Artículos científicos

 

Expresión de citocinas en cerdos co-infectados con circovirus porcino tipo 2 y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

 

Cytokine expression in growing pigs co-infected with porcine circovirus type 2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus

 

Mónica Reséndiz* Maricela Montalvo-Corral* Lilian Flores-Mendoza* Humberto Ramírez-Mendoza** Joaquim Segalés*** Jesús Hernández*

 

* Laboratorio de Inmunología, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., km 0.6, Carretera a la Victoria, 83000, Hermosillo, Sonora, México, apartado postal 1735, Tel.: (01-662) 289-2400, ext.: 294, fax: (01-662) 280-0094.

** Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria, 04510, México, DF.

*** Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA)-Department de Sanitat i d'Anatomia Animals, Facultat de Veterinaria, Universitat Autónoma de Barcelona, Bellaterra 08193, Barcelona, España.

 

Responsable de correspondencia:
Jesús Hernández,
correo electrónico: jhdez@ciad.mx

 

Recibido el 9 de noviembre de 2010
Aceptado el 30 de agosto de 2011

 

Abstract

The aim of this work was to quantify porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), as well as cytokine mRNA expression (IL-6, IL-12, TNF-α, and IFN-γ) in superficial inguinal lymph nodes (SILN) of pigs from postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and healthy farms. Genetic characterization of detected PCV2 sequences was also carried out. Based on the clinical outcome and the quantification of PCV2 nucleic acid by in situ hybridization and real time PCR, pigs were grouped into three categories: 1) PMWS, pigs with signs of wasting and high viral load in SILN (n = 4); 2) wasted-non-PMWS, pigs with signs of wasting and low to intermediate viral loads in SILN (n = 3); and 3) healthy, pigs with no clinical signs and low viral loads (n = 3). PRRSV was detected in three PMWS affected and two-wasted-non-PMWS pigs. The genetic analysis of PCV2 sequences revealed the presence of two genotypes PCV2a and PCV2b in PMWS-affected farms. Cytokine mRNA expression revealed that PMWS affected pigs had low expression of IFN-γ, whereas wasted-non-PMWS pigs showed higher amounts of IFN-γ. These results suggest that an imbalance in cytokines could be involved in the pathogenesis of PMWS.

Key words: PMWS, PRRSV, PCV2, IFN-Gamma, lymph nodes.

 

Resumen

Los objetivos de este trabajo fueron la cuantificación de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) de virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), así como la expresión de citocinas (IL-6, IL-12, TNF-α, e IFN-γ) en nódulos linfáticos inguinales superficiales (NLIS) de cerdos afectados por el síndrome de desmedro posdestete (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) y en cerdos sanos. Con base en el diagnóstico clínico y a la cuantificación de PCV2 por hibridación in situ y qRT-PCR, los cerdos se distribuyeron en tres grupos: 1) PMWS, cerdos con signos de desmedro y con cargas virales altas en NLIS (n = 4); 2) con desmedro sin PMWS, cerdos con signos de desmedro y cargas virales de intermedias a bajas en NLIS (n = 3); y 3) cerdos sanos, sin signos clínicos y con cargas virales bajas (n = 3). El PRRSV fue detectado en tres de los cerdos afectados por el PMWS y en dos cerdos con desmedro, pero sin el síndrome. Se caracterizaron las secuencias nucleotídicas del ORF2 de los PCV2 encontrados y los análisis genéticos revelaron la presencia de 2 genotipos PCV2a y PCV2b en las granjas afectadas con el PMWS. El perfil de expresión de citocinas mostró una baja expresión de IFN-γ en los cerdos con PMWS, mientras que los cerdos con desmedro sin PMWS mostraron valores elevados de esta citocina. Estos resultados sugieren que existe un desbalance en la producción de citocinas que puede estar implicado en la patogénesis de la enfermedad.

Palabras clave: PMWS, PCV2, PRRSV, IFNγ, nódulos linfáticos.

 

Introducción

Los circovirus porcinos (PCVs) son virus pequeños constituidos de ADN circular de cadena sencilla y polaridad negativa.¹ A la fecha, se han descrito dos tipos, PCV1 y PCV2; sin embargo, solamente el tipo 2 (PCV2) ha sido asociado con la enfermedad de origen multi-factorial conocida como síndrome de desmedro posdestete (postweaning multisystemic wasting síndrome, PMWS). Recientemente, se han definido tres genotipos de PCV2: PCV2a, PCV2b y PCV2c.² En este síndrome, el PCV2 se considera un agente infeccioso necesario, pero generalmente no suficiente para desencadenar la condición clínica.³ El PMWS afecta principalmente a cerdos de entre 6 y 15 semanas de edad. Los animales enfermos presentan retardo en el crecimiento, problemas respiratorios, diarrea, ictericia y agrandamiento de los nódulos linfáticos inguinales.¹ El PCV2 se ha encontrado de forma consistente en cerdos con signos de PMWS y también en cerdos aparentemente sanos;⁴ sin embargo, la carga viral de PCV2 en cerdos afectados es significativamente mayor que en los cerdos sanos con infección subclínica.³ Este elemento debe ser considerado para el diagnóstico diferencial entre PMWS e infecciones con PCV2.

El diagnóstico de PMWS se basa en la detección de PCV2 y en los cambios histológicos observados en tejidos linfoides de animales clínicamente afectados.³ Los métodos tradicionales para la detección del virus incluyen la inmunohistoquímica y la hibridación in situ de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina.⁵ También se ha empleado PCR en tiempo real para cuantificar PCV2 en diferentes tejidos de cerdos con infecciones naturales,⁶ o en infecciones experimentales,⁷ y se ha sugerido que una carga viral en suero de 10⁷ copias ADN/ml o superior, permite distinguir infecciones clínicas y subclínicas con PCV2.^8,9 Existen diversas enfermedades del cerdo que también ocasionan retardo del crecimiento y signos respiratorios. De hecho, el diagnóstico diferencial más significativo con PMWS es el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), ocasionado por el virus del mismo nombre (PRRSV). El PRRSV es un virus pequeño, envuelto, de ARN de cadena sencilla que pertenece a la familia Arteriviridae.¹⁰ El PRRSV es responsable de grandes pérdidas económicas en todo el mundo debido a las alteraciones respiratorias y reproductivas que ocasiona. La frecuencia de infecciones por sinergia de PCV2 con PRRSV^11-13 no sólo complica el diagnóstico, sino que conduce a interpretaciones erróneas de datos como parámetros inmunológicos.

Los cerdos con signos de PMWS presentan alteraciones en parámetros inmunológicos como la depleción linfocitaria; mientras que la infección por PRRSV ocasiona un efecto opuesto presentando hiperplasia linfoide.¹⁴ La evaluación de la expresión de citocinas en diferentes tejidos linfoides de animales con PMWS reveló una disminución en los niveles de IL-2, IL-12, IL-4 e IFN-γ, lo que implica una disminución en la capacidad de respuesta de las células T citotóxicas y una activación reducida de células B, con la consecuente disminución en la producción de anticuerpos.¹⁵ Comparados con lechones no infectados, los lechones nacidos de cerdas infectadas con PRRSV expresan niveles altos de IFN-γ y TNF-α en nódulos linfáticos a las dos semanas posparto.¹⁶ Sin embargo, a la fecha, no existen estudios sobre la producción de citocinas en tejidos linfoides de cerdos infectados a la vez con PCV2 y PRRSV. El objetivo de este estudio descriptivo fue cuantificar la expresión de citocinas, así como la detección y cuantificación de genomas de PCV2 y PRRSV en nódulos linfáticos inguinales de cerdos con retardo de crecimiento, en granjas con brotes de PMWS.

 

Material y métodos

Animales

Se incluyeron en el estudio cerdos con retardo de crecimiento (n = 7) y cerdos clínicamente sanos (n = 3), de 5 a 7 semanas de edad, procedentes de tres granjas porcinas de ciclo completo en el estado de Sonora. Los cerdos se mantuvieron en la granja experimental del Laboratorio de Inmunología de CIAD, A.C., para investigar las interacciones de la infección por ambos virus: PCV2 y PRRSV. Los animales con retardo en el crecimiento provenían de dos granjas con diagnóstico confirmado de PMWS, basado en criterios internacionales.¹⁷ Cinco cerdos procedían de la granja A y dos de la granja B. Los cerdos sanos se obtuvieron de una granja (C), con estatus sanitario libre de PRRSV y no tiene registros de manifestaciones relacionadas con el PMWS. Todas las granjas están libres de enfermedad de Aujezsky, fiebre porcina clásica y enfermedad del ojo azul (rubulavirus porcino). El cuidado de los cerdos se realizó siguiendo los lineamientos del Comité Institucional de Ética del CIAD, A.C. Los cerdos fueron sacrificados por electrocución siguiendo las recomendaciones de la NOM-062-ZOO-1999 y la Asociación Médica Veterinaria Americana (AVMA, 2007). Inmediatamente después del sacrificio se recolectaron y procesaron los nódulos linfáticos inguinales superficiales (NLIS).

Hibridación in situ

A partir de cada cerdo se tomaron segmentos de nódulos linfáticos inguinales superficiales (NLIS), los cuales se fijaron por inmersión en formalina al 10%; posteriormente, se embebieron en parafina y se hicieron cortes de 4 µm de espesor. Se realizó una prueba de hibridación in situ (ISH) para detectar la presencia de genoma viral PCV2, empleando un protocolo publicado,⁵ y la sonda¹⁸ fue aplicada sobre los cortes histológicos. La cantidad de ácido nucleico (PCV2) fue evaluada de forma semi-cuantitativa usando una clasificación descrita por Quintana et al.¹⁹

Extracción de ADN y ARN a partir de tejido

Se usaron 25 mg de tejido de NLIS para la extracción de ADN y ARN, empleando un sistema comercial de columnas* siguiendo las recomendaciones del fabricante.²⁰ El ARN fue resuspendido en 20 µl de agua libre de ARNasas. El ADN y ARN se almacenaron a -20ºC y -80ºC, respectivamente, hasta su uso.

Cuantificación de citocinas por RT-PCR en tiempo real

Como se describió anteriormente, se empleó, con algunas modificaciones, la técnica de PCR en tiempo real para la detección de ARNm de IL-6, IL-12b, IFN-γ y TNF-α.²¹ Se usaron 10 µg de ARN total y los reactivos del sistema de detección para RT-PCR en tiempo real con mezcla maestra one-step.** Las condiciones de amplificación fueron: 50°C por 30 min; 95°C por 10 min; y 40 ciclos de 95°C por 15 s, y 60°C por 1 min. Las secuencias de los iniciadores y las sondas se obtuvieron de la base de datos de Nutrición e Inmunología Porcina (Porcine Immunology and Nutrition database, USDA, http://www.ars.usda.gov/Services/docs.htm?docid=6065). Las sondas están marcadas con el fluorocromo TET (tetracloro-6-carboxifluoreceína) y el apagador BHQ (black hole quencher). Las señales de fluorescencia medidas durante la amplificación fueron procesadas post-amplificación. Las diferencias en los valores de Ct entre los animales sanos y los cerdos con manifestaciones clínicas de desmedro, fueron evaluadas como incrementos relativos. El análisis de datos se hizo con la formula 2^-∆∆Ct, en la cual el ∆Ct representa el valor promedio de los ∆Ct de tres cerdos sanos y el otro ∆Ct representa el valor individual de cada cerdo (sano e infectado). De esta forma, fue posible mostrar los valores individuales en cada grupo. Los valores de Ct de las citocinas estudiadas fueron normalizadas con un control endógeno (peptidil isomerasa A, PPIA), cuya expresión no se ve afectada por las infecciones y muestra resultados constantes.²¹

RT-PCR en tiempo real para la detección de PRRSV

Como se describió anteriormente, Christopher- Hennings et al.²⁰ usaron un paquete comercial,*** para cuantificar el genoma viral de PRRSV. Se construyeron curvas estándar a partir de diluciones décuples de cantidades conocidas de ARN transcrito in vitro (2.3 × 10¹ hasta 2.3 × 10⁷ copias ARN/ml).

PCR en tiempo real para la detección de PCV2

Para la cuantificación de PCV2 se emplearon iniciadores y sonda, descritos por Opriessnig et al.⁷ La PCR se llevó a cabo con el paquete Brilliant QPCR Core Reagent**** siguiendo las recomendaciones del fabricante. La reacción de PCR de 25 µl contenía 100 ng de ADN, sonda fluorescente, iniciadores sentido y antisentido a concentraciones de 200, 300 y 900 nM, respectivamente. Las condiciones de amplificación fueron: 50°C por 2 min; 95°C por 10 min; y 40 ciclos de 95°C por 15 s, y 60°C por 1 min. Para la cuantificación de la carga viral se construyó una curva estándar a partir de diluciones seriadas décuples de vector plasmídico con el inserto de interés.

Preparación del estándar plasmídico de PCV2 para el PCR tiempo real

Los productos de la amplificación de PCV2 por PCR en tiempo real fueron insertados en un vector de clonación TOPO pCR2.1***** y propagado en células competentes de Escherichia coli, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se purificó y cuantificó por densidad óptica medida a 260 nm, usando un espectrofotómetro. Las copias de ADN genómico fueron determinadas con el método descrito por Whelan et al.²² Se realizaron diluciones décuples de 10⁸-10¹ copias de ADN/µl que fueron preservadas a -20ºC, mientras que el plásmido se guardó a -70ºC.

Secuenciación de PCV2

A partir de NLIS se amplificó el gen completo de ORF2 (817 pb), usando un juego de iniciadores descritos por Larochelle et al.²³ La PCR se llevó a cabo de la siguiente forma: en un volumen final de 50 µl de reacción que contenía Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM (pH 8.3), MgCl₂ 3 mM, dATP, dTTP, dCTP y dGTP 0.8 mM, cada uno, de cada iniciador 20 µM, Taq ADN polimerasa 0.25 U y 5 µl ADNc. El protocolo de termociclado: 33 ciclos a 94°C por 30 s, 60°C por 30 s, y 72°C por 1 min. Los productos de PCR fueron purificados y ambas cadenas fueron secuenciadas en el Genomic Analysis and Technology Core Facility of the University of Arizona (Tucson, AZ). Las secuencias obtenidas se depositaron en el GenBank (números de acceso: EU735558-EU735564), se compararon con otra secuencia obtenida en el laboratorio en 2006 y con las cepas de referencia de PCV2a (AF05592), PCV2b (AF055394), y PCV2c (EU148503). Los análisis de secuencias se realizaron con el programa DNASTAR Inc. 8.0.2.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con la prueba de U-Mann Whitney para evaluar diferencias en los niveles de expresión de ARNm de citocinas, así como de las cargas virales de PCV2 y PRRSV. Se consideró un nivel de significancia de P < 0.05. Todos los análisis se hicieron con el programa Prism (Graph-Pad).

 

Resultados

Detección de PCV2 por hibridación in situ (ISH)

El Cuadro 1 resume los resultados de ISH. Los cerdos PCb1, PCb4, PCO1, y PCO2 presentaron cantidades de moderadas a altas de ácido nucléico de PCV2, por lo que se clasificaron como casos de PMWS. Los cerdos PCb2 y PCb3 tuvieron una baja cantidad de genomas de PCV2 y se clasificaron como cerdos con desmedro-sin-PMWS. La evaluación por ISH no fue posible para la muestra del cerdo PCb5. Finalmente, los cerdos PC101, PC103, y PC104, de la granja sin signos clínicos presuntivos de PMWS, fueron negativos a ISH, por lo que se clasificaron como cerdos sanos.

Cuantificación de PCV2

Para la construcción de la curva estándar se emplearon diluciones décuples del plásmido con la secuencia de PCV2. Los resultados mostraron un coeficiente de determinación (R² = 0.9842) y un intervalo de detección de 4.8 × 10² a 4.8 × 10⁸ copias ADN/ml. La cuantificación de PCV2 en NLIS mostró que los cerdos con PMWS (PCb1, PCb4, PCO1, y PCO2) tuvieron una carga viral promedio de 1.73 × 10⁸ copias ADN/100 ng de ADN (2.3 × 10⁷ a 2.8 × 10⁸ copias ADN/100 ng de ADN). Los cerdos con desmedro-sin-PMWS (PCb2 y PCb3) tuvieron un promedio de 2 × 10⁵ copias ADN/100 ng de ADN (el rango fluctuó entre 5 × 10⁴ a 4 × 10⁵ copias ADN/100 ng de ADN). El cerdo PCb5, sin el resultado de ISH, tuvo 4.8 × 10⁴ copias ADN/100 ng de ADN, el cual fue similar a lo observado en aquellos con desmedro-sin-PMWS; por lo que, para los fines de la clasificación patológica, se incluyó en este grupo. Los cerdos sanos tuvieron un promedio de 5.2 × 10¹ copias ADN/100 ng de ADN (1.7 × 10¹ a 3.4 × 10¹ copias ADN/100 ng de ADN) (Figura 1). Se observaron diferencias estadísticas significativas en la concentración de PCV2 de los cerdos sanos comparados con los cerdos con PMWS (P < 0.001), o con los cerdos con desmedro-sin-PMWS (P < 0.05). También se observaron diferencias significativas entre los cerdos con PMWS y los cerdos con desmedro-sin-PMWS (P < 0.001).

Cuantificación de PRRSV

Con base en las condiciones experimentales establecidas en el laboratorio, el límite de detección del sistema comercial empleado fue de 2.3 × 10¹ a 2.3 × 10⁷ copias ARN/ml, con un coeficiente de determinación de R² = 0.9812. A diferencia de lo encontrado para el PCV2, el número de copias genómicas de PRRSV fue menor (Figura 1). Los cerdos sanos fueron negativos a PRRSV. De los cuatro cerdos con PMWS, tres fueron positivos a PRRSV, con una concentración promedio de 1.6 × 10² copias ARN/25 ng (5.5 × 10¹ a 2.7 × 10² copias ARN/25 ng). De los tres cerdos con desmedro sin PMWS, dos fueron positivos a PRRSV y tuvieron un promedio de 9.9 × 10³ copias ARN/25 ng (1.2 × 10² a 1.9 × 10⁴ copias ARN/25 ng). Sólo se observaron diferencias significativas entre los cerdos sanos y los PMWS (P < 0.05).

Secuenciación de PCV2

Se secuenciaron seis de siete virus PCV2, a partir de los cerdos PMWS y los cerdos con desmedro sin PMWS. En cinco de las seis muestras fue posible secuenciar un fragmento de 817 pb, que corresponde a la secuencia del ORF2 (PCO1, PCO2, PCb1, PCb3, y PCb4), y para la muestra PCb2, se obtuvo una secuencia parcial de 628 pb. En cuanto a los cerdos sanos, sólo fue secuenciado un fragmento de < 100 pb y no fue considerado en los análisis filogenéticos. Para la reconstrucción de filogenias se incluyeron: una secuencia de un aislado PCV2 mexicano de un cerdo con PMWS, de 2006 (PC001), así como otras secuencias representativas depositadas en la base de datos del GenBank (Cuadro 2 y Figura 2). Las secuencias PCb1, PCb2, y PCb3 tuvieron una identidad de 92-95% con PC001, mientras que PCb4, PCO1, y PCO2 tuvieron una identidad de 98-99%. Como se ha informado en otros estudios, estos resultados sugieren la existencia de dos genotipos diferentes entre los cerdos estudiados. Las secuencias PC001, PCO1, PCO2, y PCb4, con una identidad de 98-99%, fueron del genotipo PCV2b y las secuencias PCb1, PCb2, y PCb3, con 97-99%, fueron del genotipo PCV2a. La identidad nucleotídica entre ambos genotipos fue de 92-95%. Tres de cuatro cerdos con PMWS tuvieron el genotipo PCV2b, y dos de tres cerdos con desmedro sin PMWS tuvieron el genotipo PCV2a.

Expresión de citocinas

Se empleó la expresión de citocinas promedio (∆Ct) de los cerdos sanos para compararla con la expresión de citocinas de cada cerdo con retardo de crecimiento de forma individual (∆∆Ct) y expresarla como el incremento relativo usando la fórmula 2^-∆∆Ct. Los datos se analizaron para comparar las diferencias entre los grupos de animales estudiados (Figura 3). Los resultados mostraron un nivel de expresión de IL-6 similar en los NLIS de cerdos con PMWS (incremento relativo de 0.4) y los animales con desmedro-sin PMWS (incremento relativo de 0.6), y las diferencias con respecto a los animales sanos no fueron significativas (P > 0.05). La expresión de TNF-α se incrementó en los cerdos sanos (incremento relativo promedio de 3.7) y en los cerdos con desmedro sin PMWS (incremento relativo promedio de 7.8), pero el incremento relativo promedio en los cerdos con PMWS fue de 0.2. Se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de TNF-α entre los cerdos con desmedro sin PMWS y los cerdos PMWS (P < 0.05). Para el IFN-γ se observó una sobreexpresión en los cerdos con desmedro sin PMWS (incremento relativo promedio de 5.6, en un intervalo de 1.1 a 8.5), y sólo ligeramente expresado en los cerdos con PMWS (incremento relativo promedio de 2.7, en un intervalo de 0.005 a 11) y en los cerdos sanos (1.1-diferencia en incremento relativo). También se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión de IFN-γ entre los cerdos con desmedro sin PMWS y en cerdos sanos (P < 0.05). Finalmente, se encontró un incremento en la expresión de IL-12 en cerdos con desmedro sin PMWS (incremento relativo promedio de 8.8), y sólo marginalmente en cerdos PMWS (incremento relativo promedio de 2.8) y en cerdos sanos (incremento relativo promedio de 1.0).

Discusión

El objetivo de este trabajo fue comparar la carga viral de PCV2 y PRRSV, el genotipo de PCV2, y las diferencias en los perfiles de expresión de citocinas en nódulos linfáticos inguinales superficiales de cerdos con retardo en el crecimiento, originarios de granjas con un diagnóstico confirmado de PMWS, y en cerdos sanos provenientes de granjas libres de PRRSV, sin signos clínicos presuntivos de PMWS. El diagnóstico de PMWS fue confirmado por diversos métodos, incluyendo los signos clínicos, hibridación in situ y PCR en tiempo real de PCV2, en NLIS, lo cual permitió realizar una clasificación de los cerdos en tres grupos: 1) cerdos con PMWS, 2) cerdos con desmedro sin PMWS y 3) cerdos sanos. Esta clasificación coincide con lo descrito anteriormente por otros autores.^6,24 Los cerdos que presentaron desmedro sin los otros signos característicos del síndrome son casos difíciles de clasificar, por lo que el diagnóstico de PMWS para estos cerdos no puede establecerse formalmente, ya que no cumplen con toda la definición de caso,¹⁷ debido a que los animales se encuentran en fase de recuperación de la enfermedad, o alternativamente pueden ser cerdos que padecen otro proceso que conduce al desmedro y a una infección subclínica con PCV2.²⁵ Por lo que los resultados de la evaluación de animales en estas poblaciones particulares se deben considerar cuidadosamente. No obstante, la cercana asociación entre los resultados de PCR en tiempo real y la hibridación in situ nos permite enfatizar la utilidad en el uso de punto de corte de >10⁷ copias de ADN de PCV2, previamente sugerido por otros autores, para sospechar de PMWS.^8,9 De hecho, con base en los resultados del presente trabajo, este umbral o punto de corte puede ser también útil para evaluar NLIS y muestras de suero. Por otra parte, los cerdos con desmedro-sin PMWS se agruparon entre >10⁴ a <10⁷ copias ADN/100 ng de ADN, mientras que los cerdos sanos tuvieron <10⁴ copias ADN PCV2/100 ng de ADN.

El riesgo de ocurrencia de PMWS es más elevado cuando está presente el PRRSV, comparado con otros virus como coronavirus, enterovirus, influenza, o parvovirus.²⁶ La infección de cerdos con PRRSV y PCV2 aparentemente favorece el aumento en la replicación del circovirus y, en consecuencia, se tienen cargas virales más altas en suero.²⁷ En este estudio los cerdos con PMWS y con desmedro sin PMWS fueron positivos a PRRSV, con cargas virales similares; sólo un cerdo en cada grupo fue negativo a PRRSV. Estos resultados sugieren que el PRRSV, aparentemente no favorece un incremento en la carga viral de PCV2 en NLIS; sin embargo, esta hipótesis no puede ser descartada debido a que los diferentes tiempos de infección están involucrados en la sinergia de la infección y el tiempo preciso de infección no es posible determinarlo.

El análisis de las secuencias de PCV2 sugiere la presencia de dos genotipos, PCV2a y PCV2b, descritos anteriormente para PCV2.^2,24 En NLIS de cerdos con desmedro sin PMWS, sólo se detectó la presencia del genotipo PCV2a, y tres de cuatro cerdos con PMWS estaban infectados con PCV2b. Grau-Roma et al.²⁴ demostraron que los cerdos que provienen de granjas sin historia de PMWS presentaban infección con PCV2a de manera consistente, mientras que en granjas con PMWS circulan ambos genotipos. Los resultados del presente estudio no pueden confirmar este hallazgo, ya que debido a la baja carga viral de los cerdos sanos no fue posible obtener la secuencia del virus PCV2 procedente de la granja libre de PMWS. Sin embargo, ambos genotipos fueron identificados en los cerdos procedentes de granjas con PMWS.

En este estudio piloto, se observó que los cerdos con PMWS tuvieron una disminución en la capacidad de expresar IFN-γ e IL-12, en niveles similares a los encontrados en cerdos sanos y además presentaron cargas virales altas; mientras que los cerdos con desmedro sin PMWS mostraron niveles de expresión elevados de IFN-γ con cargas virales intermedias. No fue posible definir el tiempo preciso de infección, por lo que los cerdos se agruparon de acuerdo con sus signos clínicos y cargas virales. Empleando estos criterios, se sugiere que los cerdos con desmedro sin PMWS tienen niveles altos de expresión de IFN-γ. En el grupo de PMWS, sólo un cerdo tuvo niveles elevados de expresión de IFN-γ, y comparado con el resto de los animales afectados presentó la menor carga viral de PCV2 en tejido (casi 1 log menos). Este resultado puede ser explicado como un animal en fase de recuperación de la infección o un cerdo con resistencia natural a infecciones virales. La expresión de IFN-γ en cerdos PMWS y en cerdos con desmedro sin PMWS es similar a lo registrado por otros investigadores.²⁸ En dicho estudio se observó que los cerdos tratados con ciclosporina e infectados con PCV2 presentan títulos altos de anticuerpos neutralizantes, una expresión incrementada de IFN-γ y negativos a PCV2 en suero, en contraste con cerdos que presentaron viremia, bajos títulos de anticuerpos neutralizantes y nula producción de IFN-γ. Ello podría sugerir que las citocinas Th1 (IFN-γ) pueden tener un papel esencial para prevenir el desarrollo de PMWS y las viremias de PCV2, y que la producción de IL-10 podría favorecer la viremia y los signos de PMWS.^15,29,30

En conclusión, hasta este punto no es posible tener el panorama completo sobre la producción de citocinas en cerdos infectados con PCV2, por lo que se necesitan otras contribuciones a este tema. Sin embargo, estos resultados preliminares en cerdos con infecciones naturales de PCV2 indican que los cerdos con desmedro sin PMWS muestran una producción alta de ARNm de IFN-γ, comparados con los cerdos PMWS. Por lo que es posible sugerir que la producción de esta citocina puede influir en las cargas virales en NLIS, así como en el desarrollo del PMWS.

 

Agradecimientos

Se agradece el financiamiento otorgado por el Fondo SAGARPA-CONACyT (Proyectos núms. 2004-C01-101 y 2004-C01-61) para la realización de este trabajo.

 

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Notas

*QIAGEN, Estados Unidos de América.

**Stratagene, Estados Unidos de América.

****Tetracore Inc, Estados Unidos de América.

****Stratagene, Estados Unidos de América.

*****Invitrogen, Estados Unidos de América.