Notas de Investigación

 

Excreción fecal de Salmonella Albany, su aislamiento en la ración alimenticia y repercusión en el estado de salud de un ocelote (Leopardus pardalis) en cautiverio

 

Fecal excretion of Salmonella Albany, its isolation in the diet and health repercussion on an ocelot (Leopardus pardalis) in captivity

 

Gabriela Silva-Hidalgo*^,† Héctor Samuel López-Moreno*^,** Vianney F. Ortiz-Navarrete*** Felipe Juárez-Barranco^† Martín López-Valenzuela^†

 

* Programa Regional del Noroeste, Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, 80040, Culiacán, Sinaloa, México. Tel./Fax: 01 (667) 713-66-15, correo electrónicogaby@uas.uasnet.mx.

** Laboratorio de Biomedicina Molecular, Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, 80040, Culiacán, Sinaloa, México, Tel./Fax: 01 (667) 713-66-15.

*** Departamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (Cinvestav), Instituto Politécnico Nacional, Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, col. San Pedro Zacatenco, 07360, México, DF. Tel.: (01) (55) 50 61 38 00, ext. 5001, Fax: 50 61 39 38.

† Laboratorio de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Sinaloa, Boulevard San Ángel s/n, Fracc. San Benito, 80246, Culiacán, Sinaloa, México, Tel./Fax: 01 (667) 718-16-50.

 

Recibido el 26 de enero de 2011
Aceptado el 20 de septiembre de 2011

 

Abstract

Salmonella enterica serotypes are 99% responsible for salmonellosis in human and animals, especially Salmonella enterica serovar Albany that has been identified in chicken carcass representing a risk for human and animal health. Salmonella enterica serovar Albany was isolated from the feces of a male ocelot (Leopardus pardalis), at the zoo in Culiacan, Sinaloa, Mexico, and from raw chicken (feline's diet). The pulsed-field gel electrophoresis pattern (PFGE) generated by Xba I enzyme was identical in both isolates, indicating that the source of infection was the raw chicken. Five months after having isolated the bacteria from the feces, a post mortem study was carried out on the feline. Macroscopically, severe hemorrhagic enterocolitis and renal fibrosis was observed and microscopically, there was evidence of severe mononuclear lymphocytic infiltration in the ileum, as well as necrosis of intestinal villi and crypts, besides severe multifocal interstitial nephritis and fibrosis in both kidneys. The invA gene was amplified from intestinal samples confirming an infection by Salmonella. The microbiologic, molecular and histopathology diagnoses suggest that death of the feline was caused by ingestion of raw chicken contaminated with Salmonella enterica serovar Albany. This clinical case highlights the importance of persistent fecal Salmonella shedding animals and describes the molecular epidemiological relationships of isolates from feces and food, which allowed to find the primary source of infection.

Key words: salmonellosis, fecal excretion, raw chicken, ocelot.

 

Resumen

Los serotipos de Salmonella especie enterica son los responsables del 99% de las salmonelosis en humanos y animales, en particular, Salmonella enterica serovariedad Albany se ha identificado en canales de pollo, por lo que representa un riesgo para la salud humana y animal. Se aisló Salmonella enterica serovariedad Albany a partir de heces de un ocelote macho (Leopardus pardalis), cautivo en el zoológico de Culiacán, Sinaloa, México, y de pollo crudo (alimento del felino). El patrón por electroforesis en campo pulsado (PFGE) con la enzima Xba I fue idéntico en ambos aislados, lo que indica que la fuente de infección fue el pollo crudo. Cinco meses después de haber aislado las bacterias de las heces, se realizó estudio post mortem del felino anteriormente mencionado, y se observó macroscópicamente: enterocolitis hemorrágica severa y fibrosis renal; y microscópicamente: necrosis de vellosidades y de criptas e infiltrado mononuclear linfocitario severo en íleon, además nefritis intersticial severa multifocal y fibrosis en riñón. A partir de muestras intestinales se amplificó el gen invA que confirma la infección por Salmonella. Los diagnósticos microbiológico, molecular e histopatológico sugieren que la muerte del felino se debió a la infección causada por la ingesta de pollo crudo contaminado con Salmonella enterica serovariedad Albany. Este caso clínico confirma la importancia que tienen los animales que excretan Salmonella vía fecal y describe la relación epidemiológica-molecular de los aislamientos obtenidos de heces y alimento, lo que permitió esclarecer la fuente primaria de infección.

Palabras clave: salmonelosis, excreción fecal, pollo crudo, ocelote.

 

Introducción

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, son bacilos gram negativos que no forman esporas,¹ y consta sólo de dos especies, Salmonella bongori y Salmonella enterica, y de seis subspecies. A los serotipos de la especie enterica se les atribuyen 99% de las salmonelosis en seres humanos y animales,² y se le reconocen aproximadamente 2500 serotipos, clasificados por los azúcares que constituyen su pared bacteriana, o bien por las proteínas de membrana o flagelares.³ Algunos de los serotipos de Salmonella son hospedero-específicos, como es el caso de Salmonella enterica serovariedad Typhi (Salmonella Typhi), que únicamente infecta al ser humano y ocasiona fiebre tifoidea. Sin embargo, algunos otros serotipos pueden infectar a muchas especies animales, incluyendo al hombre, por ejemplo Salmonella enterica serovariedad Typhimurium (Salmonella Typhimurium) que únicamente ocasiona gastroenteritis, o Salmonella enterica serovariedad Albany (Salmonella Albany). La habilidad para causar enfermedad en hospederos no específicos depende de la adaptación bacteriana con su entorno ambiental,⁴ gracias a ello algunos serotipos sobreviven en agua, alimentos, y cuando son ingeridos por seres humanos o animales, pueden causar trastornos gastrointestinales de evolución de leve a grave, o infecciones sistémicas como es el caso de la fiebre tifoidea.⁵

Poco se sabe del papel que juegan los animales silvestres en cautiverio como reservorios de Salmonella. Algunos autores han asociado dicho género en la morbilidad y mortalidad de animales de zoológico, la probable fuente de infección para estos animales son las frutas y alimentos contaminados por roedores y pequeñas aves nativas que tienen acceso a los albergues.⁶ Cubas encontró que era común la excreción de Salmonella en heces de aves y primates de zoológicos de Sudamérica y que éstos no presentaban sintomatología clínica.⁷ Orós et al.⁸⁸ aislaron Salmonella arizonae a partir de lesiones digestivas y respiratorias en serpientes. Por lo que respecta a felinos silvestres, se ha logrado aislar Salmonella tanto de heces como de alimento (carne cruda); sin embargo, las serovariedades encontradas corresponden a Typhimurium, Muenchen, Uganda, Newport, entre otras, a excepción de la serovariedad Albany.^9-11 Cabe mencionar que los felinos, por su condición carnívora, presentan un alto riesgo de desarrollar salmonelosis. Clyde et al. aislaron Salmonella de las heces de felinos exóticos alimentados con carne cruda, incluso se ha logrado disminuir la excreción del patógeno con la modificación del tipo de dieta en estos animales.^10,11

Salmonella Albany es una serovariedad raramente aislada de procesos infecciosos; sin embargo, se ha identificado en canales de pollo, por lo que representa un riesgo potencial para la salud humana y animal.¹² La Salmonella¹³ es la primordial fuente de toxicoinfección alimentaria en productos cárnicos, principalmente los de origen aviar. En pollos congelados de exportación destinados para consumo humano en Tailandia¹⁴ y en rastros de aves tanto en canales como en utensilios y diferentes áreas de trabajo en rastros de Brasil,¹⁵ se aisló Salmonella Albany, y resultó ser la segunda serovariedad más prevalente aislada de granjas avícolas en Argelia.¹⁶ Las aves para consumo humano y sus productos constituyen una proporción significativa de las fuentes implicadas en brotes alimentarios de Salmonella.^17-19 La contaminación de estos productos, es un indicador de la falta de higiene durante la etapa de procesamiento del alimento o bien en varias etapas de la cadena de distribución y refrigeración de la carne, lo que permite la multiplicación de Salmonella.²⁰

En el presente trabajo se demuestra el aislamiento de Salmonella Albany a partir de heces de un ocelote y de la carne de pollo cruda que se utilizaba como alimento, lo que sugiere que la enfermedad gastroentérica severa que padeció el felino se debió a la infección por Salmonella Albany.

Descripción del caso

Con la finalidad de identificar animales excretores de Salmonella durante 2008, se recolectaron heces del albergue de un ocelote macho (Leopardus pardalis) de 10 años de edad, cautivo en el zoológico de Culiacán, Sinaloa, México. Se tomaron dos muestras, la primera en enero y la segunda en mayo. Asimismo, también se recolectaron muestras del alimento ofrecido al ocelote, pollo crudo proveniente de una planta procesadora. En octubre del mismo año, se aplicó el programa de medicina preventiva, que somete a estrés a los animales por el manejo que se les impone, y que coincidió con la siguiente historia clínica de dos semanas de evolución en el ocelote: melena, anorexia, vómito, letargia y deshidratación. Durante ese tiempo se medicó al animal con sulfamonometoxina-trimetoprim vía oral* e intramuscular,** sospechando coccidiosis intestinal. Ese mismo mes de octubre se remitió al felino antes referido al Laboratorio de Patología de la Universidad Autónoma de Sinaloa para estudio de necropsia, después de 10 a 12 horas de muerto, lo que pudo constatarse por la pérdida de rigor mortis en miembros posteriores y anteriores, y rigidez cadavérica en cuello y cabeza.

Técnicas diagnósticas utilizadas en muestras de heces y pollo crudo

Aislamiento bacteriano. Los medios de cultivo utilizados para aislamiento bacteriano fueron: caldo tetrationato*** (incubación por 48 horas), medio semisólido Rappaport Vassiliadis* (incubación por 24 horas), Agar XLT₄**** (incubación por 24 horas). En cada una de las técnicas bacteriológicas utilizadas durante el desarrollo de este caso clínico, se utilizó como testigo la cepa de referencia Salmonella Typhimurium (ATCC 14028 S).

Confirmación bioquímica y serotipificación. Las colonias bacterianas aisladas se sometieron a un análisis bioquímico confirmatorio. Las pruebas bioquímicas utilizadas fueron: caldo sorbitol, caldo mucato, medio motilidad-indol-ornitina (MIO), agar triple azúcar- hierro (TSI), agar lisina-hierro (LIA), prueba de ureasa y prueba de citrato. La serotipifcación se realizó de acuerdo con el esquema de Kauffmann-White.²¹

Confirmación del género mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). El género bacteriano se confirmó mediante PCR con la amplificación del gen invA.²²

Genotipificación. La genotipificación de los aislados bacterianos se realizó mediante la digestión de la enzima de restricción Xba I y electroforesis en campo pulsado (PFGE, por sus siglas en inglés), utilizando el sistema CHEF-DR III***** a 6 V/cm durante 18 h con pulsaciones cada 10-30 segundos. Después de la electroforesis el gel se tiñó con bromuro de etidio y fue analizado en un fotodocumentador GelDoc^TM XR.*****

Técnicas diagnósticas utilizadas en el estudio post mortem

Estudio de necropsia. Se realizó la necropsia de acuerdo con la técnica descrita por Aline et al.²³ Se tomaron muestras de intestino y riñón para examen histopatológico. Las muestras se fijaron en formalina al 10%, amortiguada a pH de 7.2 para su procesamiento según la técnica estándar; se realizaron cortes de tejido en un micrótomo a un espesor de 2 a 4 μm y se tiñeron por la técnica de hematoxilina y eosina (H&E).²⁴ Para cuantificar las lesiones se consideraron los siguientes grados: grado leve cuando los cambios patológicos en los órganos en estudio abarcaron hasta 25%, grado moderado, de 25 a 50%, y grado severo, de 50 al 100% del órgano afectado.²⁵

Identificación de género por PCR en tejidos incluidos en parafina. Para la identificación del género bacteriano se utilizó un corte de 14 μm del tejido de cada bloque de parafina y se colocó en un microtubo de 0.5 µl para realizar la PCR con la amplificación del gen invA. El procedimiento de extracción de ADN, se llevó a cabo utilizando 150 μl de una solución de Chelex ®100 Resin****** al 5% y calentando a 100°C por 30 minutos. Luego se centrifugó a 25,000 g por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo de 0.5 µl estéril.²⁶

En el análisis de heces y pollo crudo, el tren de aislamiento bacteriano y amplificación del gen invA reveló la presencia de Salmonella spp. En lo referente al aislamiento se observaron en el agar XLT₄, medio de cultivo selectivo y diferencial para identificación de microorganismos del género Salmonella, colonias de tonalidad negra (H₂S positivas), confirmándose el género por medio de las pruebas bioquímicas (sorbitol-positivo, mucato-positivo, MIO- (+, -, +), TSI- K/A, LIA-K/K, ureasa-negativa y citrato-positivo). Por lo que respecta a la amplificación del gen invA, el análisis electroforético mostró un producto amplificado de 283 pb correspondiente al tamaño esperado para estos iniciadores. Se determinó la serovariedad de la cepa clasificándola como Salmonella enterica serovariedad Albany. Ambas cepas presentaron el mismo patrón electroforético después de la digestión con la enzima de restricción Xba I y con la técnica de PFGE (Figura 1).

Los hallazgos en los estudios post mortem se detallan a continuación.

Estudio de necropsia e histopatológico

Hallazgos macroscópicos. A la inspección externa, el cadáver presentó una pobre condición de masa muscular, deshidratación severa y presencia de excremento en región crural; a la inspección interna, se observó en íleon y colon la presencia de un exudado hemorrágico (enterocolitis hemorrágica severa) (Figura 2) y fibroplasia difusa en ambos riñones (fibrosis renal severa) (Figura 3).

Hallazgos microscópicos. Los principales hallazgos fueron: en íleon, necrosis de vellosidades y de criptas así como un infiltrado mononuclear linfocitario severo (Figuras 4 y 5), y en riñón, nefritis intersticial severa multifocal, fibrosis, congestión y hemorragia (Figuras 6 y 7).

PCR de tejidos incluidos en parafina. El ADN extraído de íleon amplificó el gen invA, mostrando en el análisis electroforético un producto amplificado de 283 pb correspondiente al tamaño esperado para estos iniciadores. En el caso del riñón no se logró la amplificación.

La sintomatología digestiva y las lesiones intestinales macro y microscópicas, identificadas en diferentes investigaciones de patología experimental, indican una infección sistémica por Salmonella.²⁷ En el presente estudio, los hallazgos diagnósticos, microbiológico y molecular en heces, pollo crudo e íleon, demostraron que se trató de Salmonella enterica serovariedad Albany. Es probable que el felino se haya recuperado de un episodio intestinal agudo anterior, con cierto grado de infección sistémica que permitió a la bacteria alcanzar linfonodos mesentéricos, riñón y vesícula biliar, convirtiéndose así en portador, hecho que se corrobora por los aislamientos positivos realizados antes de la muerte del ocelote.²⁶ Aunque no se tuvo evidencia molecular de presencia de Salmonella en riñón, la lesión renal macro y microscópica es compatible con dicho agente patógeno, probablemente de evolución crónica,²⁷ pues se sabe que los lipopolisacáridos (LPS) que forman parte de la membrana externa bacteriana que inducen a la muerte de células tubulares, producen lesiones que se reparan a través de fibroplasia.²⁸ De igual manera, cabe mencionar que el ejemplar durante el desarrollo del cuadro clínico, tuvo factores de riesgo asociados con la infección por Salmonella, como son la edad, época del año y el estrés.²⁹ Los animales sometidos a estrés, ya sea por transporte, manejo o bien por confinamiento, como en este caso, tienen mayor probabilidad de excretar enteropatógenos como Salmonella vía fecal,³⁰ y este hecho aumenta el riesgo de infección en otros animales del mismo albergue, o bien, de albergues contiguos.³¹ En este caso, no fue posible aislar la enterobacteria Salmonella de los linfonodos mesentéricos del ocelote; sin embargo, otros investigadores lo han logrado a partir de éstos órganos linfoides de marsupiales en cautiverio.³² Por lo que respecta al orden Carnívora, otras investigaciones han encontrado este orden como el de mayor prevalencia en excreción de Salmonella e incluso, dentro del mismo, el ocelote ha sido la especie que ha presentado la prevalencia más alta.⁶ Muchas investigaciones asocian la alimentación animal basada en carne cruda, con la excreción fecal de Salmonella, con prevalencias de excreción que varían entre 1 y 69%.³³ El inicio y la duración de excreción fecal están relacionados con la dosis infectante, tipo de exposición, serovariedad y factores del hospedero, además, la serovariedad de Salmonella presente en el excremento, podría coincidir con la serovariedad consumida en cualquier momento de la semana anterior a la excreción, o bien, con la que se encuentra en el alimento recién consumido.³⁴ El tipo de dieta influye por lo tanto, en los hallazgos de aislamientos positivos encontrados en este caso y se asocia al consumo de carne cruda contaminada con la bacteria.^11,35 Aunque Salmonella es un enteropatógeno involucrado principalmente en infecciones de tipo alimentario, hay que considerar también otras fuentes importantes de exposición a estos microorganismos, como el agua, el polvo, el contacto directo con roedores o insectos del entorno.^36-39 Es factible también que la bacteria pueda diseminarse entre los albergues, a través de las botas, ropa, o implementos de limpieza utilizados por los trabajadores por lo que será necesario considerar estos factores, para lograr minimizar la posibilidad de dispersar el agente bacteriano, no sólo en el zoológico sino en cualquier ambiente.⁴⁰ Los patrones electroforéticos observados en la PFGE, tanto de la cepa aislada de las heces del ocelote como de la aislada del alimento fueron idénticos, lo que sugiere que la fuente de infección es el pollo crudo. Actualmente, diversas investigaciones han encontrado Salmonella Albany aislada de pollos en un alto porcentaje (50%)⁴¹ y es uno de los productos animales más asociado con cuadros de enteritis, septicemia y aborto en animales, y de gastroenteritis y fiebre tifoidea en el ser humano.⁴² En este caso, dado que se logró identificar la fuente primaria de infección, es posible implementar medidas estratégicas de prevención de la infección en las demás especies carnívoras, ya que la excreción de Salmonella no tífica en este centro recreativo puede tener repercusiones clínicas y de suma importancia en la salud pública, por tratarse de un agente patógeno de índole zoonótico,⁴³ así como en las otras especies animales en cautiverio albergadas en el zoológico, que pueden comportarse como reservorios de la bacteria y portador crónico.⁴⁴

Este caso clínico destaca la importancia de la contaminación del ambiente donde se alojan animales que excretan Salmonella en heces, y más aún, cuando estos ejemplares pertenecen a colecciones exhibidas en zoológicos, como en este caso, lo que puede tener serias implicaciones en la salud pública, sobre todo en niños menores de 5 años, ancianos, mujeres embarazadas y otros individuos inmunocomprometidos que acudan a estos centros recreativos.^45,46 La relevancia de la epidemiología de la salmonelosis en los animales silvestres portadores sanos ha sido informada por Hudson et al.⁴⁷ en Estados Unidos de América y por Refsum et al.⁴⁸ en Noruega. La excreción intestinal de Salmonella por animales infectados, incluyendo aquellos que no muestran sintomatología clínica, representa un gran reto para establecer programas de sanidad ambiental, ya que a pesar de tratar con antibióticos a todos los animales infectados, las bacterias pueden ser excretadas constantemente en las heces y seguir contaminando el ambiente, a otros animales susceptibles, o bien, el agua que constituye un medio altamente favorable para la diseminación y multiplicación de las bacterias en general.⁴⁹ Siendo el alimento una de las fuentes de infección primaria involucrada en salmonelosis gastroentérica identificada por varios autores, el ofrecido a los carnívoros cautivos, debería ser sujeto a la misma inspección rigurosa a que son sometidos los alimentos para consumo humano, lo cual reduciría el riesgo de contaminación y transmisión de la enfermedad.⁵⁰ Otra alternativa de prevención, además de la antibioterapia y la inspección sanitaria del alimento, es la estimulación de la respuesta inmune a través de la inclusión en la ración alimenticia de compuestos probióticos, los cuales favorecen el rechazo de microorganismos infecciosos potencialmente lesivos, esto lo pueden realizar mediante la producción de inmunoglobulinas específicas tipo A, modulando la maduración de células dendríticas, o bien, mediante la activación de células NK.^51,52 En cuanto a la infraestructura propia del zoológico, las limitantes que favorecen el riesgo de infección son entre otras: instalaciones inadecuadas destinadas para el lavado de manos, flujo inadecuado de visitantes, zonas destinadas a la preparación y consumo de alimentos para consumo humano cercanas a las áreas de exhibición de animales y aguas residuales mal manejadas.⁵³ Será necesario conducir investigaciones epidemiológicas que sigan protocolos apropiados para el muestreo de seres humanos, animales y medio ambiente, incluyendo la subtipificación molecular de los patógenos aislados, además de que los laboratorios de salud pública estatales y nacionales informen sobre los brotes de infecciones entéricas asociadas con contacto animal.

De este trabajo se concluye que Salmonella Albany pudo ser aislada de heces y alimento, como fuente primaria de infección, y demuestra la importancia de la subtipificación por PFGE. Este comunicado describe la relación epidemiológica-molecular de los aislamientos obtenidos del parque zoológico. El peligro potencial de transmisión de salmonelosis no tífica entre los visitantes o bien entre los trabajadores de este centro recreativo no debe ser subestimado, por ello, es urgente implementar sistemas de vigilancia de enfermedades en animales y personas, ya que se desconoce si las afecciones de tipo diarreico que se presentan en los seres humanos tienen correspondencia genómica con las serovariedades responsables de los trastornos en animales. Será necesario continuar con estudios más amplios para estar en posibilidades de esclarecer el comportamiento bacteriano de esta serovariedad y prevenir brotes potenciales en la población humana de Sinaloa.

 

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Notas

Nota: Este trabajo forma parte de la tesis doctoral del primer autor.

*Daimetroprim, México.

**Daimeton B20/T, México.

***Merck, Alemania.

****Difco, Estados Unidos de América.

*****Bio-Rad, Estados Unidos de América.

******Bio-Rad, Estados Unidos de América.