Artículos científicos

 

Solubilidad de un compuesto con actividad fasciolicida: evaluación de eficacia in vitro y en ovinos experimentalmente infectados con Fasciola hepatica

 

Solubility of a compound with fasciolicidal activity: evaluation of efficacy in vitro and experimentally on infected sheep with Fasciola hepatica

 

Javier Arturo Munguía Xóchihua* Froylán Ibarra Velarde** Yolanda Vera Montenegro** René Rosiles M.*** Antonio Romo Mancillas† Jorge Cantó Alarcón‡ Adriana Ducoing Watty°

 

* Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinarias, Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de febrero núm. 818 sur, Colonia Centro, 85000, Ciudad Obregón, Sonora, México, Correo electrónico: jmunguia@itson.mx

** Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

*** Departamento de Nutrición, Laboratorio de Toxicología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

† Departamento de Farmacia, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

‡ Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Av. de las Ciencias s/n, Querétaro, Querétaro, México.

° Departamento de Genética y Estadística, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

 

Recibido el 28 de enero de 2009
Aceptado el 5 de octubre de 2009

 

Abstract

Compound alpha (Ca) is a benzimidazolic derívate which has shown a high fasciolicidal efficacy when it is given by oral via. Solubilization of Ca would be a suitable alternative to obtain an injectable formulation. The objectives of the present study were to evaluate the solubility of Ca in order to determine the in vitro fasciolicidal efficacy and experimentally on infected ovines. The assays of solubility quantified by high–performance liquid chromatography (HPLC), showed that beta–cyclodextrin (β–CD) and hydroxi–propylbeta–cyclodextrin (HP–β–CD) solubilized in 0.015% and 1.018% respectively. The solubilization for HP–β–CD was calculated as 3.95% for 5.8 mg; 10.76% for HP–β–CD with methanol, 39.048% for proylene–glycol (PG), 100% for glycerol formal (GF), and 100% for combined PG and GF and water in proportions of 3:2:5 and 3:2:4. In vitro evaluation using immature F. hepatica showed that Ca induced 100% efficacy 24 hours after solubilization with either GF or GF combined with PG and water. The efficacy in sheep was 56.4 and 68.4% at 1 and 2 mg/kg respectively; whereas 1 mg/kg of sulphoxide metabolite induced an efficacy of 73.9%. The HPLC assays performed showed no evidence of the sulphoxide and sulphone metabolites. It is concluded that besides solubility and high in vitro fasciolicidal efficacy, the in vivo results in sheep showed only a moderate efficacy.

Key words: Compound alpha, HPLC, Ciclodextrins, Vehicles, Cosolvence.

 

Resumen

El compuesto alfa es un derivado bencimidazólico de gran eficacia fasciolicida, que se ingiere vía oral, su solubilización constituye una alternativa para obtener una formulación inyectable. Los objetivos de este estudio fueron: evaluar la solubilidad del compuesto alfa, determinar la eficacia fasciolicida in vitro y en ovinos experimentalmente infectados. Los ensayos de solubilidad que fueron cuantificados mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, mostraron que la betaciclodextrina e hidroxipropil–betaciclodextrina solubilizaron en 0.051% y 1.018%. Esta última se evaluó con cinco concentraciones, mostró que a 5.8 mg la solubilidad fue 3.95%; hidroxipropil–betaciclodextrina y metanol, 10.76%; propilén–glicol, 39.048%; glicerol formal, 100%; y glicerol formal con propilén–glicol y agua en proporciones 3:2:5 y 3:2:4, 100%. La evaluación in vitro con fasciolas inmaduras mostró que el compuesto con glicerol formal y la combinación de vehículos a las 24 horas fueron eficaces en 100%. La eficacia in vivo en ovinos mostró que el compuesto alfa a dosis de 1 mg/kg fue de 56.46%, a 2 mg/kg de 68.4% y con sulfóxido del compuesto alfa a 1 mg/kg de 73.9%. No se encontró el compuesto alfa ni sus metabolitos sulfóxido y sulfona en el suero determinado por medio del cromatógrafo de líquidos de alta resolución. Se concluye que a pesar de obtener solubilidad del compuesto alfa y alta eficacia fasciolicida in vitro, los resultados in vivo en ovinos revelaron eficacia moderada.

Palabras clave: Compuesto alfa, CLAR, Ciclodextrinas, Vehículos, Cosolvencia.

 

Introducción

La fasciolosis producida por Fasciola hepatica afecta a varias especies animales, en particular a los rumiantes, en los que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas en forma directa cuando mueren jóvenes e indirectas por ocasionar baja de producción de carne y leche, deficiente conversión alimentaria que causa disminución del crecimiento, baja fertilidad y decomiso de hígados en forma parcial o total en los rastros o mataderos.^1–3

Para disminuir o evitar estos efectos detrimentales el mejor control es el químico, con ese propósito existen en el mercado diferentes compuestos; de ellos el triclabendazol ha mostrado mayor eficacia en virtud de que elimina tanto a formas juveniles como adultos del trematodo.⁴ Sin embargo, la sobreutilización de este compuesto ha generado resistencia de las bacterias en Irlanda y Australia, por lo que se requiere disponer de nuevos compuestos con igual o mayor actividad fasciolicida. En la búsqueda de estas alternativas se sintetizó el compuesto alfa (Ca) o 5–cloro–2–metiltio–6–(1–naftiloxi)–1H–bencimidazol,⁵ que ha mostrado alta eficacia fasciolicida in vitro e in vivo por vía oral en ovinos^6–8 y en bovinos.^9–11 Sin embargo, su solubilidad es mala en agua por lo que es importante realizar esfuerzos para solubilizarlo con el fin de obtener una formulación inyectable.

El uso de vehículos como ciclodextrinas (CD), propilén–glicol (PG) y glicerol formal (GF) pueden aumentar la solubilidad, estabilidad química y biodisponibilidad, modificar la absorción y la concentración del compuesto en sangre de diferentes compuestos.^12–13

El compuesto alfa solubilizado e inyectado por vía intramuscular tendrá mayor efecto que cuando se administra vía oral.

Los objetivos de este estudio fueron evaluar la solubilidad y eficacia in vitro del compuesto alfa, así como su eficacia en ovinos experimentalmente infectados.

 

Material y métodos

Solubilidad del compuesto alfa

Compuesto alfa

El compuesto alfa se sintetizó en el Departamento de Farmacia de la Facultad de Química, de la Universidad Nacional Autónoma de México.⁵

Vehículos

Ciclodextrinas* (CD): alfaciclodextrina (α–CD), hidroxipropil–alfaciclodextrina (HP–α–CD), betaci–clodextrina (β–CD), hidroxipropil–betaciclodextrina (HP–β–CD) y los cosolventes propilén–glicol** (PG) y glicerol formal*** (GF), que provinieron de fuente comercial.****

Solubilidad

Se realizó la formación de aductos del Ca con las CD con el siguiente procedimiento: el Ca (2 mg) se suspendió en una solución acuosa (2 mL/H₂O) con cada ciclodextrina (3 mg) por triplicado,¹⁴ se agitó durante siete días a temperatura ambiente. La CD que proporcionó mayor hidrosolubilidad se evaluó en las concentraciones 5.8, 2.9,1.45, 0.725, 0.0362 mg con 2 mg de Ca. Se realizaron otros ensayos utilizando HP–β–CD y metanol (MeOH), se evaporó al medio ambiente y se resuspendió en agua, Ca con PG, CPα con GF y la combinación de cosolventes GF con PG y H₂O en proporción 3:2:5 y 3:2:4. Se utilizó una concentración de HP–β–CD 3.0 mg y de Ca 2.0 mg en cada ensayo por triplicado; cada muestra se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa, para ser inyectado en el cromatógrafo de líquidos de alta resolución (CLAR). Se determinó la solubilidad en forma física mediante transparencia de los vehículos con el compuesto y con el uso del CLAR.^15–17

Condiciones cromatográficas

Se utilizó un sistema cromatográfico con bomba binaria, automuestreador y detector de arreglo de diodos, con 304 nm de longitud de onda. La fase móvil consistió en metanol (40), agua (40) y acetonitrilo (20) en grado CLAR,† degasificador en línea con helio. La fase estacionaria consistió en una columna C18 de 80 mm de longitud. La suspensión a evaluar se filtró con membrana 0.45 µm,‡ se inyectaron 25 µL de muestra y el límite de detección del equipo fue de 50 ng/mL.

Para el cálculo de la concentración del compuesto se empleó un estándar externo, con el método de adición se determinó el porcentaje de recuperación de la técnica analítica para establecer el porcentaje de recuperación del compuesto durante la extracción.¹⁸

 

Evaluación in vitro

Preparación de compuestos para evaluación quimioterapéutica

Se utilizaron 10 y 50 mg/L de Ca solubilizado con GF, PG, GF combinado con PG y H₂O (3.2:5 y 3:2:4) y 0.5 mg/L con con HP–β–CD que se depositaron en viales de 30 mL de capacidad. Posteriormente se prepararon las diluciones correspondientes con la finalidad de obtener las concentraciones requeridas para la evaluación biológica anti–Fasciola hepatica.

Metacercarias

Las metacercarias de Fasciola hepatica fueron producidas en caracoles Lymnaea humilis a partir de la infección con miracidios de origen bovino obtenidos de un rastro local.

Técnica de desenquistamiento

Se realizó la técnica de desenquistamiento artificial tal y como fue descrita previamente.¹⁹

Operación de ensayo para escrutinio

Se utilizaron cajas de cultivo de 24 pozos, compuesto solubilizado y 0.2 mL con diez Fasciolas por pozo. Los compuestos se probaron a concentraciones terciadas de 10 y 50 mg/L. Cada compuesto se evaluó por duplicado y se contó, como testigo, por lo menos con ocho pozos que contenían sólo Fasciolas. Cada ensayo se mantuvo en incubación durante cuatro días a 37°C bajo una atmósfera de CO₂ al 5%. Este procedimiento fue realizado de acuerdo con lo descrito por Ibarra y Jenkins²⁰ y modificado por Rivera et al.²¹

Interpretación de la prueba

Las Fasciolas fueron examinadas los días cero, uno y cuatro con un microscopio invertido a 40X. La actividad de los compuestos se midió por comparación de la sobrevivencia de las fasciolas bajo tratamiento respecto de las fasciolas testigo no tratadas. Los procedimientos se realizaron en condiciones asépticas con una campana de flujo laminar.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron sometidos a análisis de varianza para determinar diferencias de eficacia entre concentraciones y grupos de los compuestos evaluados. Se utilizó la prueba de Nemenyi apoyado con el uso del paquete estadístico SAS.²²

 

Evaluación in vivo en ovinos

Animales

Se utilizaron 24 ovinos Pelibuey machos de diez meses de edad, libres de fasciolosis, alojados en corrales de encierro convencional, alimento balanceado y agua a libre acceso en la Universidad Autónoma de Querétaro.

Infección

Previa semana de adaptación, el día cero los animales se infectaron con 250 metacercarias de Fasciola hepatica, que tenían 15 días de enquistadas y conservadas en refrigeración a 5°C.

Análisis fecal

Se recolectaron muestras fecales los días –8, 70 y 90 para la búsqueda de huevos del trematodo por medio de la técnica de sedimentación.

Muestras de sangre

Las muestras de sangre se recolectaron, conservaron y se procesaron para la extracción del suero y posterior inyección en el CLAR.^18,22

Conducción del experimento

Se seleccionaron cuatro grupos de seis animales cada uno con base en los conteos de huevos de Fasciola de las muestras de heces tomadas el día –8.²³

Tratamientos

El Grupo 1 recibió dosis de 1 mg/kg/IM del compuesto alfa solubilizado con GF con PG y H₂O (3:2:4), con concentración de 10.86 mg/mL.

El Grupo 2 recibió dosis de 2 mg/kg/IM del compuesto alfa solubilizado con GF con PG y H₂O (3:2:4), con concentración de 10.86 mg/mL.

Al Grupo 3 se le administró 1 mg/kg/IM de sulfóxido del compuesto alfa solubilizado con GF con PG y H₂O (3:2:4), con concentración de 8.9 mg/mL.

El Grupo 4 se utilizó como testigo infectado sin tratamiento.

El sacrificio de los animales se realizó 15 días después de la administración del compuesto alfa solubilizado; se tomó cada hígado para revisión, recolección, conteo y medición de los trematodos.

Evaluación

La eficacia se determinó con base en la presencia de huevos o Fasciolas presentes en el grupo tratado con respecto al grupo testigo:²⁴

 

donde

E = Porcentaje de efectividad,

XC = Promedio de Fasciolas en el grupo testigo,

XT = Cantidad promedio de Fasciolas en el grupo tratado.

Análisis estadístico

La información obtenida se sometió a análisis de varianza con la finalidad de determinar posibles diferencias significativas entre grupos y tratamientos.

La comparación de medias del número de Fasciolas recolectadas del grupo tratado y testigo se realizó por medio de la prueba de Kruskal–Wallis, que determinó la diferencia de la reducción de Fasciolas adultas.²⁵ El análisis se realizó con el paquete estadístico SAS 1990.

Para el análisis de los resultados y cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, se realizó la transformación de Box y Cox del número de huevos después del tratamiento, utilizando la transformación de [(huevos finales) –⁰.²–1)]/–0.008615735.

 

Resultados

Solubilidad del compuesto alfa

El Cuadro 1 muestra que las HP–α–CD y β–CD no solubilizaron al compuesto alfa, las β–CD solubilizaron en 0.051%, HP–β–CD en 1.018%; HP–β–CD con 5.8 mg en 3.95%, HP–β–CD y metanol en 10.76%, PG en 39.048.5%, GF en 100%, la combinación GF con PG y H₂O en proporciones 3:2:5 y 3:2:4 en 100%. El límite de detección del equipo cromatográfico fue de 50 ng/mL, lo cual demuestra que la técnica fue validada para detectar el compuesto alfa solubilizado.

Evaluación in vitro

En el Cuadro 2 se observa que el Ca solubilizado con HP–β–CD, PG en 96 horas no eliminó las Fasciolas, con GF 100% y la combinación GF con PG y H₂O en ambas concentraciones tuvo eficacia Fasciolicida de 100% a las 24 horas. Asimismo, todos los testigos se mantuvieron vivos durante 96 horas.

Evaluación in vivo en ovinos

En el Cuadro 3 se aprecia la reducción de huevos: el promedio de huevos de Fasciola hepatica eliminados antes y después del tratamiento fue: Grupo 1, 89.16 y 14.66 h/g/h; Grupo 2, 30.33 y 16.66 h/g/h; Grupo 3, 24.83 y 23.16 h/g/h; Grupo 4, 125 y 133.5 h/g/h, respectivamente.

La cantidad de huevos por gramo de heces después del tratamiento no fue estadísticamente significativa entre tratamientos (P > 0.05).

En la reducción de Fasciolas adultas se halló que el número promedio de Fasciolas por grupo fue: Grupo 1,  36.29; Grupo 2, 37.79; Grupo 3, 33.96; Grupo 4, 74.96. El análisis del número de fasciolas por ovino muestra que no hay diferencia significativa, por lo cual no hay diferencias entre los tratamientos pero sí entre éstos y el testigo (P < 0.05).

En el tamaño promedio (longitud) de las Fasciolas de los grupos, aunque varió, sólo hubo diferencia numérica. El porcentaje de eficacia fue: Grupo 1, 51.48%; Grupo 2,  49.58%; Grupo 3, 54.6%. El análisis de la longitud total promedio de las Fasciolas muestra que no hay diferencia significativa, por lo cual hay diferencias entre los tratamientos y con el testigo (P < 0.05).

La cinética del Ca determinado por el CLAR mostró que en todas las muestras de suero no se encontró el Ca ni sus metabolitos sulfóxido y sulfona, el límite de detección del equipo fue de 2 ng/mL.

 

Discusión

Solubilidad del compuesto alfa

La técnica para determinar la solubilidad del compuesto alfa fue validada en el cromatógrafo de líquidos de alta resolución, por lo cual se demuestra que se trata de un método adecuado para separar componentes en una mezcla y es muy específico para el reconocimiento de uno o varios analitos de interés; además, permite una excelente separación de los componentes individuales para reconocerlos fácilmente.^14,26,27

La hidrosolubilidad de la HP–β–CD detectada por el CLAR se debe a que, en general, la estequiometría de la mayoría de los complejos formados con CD es en relación 1:1,28 el aumento de solubilidad aunado a incremento de la concentración HP–β–CD es resultado de mayor cantidad de moléculas de HP–β–CD que de Ca, lo que favorece la formación de aductos entre los dos compuestos.

La HP–β–CD con metanol mejoró la solubilidad del compuesto alfa en 10.95%, la solubilidad obtenida fue baja debido al tamaño de la cavidad de la ciclodextrina,²⁹ su solubilidad baja en agua de 18.5 g/L a 25°C¹⁷ para compuestos farmacéuticos con pesos moleculares entre 200 y 800 g/mol³⁰ y una solubilidad acuosa del 60% (w/v),²⁷ aunado al peso molecular del Ca y la estequiometría de la mayoría de los complejos formados con CD, que es en relación 1:1, lo cual disminuye la formación de aductos. Este resultado contrasta con las observaciones previas en donde la HP–β–CD aumentó la solubilidad en agua del albendazol.^14,26

El PG no mostró una adecuada solubilidad debido quizá a la densidad del vehículo, pero su uso con HP–β–CD aumenta la solubilidad de compuestos.³¹

Con el GF y las combinaciones de vehículos se obtuvo 100% de concentración; pues es un solvente binario que solubiliza gran variedad de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos, utiliza cosolvencia para incrementar la solubilidad de compuestos en concentración aceptable para formulaciones intramusculares y mejora la biodisponibilidad de los principios activos poco polares, puede ser usado a altas dosis de más de 4 000 mg/kg en ratas.^31–33

La adecuada solubilidad obtenida por la cosolvencia de los vehículos ha sido utilizada con éxito en la formulación de ivermectinas y rimfampicina.^34,35

Evaluación in vitro

Estudios previos muestran que el compuesto alfa tiene alta eficacia in vitro contra F. hepatica,^6–8 por lo cual la solubilidad con los vehículos utilizados no afecta la eficacia del compuesto al obtenerse 100% de eficacia contra el trematodo.

Evaluación in vivo en ovinos

La baja eficacia del Ca solubilizado se debe a que por vía oral tiene una preactivación en rumen en sus metabolitos sulfóxido y sulfona, el primero, pasa a plasma en concentración adecuada para tener alta eficacia en ovinos y caprinos.^6,7,11 Es probable que el Ca al ser inyectado vía intramuscular quede en el compartimiento tisular, poco compuesto pasa al torrente sanguíneo y llega baja concentración al hígado para ser metabolizado en sulfóxido y sulfona; este comportamiento está asociado a sus características fisicoquímicas que favorecen un volumen de distribución bajo, por lo cual a mayor dosis aumenta la concentración y la eficacia fasciolicida.

Se debe considerar que en el sitio de inyección la disposición del compuesto depositado depende del balance entre variables, como afinidad del compuesto con el vehículo formulado, volumen inyectado, profundidad del sitio de aplicación, perfusión del músculo inyectado, absorción de vehículo, así como reacción en el sitio de aplicación, liposolubilidad del compuesto, distribución del compuesto asociado con el vehículo utilizado, fuerzas fisicoquímicas del tejido en movimiento y contracción muscular, para que el compuesto se libere del vehículo, atraviese los capilares y se difunda en la sangre para ser absorbido.^36–40

Los vehículos utilizados, como el GF y PG, pueden reducir el tamaño de la partícula, por lo cual favorecen la solubilidad y estabilidad de las emulsiones w/w,⁴¹ pero no mejoraron la distribución del compuesto en el compartimiento vascular para llegar al hígado y ser metabolizado en sulfóxido y sulfona, los cuales estuvieron presentes en el plasma al tener efecto contra adultos de Fasciola hepatica, pero en concentraciones plasmáticas por debajo del límite de detección del CLAR, que fue de 2 ng/mL.

Las diferencias de la eficacia fasciolicida entre las vías oral e intramuscular se deben a que por vía oral se realiza una preactivación en rumen en sus metabolitos sulfona y sulfóxido, este último pasa a plasma en concentración adecuada para tener alta eficacia, como se ha notificado en ovinos y bovinos cuando se administra.^6,7,11

La combinación de GF con PG y agua, solubiliza en 100% al Ca, con alta eficacia fasciolicida in vitro, pero no fue consistente bajo condiciones in vivo en ovinos. Se requiere adecuar la formulación para mejorar la eficacia contra Fasciola hepatica.

 

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Notas

Este trabajo forma parte de la tesis doctoral del primer autor.

* Sigma–aldrich, Estados Unidos de América.

** Sigma–aldrich, Estados Unidos de América.

*** Sigma–aldrich, Estados Unidos de América.

**** Sigma–aldrich, Estados Unidos de América.

† Sigma–aldrich, Estados Unidos de América.

‡ Millex, Estados Unidos de América.