUNCK by different spectrophotometric methods: ABTS^·+, DPPH^•, FRAP and ORAC in some selected samples. The most active Piper subpedale TREL. & YUNCK had the lowest rate evaluated by the techniques and power of the ethyl acetate extract was determined by the ORAC assay values presented Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) = 2195.91 μmol Trolox / g of extract. The antioxidant activity measurements by different techniques, offer advantages in terms of predicting the in vitro antioxidant capacity of these two plants.

Key words: Antioxidant, Piper piedecuestanum TREL. & YUNCK. y Piper subpedale TREL. & YUNCK, ABTS^·+, FRAP, DPPH.

 

INTRODUCCIÓN

Los compuestos antioxidantes tienen la capacidad de inhibir, retardar o interrumpir las reacciones de oxidación y transformación que causan daño a los tejidos deteniendo los procesos de iniciación o propagación vía radicales libres, por lo que los antioxidantes son necesarios y ampliamente utilizados para prevenir enfermedades cardiovasculares, arterosclerosis, enfermedades degenerativas, envejecimiento prematuro, entre otras (Wang et al., 2011). Gran variedad de antioxidantes son obtenidos de fuentes naturales como los carotenos y tocoferoles entre otros, lo que ha posicionando a los productos naturales como una fuente de compuestos con potencial antioxidante comparable con la de antioxidantes sintéticos (Krishnaiah et al., 2010). La actividad antioxidante puede ser usada para caracterizar matrices complejas de materiales vegetales, la cual se relaciona con compuestos que pueden proteger un sistema biológico de la excesiva oxidación (Moon et al., 2009).

Piper, el género nominal de la familia Piperaceae, es uno de los géneros más diversos de angiospermas basales. Se considera que actualmente tiene cerca de 1500 especies y su mayor diversidad se encuentra en los bosques húmedos de las regiones tropicales de todo el planeta (Jaramillo et al., 2001; Jaramillo et al., 2004). Pocas especies de Piper son económicamente importantes, por ejemplo; Piper nigrum a partir de la cual se obtiene la pimienta, condimento utilizado popularmente en todo el mundo; Piper methysicum y Piper betle usadas en distintos países de Asia por sus propiedades medicinales (efectos narcóticos) y algunas otras utilizadas a nivel local en Asia y América como plantas medicinales o condimentos (Greig, 2004; Manigauha et al., 2009; Lei et al., 2003; Wu et al., 2002). Químicamente, en Piper se han encontrado lignanos y neolignanos; taninos, saponinas, compuestos fenólicos, terpenos, flavonoides, flavanonas, isoquinolinas, xantonas, limonoides y alcaloides entre otros (Parmar et al., 1997). Muchos de estos compuestos, en especial fenoles y flavonoides son responsables de la actividad antioxidante (Escudero et al., 2008). Extractos etanólicos, metanolicos y acuosos evaluados en su contenido de flavonoides y otros metabolitos con potencial actividad antioxidante son reportados en varias especies de Piper: P. aduncum, P. cubeba, P. tricuspe, P. divaricatum, P. heterophyllum, P. arboreum, P. methysticum (kava kava), P. umbellatum L. P. tuberculatum, P. nigrum, P. sarmentosum, P. guineense, P. betel Linn Paan (Nisar et al., 2010; Khalid et al., 2010; Silva D et al., 2010; Valdivia et al., 2009; Jagdale et al., 2009; Regasini et al., 2008; Sáez A et al., 2008; Da Silva et al., 2010; Singh et al., 2008; Hussain et al., 2010 ).

Los estudios fitoquímicos previos sobre P. piedecuestanum y P. subpedale revelaron la presencia predominante de varios tipos de flavonoides y amidas. Como parte de nuestra serie de estudios sobre fitoquímica y bioactividad en plantas colombianas, en este artículo informamos las propiedades de diferentes extractos obtenidos de dos especies aun no estudias en el campo de la actividad antioxidante P. piedecuestanum y de P. subpedale mediante las principales técnicas de medición antioxidante: ensayo de decoloración con el radical catiónico (ABTS⁺), ensayo de decoloración del radical α-α-difenil-β-picrilhidrazilo (DPPH), ensayo ferric reducing/antioxidant power (FRAP) y para la muestra más activa el ensayo de capacidad de captura de radicales de oxigeno (oxygen radical absorbance capacity, ORAC) con el fin de caracterizar el potencial reductor en los diferentes extractos de estas dos plantas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos
El radical libre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracilo), fosfato ácido de sodio, MeOH, tricloruro de hierro, 2,4,6-tri(2-piridil) triazina (TPTZ), 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), 2,20-azo-bis(2-amidinopropano diclorhidrato) (AAPH) usado como una fuente de radicales peroxilos, Trolox (ácido 6-hidroxi- 2,5,8-tetrametil-chromano-2-carboxílico), fluoresceinato de sodio, ácido ascórbico fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Folin-Ciocalteau fue obtenido de Merck (Darmstadt, Germany). El agua usada en los experimentos es grado HPLC. Los ensayos ORAC se realizaron en un espectrofotómetro de fluorescencia, Perkin Elmer LS55; los ensayos de absorción UV- Vis se hicieron en un espectrofotómetro Jenway 6405.

Colección del material vegetal
Dos especies de Piperaceae, pertenecientes al género Piper. P. piedecuestanum Trel. & Yunck. y P. subpedale Trel. & Yunck fueron colectadas por el botánico especialista Felipe Cardona en los municipios de Norcasia-Caldas y Piedecuesta-Santander (Colombia) y se depositó cada especie en el HUA (Herbario Universidad de Antioquia).

La identificación de las especies fue realizada en conjunto con el Doctor Ricardo Callejas, especialista en la familia Piperaceae.

Preparación del material vegetal para extractos
El material seco y molido de P. piedecuestanum (364,3g), y de P. subpedale (1150g) se sometió a un proceso de extracción por percolación hasta agotamiento empleando 1000mL de los siguientes solventes. Hexano (H), diclorometano (D), acetato de etilo (A) y metanol (M). Después de tres días se comenzó la concentración del extracto a presión reducida en un rotavaporador. Los cuatro extractos de cada planta se codificaron con las iniciales de cada especie y el tipo de extracto. P. subpedale (PS) PSExtH, PSExtD, PSExtA, PSExtM, y para P. piedecuestanum (PP) (PPExtH, PPExtD, PPExtA, PPExtM), se monitorearon por cromatografía en capa delgada con fase estacionaria de sílica gel 60 GF₂₅₄ Merck^®, mediante diferentes sistemas de elusión y revelando con lámpara ultravioleta UV GL-58 a 254 y 366 nm, solución de DPPH (200 mg/L) para determinar la decoloración de posibles compuestos antioxidantes y revelador universal (ácido sulfúrico. anhídrido acético. agua 50.30.20).

Evaluación de la actividad antioxidante

Ensayo de decoloración con el radical catiónico ABTS⁺: se fundamenta en la cuantificación de la decoloración del radical ABTS^·+, debido a la interacción con especies donantes de hidrógeno o de electrones (Re et al., 1999). El radical catiónico ABTS*+ es un cromóforo que absorbe a una longitud de onda de 734 nm y se genera por una reacción de oxidación del ABTS (2,2'-azinobis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio) con persulfato de potasio. En la evaluación se utilizaron 10 μL de extracto y 990 μL de la solución del radical ABTS^·+. A los 30 min de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se leyó el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo, a una longitud de onda de 734 nm. La referencia del reactivo consistió en una solución del radical ABTS^·+ con el solvente de la muestra. Los resultados se expresaron como valores TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) mediante la construcción de una curva patrón usando como antioxidante TROLOX^®.

Ensayo de decoloración del radical α-α-difenil-β-picrilhidrazilo (DPPH): Para cuantificar la capacidad captadora de radicales libres de los extractos se determina el grado de decoloración que provocan sus componentes a una solución metanólica de DPPH mediante el método de Brand-Williams, con algunas modificaciones (Peyrat-Maillard et al., 2000; Brand-Williams et al., 1995). Se preparó una solución madre de DPPH aproximadamente 20 mg/L del radical en metanol, 990 μL de esta solución se mezclaron con 10 μL de solución de extracto a diferentes concentraciones. Se preparó un blanco de muestra que contenía 990 μL MeOH con 10 μL de muestra y ₎un blanco de referencia con 990 μL DPPH y 10 μL de solvente. Se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad y se midió la absorbancia a 517 nm. Los resultados se expresaron como valores TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) mediante la construcción de una curva patrón usando como antioxidante TROLOX^®.

Ensayo FRAP (ferric reducing/antioxidant power): este método evaluó la capacidad antioxidante de una muestra de acuerdo con su capacidad para reducir el hierro férrico (Fe⁺³) presente en un complejo con la 2, 4, 6-tri(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) hasta la forma ferrosa (Fe⁺²), que tuvo un máximo de absorbancia a una longitud de onda entre 590-595 nm (Benzie IF et al., 1996). Este ensayo se llevó a cabo en un buffer ácido acético-acetato de sodio (pH 3.4), que contenía TPTZ y FeCl₃. Se utilizaron 900 μL de esta solución, 50 μL de muestra y 50 μL de agua destilada. Luego de 60 min de reacción se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 593 nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la absorbancia del blanco sin cromóforo, de la misma manera que en las pruebas anteriores. La curva de referencia se construyó usando ácido ascórbico como patrón primario. Las actividades de las muestras se expresaron como TEAC (ascorbic acid equivalent antioxidant capacity. mg de ácido ascórbico/100 g extracto).

Ensayo ORAC (oxygen radical absorbance capacity): En aquellas muestras con resultados de inhibición superiores al 50% a 100 ppm y que presentarán diferencias estadísticamente significativas con altos valores de TEAC para ABTS^·+, DPPH, y de mg de ácido ascórbico / 100 gr muestra para FRAP se realizó el ensayo ORAC. El procedimiento experimental estuvo basado en reportes previos de Ou y otros, (Ou B et al., 2001; Atala E et al., 2009) en el cual se empleaba Trolox como estándar y condiciones controladas de temperatura a 37 °C y pH 7,4. Las lecturas se realizaron a una λ de excitación 493 nm y slit de excitación 5, λ de emisión 515 nm y slit de emisión 13, con atenuador de 1% y sin placa atenuadora. Para el desarrollo de la técnica se utilizaron soluciones de fluoresceína 1x10^-2 M en PBS (75 mM), AAPH 0,6 M en PBS (75 mM). La muestra contenía 21 μL de fluoresceína, 3 μL de PBS, 30 μL del extracto ensayado y 50 μL de AAPH. El efecto protector del antioxidante fue calculado usando las diferencias de áreas bajo la curva de decaimiento de la fluoresceína entre el blanco y la muestra, se comparó contra la curva del Trolox y se expresó en micromoles equivalentes de Trolox por gramo de muestra (μmol Tx/g muestra), de acuerdo con la ecuación 1.

Donde AUC es el área bajo la curva de la muestra, AUC° área bajo la curva para el control, AUC_Trolox área bajo la curva para el Trolox, ƒ es el factor de dilución de los extractos.

 

Análisis estadístico

La comparación entre las dos plantas y los diferentes ensayos de actividad antioxidante se realizó mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con un nivel de confianza de p<0,05 empleando el programa Graph-Pad Prism 4.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Dentro de las técnicas más empleadas para el análisis antioxidante se encuen₎tran los ensayos de ABTS^·+, FRAP, DPPH y más recientemente el ensayo Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) propuesto para medir la capacidad antioxidante con gran relevancia a nivel biológico, fiabilidad, repetitividad y bajo costo. Los datos presentados en este estudio demostraron que todas las muestras evaluadas poseen buenas propiedades antioxidantes y un alto potencial reductor se presentó para el extracto de acetato de etilo de la especie P. subpedale. Los rendimientos de la extracción provenientes de las dos diferentes especies de Pperjuntos con las mediciones por triplicado y los resultados expresados como la media ± desviación estándar de TEAC μMol Trolox/ g de extracto para ABTS^·+, DPPH y los valores en mg ácido ascórbico(a.a) / 100 gr muestra de FRAP se presentan en el cuadro 1.

Los porcentajes de material extraíble para cada planta con los diferentes solventes mostraron rendimientos máximos de extracción en porcentaje en peso con respecto al material vegetal seco en el extracto de diclorometano de P. subpedale 5,41% y en el extracto de metanol de P. piedecuestanum 3,58%. Ninguna asociación se encontró entre los rendimientos de extracción y las pruebas actividad antioxidante que se realizaron.

Las muestras con valores de TEAC en el ensayo ABTS*+ muestran que hay una diferencia estadísticamente significativa entre los extractos de ambas especies (Fig 1A). Los extractos que presentaron mayor actividad para esta prueba fueron los de acetato de etilo y metanol de P. subpedale con valores de PSExtA (2676 ± 134) y PSExtM (3250 ±162) seguido del extracto de acetato de etilo de P. piedecuestanum con un valor de PPExtA (1417 ±71). Para el ensayo de DPPH, los valores de TEAC muestran diferencias estadísticamente significativa entre los extractos de ambas especies (Fig 1B). El extracto de acetato de etilo para esta prueba presentó un alto y promisorio potencial reductor para P. subpedale PSExtA (1432,5± 72) seguido del extracto de diclorometano de P. piedecuestanum PPExtD (825,7± 41). Estudios con otras especies del mismo género reportaron el potencial antioxidante por diferentes métodos, donde se evalúa la habilidad reductora mediante ensayos _td e actividad atrapadora del radical DPPH de los extractos etanólicos de las hojas de Piper betel (Rathee et al., 2006) y de los extractos de acetato de etilo de las hojas de P. arboreum y P. tuberculatum (Regasini, 2008). Igualmente en el ensayo FRAP, hay diferencia estadísticamente significativa entre todos los extractos de ambas especies (Fig 1C). Los mejores valores los presentó el extracto de acetato de etilo de P. subpedale PSExtA (448675,1± 22434) y el extracto de diclorometano de P. piedecuestanum PPExtD (343918,8± 17196).

Las propiedades antioxidantes más significativas con altos valores en todas las técnicas evaluadas, las presentó P. subpedale asociada principalmente al extracto de acetato de etilo en los ensayos de ABTS^·+, DPPH y FRAP, por lo que los compuestos antioxidantes presentes en este extracto de polaridad media o de naturaleza polar, tienen una alta capacidad reductora y posiblemente se deba a compuestos fenólicos como flavonoides y flavonas reportadas en estudios previos de otras especies de Piper. Este extracto fue el seleccionado para el análisis por el ensayo ORAC y presentó valores de TEAC a lppm =2195.91 |imol Tx/g de extracto. Según estos resultados, se recomienda explorar las características estructurales de los compuestos presentes en el extracto de acetato de etilo de la planta P. subpedale, mediante un fraccionamiento bioguiado por cromatografía para aislar y purificar metabolitos que tengan una promisoria actividad antioxidante y que se puedan explorar con más profundidad en modelos in vivo para un mayor entendimiento del potencial reductor de esta planta, dado que los métodos para medir la actividad antioxidante tienen en cuenta aspectos como: intervención de mecanismos, atrapamiento de radicales libres, descomposición catalítica, supresión prooxidante, porcentaje de atrapamiento y concentración efectiva (moles de radicales libres atrapados por mol de antioxidante).

 

CONCLUSIÓN

El presente estudio confirmó las actividades antioxidantes de los extractos de Piper piedecuestanum TREL. & YUNCK. y Piper subpedale TREL. & YUNCK, por diferentes metodologías ABTS'+, DPPH, FRAP y ORAC. Estas actividades respaldan, al menos que para la especie Piper subpedale TREL. & YUNCK, futuros estudios en el desarrollo y descubrimiento de nuevas sustancias antioxidantes naturales.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero brindado por el Ministerio de Agricultura de Colombia proyecto (No. 009-2007-V7552-38-07), a la Universidad de Antioquia y a la universidad Nacional sede Medellín.

 

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