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Veterinaria México

versão impressa ISSN 0301-5092

Vet. Méx vol.43 no.2 México Abr./Jun. 2012

 

Artículos científicos

 

Resistencia a antimicrobianos en cepas de Mannheimia haemolytica aisladas de exudado nasal de bovinos productores de leche

 

Antimicrobial resistance in Mannheimia haemolytica strains isolated from dairy cattle nasal exúdate

 

María Luisa Samaniego B.* José Luis Contreras J.* Carlos J. Jaramillo–Arango** Francisco Aguilar–Romero*** Jesús Vázquez Navarrete*** Rigoberto Hernández–Castro† Francisco Suárez–Güemes F.‡ Francisco Trigo Tavera*

 

* Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

** Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Animal en Altiplano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, km 8.5, Carretera Tequisquiapan–Ezequiel Montes, Tequisquiapan, Querétaro, México.

*** Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas y Pecuarias, CENID–Microbiología, km 15.5, Carretera México–Toluca, 05110, Cuajimalpa, DF. †Dirección de Investigación, Hospital General "Dr. Manuel Gea González", Secretaría de Salud, Av. Calzada de Tlalpan 4800, col. Sector XVI, 14080, México, DF.

† Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

‡ Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, DF.

 

Responsable de correspondencia:
Carlos Julio Jaramillo Arango, correo electrónico: jaramillo50@yahoo.com.mx

 

Recibido el 24 de marzo de 2011
aceptado el 30 de septiembre de 2011

 

Abstract

Two hundred and one strains of M. haemolytica isolated from nasal exudate of dairy cattle were used, 123 strains from clinically healthy (CH) bovines and 78 from clinically ill (CI) bovines affected by pneumonia, obtained from a dairy complex in the Tizayuca region of the state of Hidalgo, Mexico. Strains were previously identified by conventional culture and biochemical tests, and serotyped by indirect haemagglutination. Disk diffusion test was performed to determine antimicrobial resistance to antibiotics, such as: ampicillin, gentamicin, ceftiofiur, penicillin, streptomycin, trimethoprim–sulfamethoxazole, tetracycline and erythromycin. Frequencies of higher antimicrobial resistance were: streptomycin (81.6%) and gentamicin (24.4%), all strains were susceptible to ampicillin and penicillin. Because of the high resistant strain frequency (81.6%) of M. haemolytica to streptomycin, obtained by Kirby–Bauer test, presence of the strA gene, which encodes the enzyme aminoglycoside–3–phosphotransferase that provides resistance to streptomycin, PCR was performed by testing the presence of the strA gene. Of the 201 strains tested, 42.7% showed the gene sfrA, 17.4% of which was serotype A1, 1.4% serotype A6 and 23.8% non–typeable strains. Of the 78 CI strains and 123 CH strains, 80% and 18.7%, had the gene sfrA, respectively.

Key words: Mannheimia haemolytica, resistance, antimicrobial, antibiogram, nasal exudate, cattle.

 

Resumen

Se emplearon 201 cepas de Mannheimia haemolytica provenientes de muestras de exudado nasal de bovinos productores de leche, 123 de bovinos clínicamente sanos (CS) y 78 de bovinos enfermos de neumonía (CE), obtenidas de un complejo lechero en la región de Tizayuca, Hidalgo, México, las cuales fueron identificadas previamente mediante pruebas convencionales de cultivo y bioquímicas, y serotipificadas mediante la prueba de hemaglutinación indirecta. Se les realizó la prueba de difusión en placa para determinar la resistencia a diversos antimicrobianos como ampicilina, gentamicina, ceftiofiur, penicilina, estreptomicina, trimetoprim con sulfametoxazol, tetraciclina y eritromicina. Las frecuencias más altas en la resistencia a antimicrobianos se presentaron a la estreptomicina (81.6%) y gentamicina (24.4%), todas las cepas fueron susceptibles a la ampicilina y penicilina. Debido a la alta frecuencia (81.6%) de cepas de M. haemolyfica resistentes a St con la técnica de Kirby–Bauer, se buscó la presencia del gen sfrA. Se realizó la técnica de PCR para comprobar la presencia del gen sfrA que codifica para la enzima aminoglycoside–3–phosphofransferase que proporciona resistencia contra la estreptomicina. Del total de cepas estudiadas (n = 201), 42.7% presentaron el gen sfrA, del cual 17.4% pertenecía al serotipo A1, 1.4% al A6 y 23.8% a cepas no tipificables. De las 78 cepas de CE y las 123 de CS, 80.0% y 18.7% respectivamente, presentaron el gen sfrA.

Palabras clave: Mannheimia haemolytica, resistencia, antimicrobianos, antibiograma, exudado nasal, bovinos.

 

Introducción

Mannheimia haemolytica es un patógeno oportunista del aparato respiratorio alto, se aisla con frecuencia tanto en bovinos clínicamente enfermos de neumonía como en bovinos sanos, y forma parte del complejo respiratorio bovino al interactuar con otras bacterias, virus y factores estresantes. Dentro de los agentes infecciosos involucrados se encuentran los virus del herpes tipo 1, el respiratorio sincitial bovino, de parainfluenza 3 y de la diarrea viral bovina; y, las bacterias Histophilus somni, Mycoplasma bovis, Arcanobacterium pyogenes y Pasteurella multocida.1'2 M. haemolytica es un cocobacilo gramnegativo, no móvil, y débilmente hemolitico, posee factores de virulencia tales como: adhesinas, lipopolisacárido (LPS), cápsula, proteínas y lipoproteinas de la membrana externa (OMP), leucotoxina (Lkt), glicoproteasa, neuraminidasa y diversas proteasas.3–6

Actualmente existen 12 serotipos de M. haemolytica (A1, A2, A5, A6, A7, A8, A9, A12, A13, A14, A16 y A17), de los cuales, en bovinos predominan los serotipos A1 y A6, que producen "fiebre de embarque" cuando se asocian con otras bacterias, virus y factores estresantes antes mencionados.7–9 El tratamiento en el complejo respiratorio es difícil, ya que debe ir enfocado a combatir las diferentes causas de la enfermedad; sin embargo, la terapia de antimicrobianos es el método que se utiliza con más frecuencia. Además, en la mayoría de los casos de neumonía se comienza con un tratamiento antes de tomar y enviar muestras a un laboratorio de diagnóstico donde se pueda guiar al médico veterinario acerca de cuál es el antimicrobiano más eficaz, al administrar un tratamiento erróneo no se garantiza la eliminación del patógeno deseado, lo que trae como consecuencia un incremento en la resistencia a antimicrobianos en cepas de M. haemolytica y otros microorganismos.1011

El objetivo del presente trabajo fue determinar la resistencia a diferentes quimioterapéuticos mediante el método de difusión en agar, y una vez identificado el quimioterapéutico con mayor resistencia, determinar la presencia del gen responsable de dicha resistencia mediante la técnica del PCR.

 

Material y métodos

Cepas

Se emplearon 201 cepas de M. haemolytica, las cuales se identificaron previamente mediante pruebas convencionales de cultivo y bioquímicas, así como por el micrométodo de identificación API 20E,I y los serotipos mediante hemaglutinación indirecta. De estas cepas, 55 pertenecían al serotipo 1, 9 al serotipo 6 y 137 no fueron tipificables mediante esta prueba. Las cepas se aislaron de muestras de exudado nasal de bovinos clínicamente sanos (n = 78) y enfermos de neumonía (n = 123), en establos del Complejo Agropecuario Industrial de Tizayuca (CAIT), Tizayuca, Hidalgo.9

Determinación de la susceptibilidad a quimioterapéuticos

Las cepas se sembraron en agar sangre de ovino y se incubaron a 37°C por 24 h. Posteriormente, una colonia fue inoculada en 10 ml de caldo infusión cerebro–corazón. De acuerdo con el método descrito por Kirby–Bauer,12,13 el crecimiento se supervisó cada hora mediante determinación de densidad óptica OD600 (aproximadamente 108 UFC/ml). Se utilizaron sensi–discos de ampicilina (Am) 10 µg, gentamicina (Gm) 10 µg, eritromicina (E) 15 µg, penicilina (P) 10 UI, estreptomicina (St) 15 µg, trimetoprim con sulfametoxasol (SXT) 1.25 µg y 23.75 µg, tetraciclina (TE) 30 µg, ceftofiur (XNL) 30 µg,II se colocaron sobre la superficie de la placa y se incubaron en posición invertida a 37°C durante 18–24 h. La interpretación de los halos de inhibición se realizó con los valores de acuerdo al National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) en resistente (R) y sensible (S).14

Extracción de ADN cromosomal

El cultivo de M. haemolytica se realizó en 10 ml de caldo infusión cerebro corazón y se centrifugó a 8000 g, la pastilla bacteriana se colocó en un tubo de 1.5 ml. Posteriormente, se agregaron 550 µg de solución de lisis (tiocianato de guanidina 5 M, EDTA 0.1 M, Sarcosil 0.5%), se mezcló durante 10 min y se adicionaron 250 µg de acetato de amonio 7.5 M, se colocó en hielo por 10 min, se agregaron 500 µg de cloroformo–alcohol isoamílico 25:1 v/v, se mezcló y se centrifugó a 6000 g. El sobrenadante se precipitó con 0.7 de volumen de isopropanol, se centrifugó a 6000 g y se desechó el sobrenadante. Se le adicionaron 200 µg etanol al 100%, se mezcló y se centrifugó a 6000 g durante 15 min y se decantó; se dejo secar, y la pastilla de ADN se resus–pendió en 100 µg de agua estéril y se almacenó a 4°C hasta su uso. Para determinar la calidad del ADN, se visualizó en un gel de agarosa al 1%. Para medir su concentración se utilizó un espectrofotómetro de luz UV a una absorbancia de 260.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Debido a que la estreptomicina fue el antimicrobiano para el cual presentó resistencia un mayor porcentaje (81.6%) de cepas de M. haemolytica, se realizó la PCR para determinar la presencia del gen strA. Para cada muestra se mezclaron 10 pl de PCR Master Mix,III 6.8 pl de H2O, 0.6 pl de los iniciadores str1 (5'–TGA–CTGGTTGCCTGTCAGAGG–3') y str2 (5'–CCAGTT–GTCTTCGGCGTTAGC–3') y 2 µg de ADN, que representan 100 ng; las condiciones de la PCR fueron las siguientes: una desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguido de 35 ciclos, de 94°C por 1 min cada uno, alineamiento de 56°C durante 1 min y 1 min a 72°C, seguidos por la extensión final de 72°C durante 7 min. El producto de amplificación, de 646 pb, se visualizó en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron mediante estadística descriptiva empleando, además, la prueba de Ji cuadrada o Fisher, según características de los datos, para evaluar las diferencias entre las frecuencias de las cepas sensibles o resistentes a los diferentes antimicrobianos. El análisis estadístico se realizó con el programa EPI–Info versión 3.3.2 para Windows.IV

 

Resultados

Con la técnica de Kirby–Bauer se observaron cepas con resistencia a quimioterapéuticos como XNL, E, GM, St, SX y TE con frecuencias variables; la St presentó una mayor frecuencia (81.6%) seguida de la GM (24.4%) tanto en los CE como en los CS (Cuadro 1).

Todas las cepas fueron sensibles a la P y la Am. Las diferencias entre las frecuencias de resistentes y sensibles, entre los CE y CS, no fueron significativas (P ≥ 0.05).

En el Cuadro 2 se muestra la frecuencia de las cepas de M. haemolytica que presentaron resistencia a quimioterapéuticos de acuerdo con su serotipo. Destaca una alta frecuencia de cepas de M. haemolytica resistentes a St, entre las cepas NT (86.9%) y las A1 (74.5%). Las diferencias entre las frecuencias de resistentes y sensibles (A1, A6 y NT), fueron significativas (P = 0.001).

Debido a la alta frecuencia (81.6%) de cepas de M. haemolytica resistentes a St con la técnica de Kirby–Bauer, se buscó la presencia del gen strA. En un 42.8% de las 201 cepas estudiadas, se logró amplificar un fragmento de 646 pb aproximadamente (Figura 1).

El Cuadro 3 muestra que entre las cepas R, el mayor porcentaje con presencia del gen fue NT (26.8%), seguido del serotipo A1 (14%). La mayoría de las cepas sensibles que mostraron el gen (32.4%) eran A1. En general, el gen se presentó más entre las cepas NT (23.8%), seguidas del serotipo A1 (17.4%). Al evaluar las frecuencias de cepas A1, A6 y NT con presencia o ausencia del gen, las diferencias fueron significativas (P ≤ 0.05). Sin embargo, en las cepas R, de serotipos A1, A6 y NT, con presencia o ausencia del gen, no resultaron significativas.

Entre las cepas R sólo 29.3% procedían de animales CE y 12.8% de los CS presentaron el gen. Entre las cepas susceptibles, 40.6% de las que mostraron el gen eran de CE y apenas 5.4% eran de CS. En general, el gen se presentó con mayor frecuencia entre las cepas de animales CE (31.3%) que entre las de CS (11.4%). Llama la atención que en los animales CE el gen se presentó con mayor frecuencia (40.6%) en las cepas sensibles. Al evaluar las diferencias entre las frecuencias de la presencia o ausencia del gen, entre las cepas de CE y CS, y entre R y S, resultaron significativas (P ≤ 0.05).

En el Cuadro 4 se observa una mayor frecuencia de cepas de M. haemolytica con el gen strA en aquéllas provenientes de animales CE (80.8%), y de éstas, 55.1% correspondían a NT; de las cepas provenientes de animales CS, la mayor frecuencia se presentó en el serotipo A1 (13.82%). Las diferencias entre la presencia o ausencia del gen en las cepas de animales CS y CE, fueron significativas (P ≤ 0.05). En las cepas A1, A6 y NT, con presencia o ausencia del gen, resultaron significativas las diferencias de frecuencias sólo cuando provenían de animales CS (P ≤ 0.05); no fueron significativas entre las frecuencias de los CE (P ≥ 0.05).

 

Discusión

En algunos países se han realizado estudios sobre la resistencia antimicrobiana en cepas de M. haemolytica, utilizando técnicas de difusión en placa y dilución. En México, Salas et al.,15 encontraron que el 100% de los aislamientos de este patógeno, obtenidos de pulmones neumónicos de becerros, fueron resistentes a la P y la Am, lo cual contrasta con los resultados de este estudio, en el cual, el 100% de los aislamientos fueron sensibles a dichos quimioterapéuticos; posiblemente la renovación del pie de cría que se dio en los últimos años en el CAIT, aunado a la reducción de la P, y particularmente de la Am, en la terapia de la mannheimiosis,V generaran una disminución tan dramática en los porcentajes de resistencia que nosotros observamos. De manera similar, Pijoan y Aguilar Romero,10 informaron una frecuencia alta (mayor al 80%) en resistencia a St, lo cual coincide con lo encontrado en este estudio.

Varios estudios han demostrado que el serotipo A1 de M. haemolytica es el más frecuente en los aislamientos en los casos de pasteurelosis; sin embargo, cabe destacar que las cepas que presentaron la mayor frecuencia (86.9%) en la resistencia a St fueron NT.16,17

En la estructura genética de resistencia antimicrobiana de M. haemolytica los plásmidos desempeñan un papel primordial; si bien la existencia de plásmidos no es un fenómeno característico de todas las especies de Mannheimia, en M. haemolytica se ha demostrado la existencia de plásmidos de resistencia a quimioterapéuticos.3 Se han encontrado genes resistentes a algunos antimicrobianos como kanamicina, tetraciclinas, P–lactámicos o aminoglicósidos en plásmidos que varían de 4.2 a 16.7 kb. Entre los genes más frecuentes en Mh se encuentran el de resistencia a sulfonamidas (sulII) y el de resistencia a estreptomicina (strA); este último se ha encontrado tanto en plásmidos como en el cromosoma.3,18

En el presente trabajo, 42.8% de las cepas presentaron el gen strA, de las cuales, 17 (19.8%) cepas de M. haemolytica fueron sensibles a la estreptomicina en la prueba de Kirby–Bauer; es posible que dicho fenómeno pudiera relacionarse con la expresión del gen, es decir, que se requieren otros factores para que las cepas puedan expresar el gen strA, como lo mencionan Lo et al.,19 quienes afirman que se requiere de factores de crecimiento in vivo, como el proceso de infección, para llevar a cabo la expresión de sus genes.

El 57.9% de las cepas de M. haemolytica que resultaron resistentes a la St en la prueba de difusión en placa no presentaron el gen strA bajo las condiciones en las que se probaron, lo que sugiere que M. haemolytica podría tener otros mecanismos para desarrollar resistencia a la St; de hecho, no todos los plásmidos que se han encontrado en M. haemolytica están asociados con resistencia a antimicrobianos; paradójicamente se encontró resistencia en ausencia de plásmidos y algunos de ellos fueron correlacionados con la leucotoxina u otros factores de virulencia.3 También se ha informado que M. haemolytica posee un plásmido denominado pYFC1, el cual contiene un grupo de genes que le proporcionan resistencia a diferentes antibióticos; sin embargo, el gen strB, que de igual manera le otorga resistencia contra la St, no es funcional; es posible que dichas cepas no posean el plásmido, pero que sí posean el gen strB funcional en su ADN cromosómico, que codifica a la enzima aminoglycoside–6–phosphotransferase.20

Gioia et al.,21 mencionan que M. haemolytica posee genes denominados AcrAB y AcrR que codifican para bombas de eflujo, las cuales le confieren un mecanismo de bombeo del interior al exterior de los quimioterapéuticos, además de una posible familia de transportadores de multirresistencia a antibióticos (MarC), lo cual favorecería la resistencia de este patógeno a los quimioterapéuticos, además del gen strA.

Fue relevante observar que 80.8% de las cepas de los CE presentaron el gen y en las cepas de los CS sólo 18.7% lo presentaron, de los cuales 13.8% correspondía al serotipo A1, lo cual sugiere que la presencia del gen strA está asociada con la enfermedad de los animales, y una vez enfermos no depende del serotipo. Probablemente ello suceda por la transferencia de ADN plasmídico mediante conjugación, donde la bacteria donante, por contacto celular, transfiere los genes de resistencia a aquélla que no los posee, una vez que los animales se encuentran enfermos.22,23 Adicionalmente, hay que tener en cuenta que dicho gen se encuentra tanto en plásmidos como en el cromosoma de M. hemolítica3,18 lo cual, aunado a la presión de selección causada por la resistencia originada por el uso inadecuado de quimioterapéuticos, puede derivar en una resistencia múltiple, esta resistencia transmisible mediada por plásmidos puede propiciar la resistencia horizontal intraespecies, interespecies o intergénero.

Asimismo, hay que considerar que M. haemolytica es un habitante normal del aparato respiratorio alto del bovino1,2 y que el empleo indebido de los quimioterapéuticos en prácticas de profilaxis, metafilaxis o como promotores del crecimiento, han propiciado que en el caso de dicha bacteria se haya desarrollado resistencia a un gran número de antimicrobianos. Ahora bien, dentro de un sistema biológico, no todas las becerras responden de manera similar a la misma terapia, lo típico es que la mayoría de las becerras respondan bien ante un tratamiento antimicrobiano que se administre de manera oportuna y por un periodo adecuado; sin embargo, dentro de ese sistema biológico siempre habrán casos extremos y dentro de una población de becerras puede haber un porcentaje que no responden bien al tratamiento debido a un pobre funcionamiento de su sistema inmune.24,25

De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede concluir que no obstante que la mayoría de las cepas aisladas en el CAIT fueron resistentes a la St, sólo en una parte de ellas se confirmó la presencia del gen strA; de igual manera, todas fueron sensibles a la P y la Am. Por lo anterior, es necesario realizar estudios para identificar el mecanismo por el cual las cepas que no presentaron el gen strA fueron resistentes a la St.

 

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el CONACyT (Proyecto G38590–B). Se agradece a los ganaderos y a la Coordinación de Servicios Médicos Veterinarios de la Cuenca Lechera de Tizayuca, Hidalgo, así como al CENID–Microbiología del INIFAP y al Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, por el apoyo y las facilidades otorgadas para la realización de este trabajo.

 

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Notas

I Biomerieux, Durham, NC, Estados Unidos de América.

II Becton, Dickinson, Minessota, Estados Unidos de América.

III QIAGEN, Ventura, CA, Estados Unidos de América.

IV Centers for Diseases, Control and Prevention (CDC), Atlanta, Estados Unidos de América, 2004.

V Comunicación personal: MVZ. Rafael Soto Castor, 2011.