Artículos científicos

 

Efecto del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en células dendríticas de cerdo derivadas de monocitos

 

Effect of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus on porcine monocyte–derived dendritic cells

 

Lilian Flores–Mendoza* Erika Silva–Campa* Mónica Reséndiz* Verónica Mata–Haro** Fernando A. Osorio*** Jesús Hernández*

 

* Laboratorio de Inmunología, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., Km 0.6, Carretera a la Victoria, 83000, Hermosillo Sonora, México, Apartado Postal 1735, Tel. (01–662) 289–2400, Ext. 294; Fax (01–662) 280–0094.

** Coordinación de Ciencia de los Alimentos, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., Km 0.6, Carretera a la Victoria, 83000, Hermosillo, Sonora, México.

*** Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Nebraska–Lincoln, NE 68583–0905, Estados Unidos de América.

 

Correspondencia:
Jesús Hernández
Correo electrónico: jhdez@ciad.mx

 

Recibido el 31 de octubre de 2007
Aceptado el 1 de septiembre de 2008.

 

Abstract

Dendritic cells (DC) are considered the most important antigen presenting cells of the immune system. Its anatomical location (skin, mucosa and peripheral blood), the expression of receptors to recognize pathogens, the expression of co–stimulatory molecules (CD80/86), the major histocompatibility complex (MHC) class I and II, and the production of cytokines (such as IFN–α, IL–10, IL–12) confers to these cells the characteristic to regulate innate and adaptive immune responses. The objective of this work was to evaluate the effects of the porcine reproductive and respiratory virus (PRRS) in mature DC. DC were generated from blood monocytes using IL–4 and GM–CSF and were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) to induce their maturation. The results show that the expression of CD14 and CD172a molecules in infected DC was not affected, while MHC II and CD80/86 expression was diminished. This decrease seems to affect the allogenic proliferation of lymphocytes stimulated with infected DC. On the other hand, the virus increases mRNA expression of IL–10 and TNF–α, and diminishes that for IL–1 β and IL–6. The results obtained could explain, in part, the immunophatology of the disease.

Key words: dendritic cells, swine, CD80, CD86, MHC–II, RT–PCR.

 

Resumen

Las células dendríticas (DC) son las presentadoras de antígeno más importantes del sistema inmune. Su localización anatómica (piel, mucosas y sangre periférica), la expresión de receptores para reconocer patógenos, la expresión de moléculas de coestimulación (CD80/86), del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clases I y II, y la producción de citocinas (IFN–α, IL–10, IL–12), les confiere una característica única para regular las respuestas inmune innata y adaptativa. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del virus de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en DC maduras. Se generaron células dendríticas a partir de monocitos utilizando IL–4 y GM–CSF y se estimularon con lipopolisacárido (LPS) para inducir su maduración. Los resultados muestran que la expresión de las moléculas CD14 y CD172a no se altera en las DC infectadas, mientras que la expresión de MHC II y CD80/86 se ve disminuida. Esta disminución parece afectar la proliferación alogénica de linfocitos estimulados con DC infectadas. Asimismo, el virus aumenta la expresión del ARNm de IL–10 y TNF–α, y disminuye la de IL–1 β e IL–6. Lo anterior explica, en parte, la inmunopatología de la enfermedad.

Palabras clave: células dendríticas, cerdo, CD80, CD86, MHC–II, RT–PCR.

 

Introducción

Las células dendríticas (DC) son las presentadoras de antígeno más importantes del sistema inmune. Se localizan en todo el organismo, especialmente en los sitios de entrada de antígenos, como la piel y mucosas.^1,2 Las DC capturan, procesan y presentan antígenos en forma de péptidos asociados con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clases I o II;¹ además son capaces de activar a linfocitos T vírgenes e inducir y modular la respuesta inmune.^2–4

En tejidos periféricos, las DC se encuentran en estado inmaduro y tienen la capacidad de capturar y procesar antígenos,⁵ lo cual permite que se activen y migren a órganos linfoides secundarios y adquieran un estado maduro.⁶ Las DC maduras expresan gran cantidad de moléculas de coestimulación, como CD40, CD80 y CD86 y moléculas de presentación de antígenos, como MHC I y II.^6,7 Estas características les confieren la capacidad de estimular linfocitos T. 7^–9 Además, las DC activan otros tipos celulares, incluyendo los linfocitos B, neutrófilos, células NK, entre otras.^10–12 La estimulación y el tipo de respuesta de los linfocitos y otras células dependen del tipo de receptores que expresen las DC, así como del perfil de citocinas que secreten.¹³ En consecuencia, las DC son importantes en la inducción y regulación de la respuesta inmune, y son blanco ideal para los virus, que modulan su capacidad de respuesta ante la infección, lo que conduce a la evasión del sistema inmune.^14,15

Ciertos virus, como el de la inmunodeficiencia humana (VIH), la varicela, el citomegalovirus y el virus del herpes simple tipo I, infectan e incluso se replican en DC. La inmunosupresión que inducen estos virus está mediada, en parte, por la infección y se debe a una disminución en las moléculas de coestimulación, CD80 y CD86.¹⁶ Por el contrario, otros virus, como el de la influenza o dengue, inducen la activación y maduración de las DC y promueven una respuesta inmune eficaz.^17,18

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es un virus envuelto, compuesto de ARN de cadena sencilla, de polaridad positiva, pertenece a la familia Arteroviridae. El virus infecta y se replica en macrófagos alveolares. Durante la primera semana de infección, el sistema inmune produce una fuerte respuesta de anticuerpos, la cual se asocia con una activación policlonal de linfocitos B y alta producción de IL–6^19,20 Sin embargo, a partir de la cuarta semana de infección aparecen los anticuerpos neutralizantes. Asimismo, la respuesta celular se caracteriza por una respuesta tardía de linfocitos T y la aparición de células productoras de IFN–α a la tercera semana de infección, se ha observado que la inmunidad ofrecida por células de memoria aparentemente no es mayor de dos años.^19–21

Se ha demostrado que el virus PRRS infecta y se replica en DC inmaduras derivadas de monocitos.^22–24 Wang et al.²⁴ encontraron que el virus disminuye la expresión de MHC I y II, y altera la capacidad de activar la proliferación alogénica de los linfocitos T. Sin embargo, en un trabajo de Loving et al., ²² aun cuando se observó disminución en la expresión de MHC I, la de CD80/86 no se vio alterada a causa del virus PRRS. En relación con la expresión de citocinas en DC infectadas con el virus PRRS, Wang et al.²⁴ no detectaron cambios en la producción de IL–10, IL–12 o IFN–γ; sin embargo, observaron incremento en la producción de TNF–α después de 48 h de infección. Mientras que Loving et al.²² observaron aumento en la expresión de ARNm de IFN–β a las 18 h de infección, así como disminución en la expresión del ARNm de IFN–α.

Por su parte, Charerntantanakul et al.23 tampoco describieron cambios en la expresión de IL–10 en DC infectadas por el virus PRRS. Sin embargo, encontraron aumento en la expresión de IL–10 en monocitos y reducción en la expresión de IFN–y γ TNF–α en cocultivos de monocitos/linfocitos estimulados con conca–navalina A y PMA/ionomicina.

En este contexto, el objetivo de este trabajo fue analizar el efecto del virus PRRS sobre la expresión de moléculas de coestimulación (CD80/86) y del MHC–II, así como evaluar su capacidad de estimular respuestas alogénicas de linfocitos y la modulación en la producción de citocinas inflamatorias en DC.

 

Material y métodos

Diseño experimental

Se generaron DC a partir de monocitos de cerdos, incubando células adherentes durante siete días en presencia de citocinas recombinantes de cerdo IL–4 y GM–CSF. Al quinto día de cultivo se obtuvieron DC inmaduras (iDC), las cuales se estimularon dos días con LPS para generar DC maduras (mDC). Las mDC se infectaron con el virus PRRS y se evaluó: a) la expresión de marcadores de superficie de CD172a, CD14, MHC II y CD80/86 por citometría de flujo en iDC, mDC y mDC infectadas; b) la expresión de transcritos de citocinas IL–1β, IL–6, IL–10 y TNF–α en mDC infectadas; y c) la capacidad de las DC infectadas para estimular una respuesta alogénica usando células no adherentes marcadas con succinimidil éster diacetato de carboxifluoresceína (CFSE).

Animales de experimentación

Se utilizaron cuatro cerdos de cuatro a seis semanas de edad procedentes de una granja libre de PRRS, enfermedad de Aujezsky, rubulavirus porcino y fiebre porcina clásica. Los animales se alojaron en la unidad metabólica animal del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C (CIAD, A. C.) con agua y alimento ad libitum.

Reactivos

Se utilizaron anticuerpos monoclonales (mAb) de ratón específicos para cerdo anti–CD14,* MHC–II* y CD172a.* Para identificar la expresión de las moléculas de coestimulación CD80/86, se utilizó una proteína de fusión hCTLA4–inmunoglobulina de ratón.** La detección de estos anticuerpos y la proteína de fusión se realizaron con un segundo anticuerpo de cabra anti–IgG de ratón, conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC).*** Se utilizaron las citocinas recombinantes de cerdo IL–4 y GM–CSF† en la diferenciación de células dendríticas.

Virus

El virus PRRS‡ se multiplicó en células MARC–145 preparadas en botellas de cultivo de 25 cm². Las células se cultivaron en medio DMEM complementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 100 UI/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 50 μg/ mL de gentamicina. Las células inoculadas se incubaron a 37°C, 90% de humedad y atmósfera con 5% de CO2. Cuando las células presentaron efecto citopático (a las 48 o 72 h) se sometieron a dos choques térmicos (–80/25°C). Los lisados celulares se cosecharon y clarificaron por centrifugación a 650 g durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante rico en partículas virales se almacenó en volúmenes de 1 mL a –70°C. El mismo procedimiento se aplicó a células sin infectar y el lisado obtenido de estas células fue utilizado como testigo en experimentos posteriores, el cual es llamado mock o testigo, y se refiere a un testigo utilizado en los experimentos, que sirve para determinar los efectos inducidos por las células donde creció el virus y no por el virus per se.²⁵

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos

Se recolectaron de 30 a 40 mL de sangre de la vena cava anterior de cerdo en tubos con heparina. La sangre se mezcló en relación 1:2 con medio DMEM sin SFB y con antibióticos. Las células mononucleares (CMN) se obtuvieron utilizando un gradiente de Ficoll–Hypaque en relación 1:4 y centrifugando a 500 g por 20 min a 4°C. Las CMN fueron resuspendidas en cloruro de amonio durante 5 min para lisar el remanente de eritrocitos (en caso de ser necesario), se lavaron con DMEM sin suero y se centrifugaron durante 10 min a 200 g.²⁶ Finalmente, las CMN se resuspendieron en medio DMEM con 10% de SFB y se cultivaron en cajas de cultivo de 25 cm² a densidad celular de 5 × 10⁶/mL. Se incubaron toda la noche a 37°C y 5% de CO2 para obtener las células adherentes. Las células no adherentes se recolectaron y almacenaron a –70°C para su uso posterior en los ensayos de estimulación alogénica. Las células adherentes se incubaron en medio DMEM en presencia de 20 ng/mL de cada una de las citocinas recombinantes porcinas IL–4 y GM–CSF. Las células se cultivaron durante siete días, con cambios de medio fresco con citocinas al segundo y quinto días de cultivo. Al quinto día de cultivo las células, consideradas células dendríticas inmaduras (iDC), se incubaron con 3 μg/mL de LPS durante dos días más. Después se consideraron células dendríticas maduras (mDC).²⁷

Infección de DC con el virus PRRS

Las DC fueron infectadas con el virus PRRS usando un índice de multiplicidad (moi) de 0.1 durante 1 h a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de humedad. Para eliminar el virus no absorbido, las células se lavaron cuatro veces, se centrifugaron a 200 gpor 5 min. Después se resuspendieron en 0.5 mL de medio fresco y se cultivaron por 24 h a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de humedad.

Evaluación de marcadores de superficie

Se utilizaron 2.5 × 10⁵ DC/mL, las cuales se incubaron en presencia de un mAb anti–CD14, MHC II o anti–CD172a y con la proteína de fusión que reconoce CD80/86 durante 20 min a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 1 mL de solución amortiguadora de fosfatos con albúmina bovina al 1% (PBA–1%) en frío. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo conjugado durante 20 min a 4°C en oscuridad y se lavaron dos veces. Finalmente se fijaron con 200 μL de paraformaldehído al 1%, se mantuvieron a 4°C y en oscuridad, hasta su análisis por citometría de flujo en un máximo de 5 días.²⁸

Detección de citocinas porcinas por RT–PCR

Las citocinas porcinas se analizaron en mDC no infectadas e infectadas. Después de 24 h de infección, las mDC infectadas y las no infectadas se lavaron una vez con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) y fueron resuspendidas en TRIzol para la extracción de ARN siguiendo las especificaciones del fabricante.* El ARN fue resuspendido en 20 μL de agua DEPC.**. Para el análisis de citocinas se hizo una transcripción reversa usando la enzima Superscript II reverse trans–criptase*** en un volumen total de 20 μL, siguiendo las especificaciones del fabricante. El ADN complementario fue almacenado a –20 °C hasta su uso en las reacciones de PCR. Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen final de 50 μL usando 10 mM Tris HCl, 50 mM KCl (pH 8.3), 2.5 mM MgCl2, 1 mM de cada nucleótido, dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 30 uM de cada iniciador (Cuadro 1), 0.25 U Taq DNA polimerasa† y 2 μL de ADN complementario. La reacción de PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 35 ciclos a 94°C por 3 min, 94°C por 30 seg, 55°C por 30 seg, 72°C por 1 min y una elongación final a 72°C por 10 min. Los productos de la PCR (10 μL) se corrieron en geles de agarosa al 1.2% y se tiñeron con bromuro de etidio. Para estimar el nivel de expresión de ARNm de cada citocina, los productos de PCR se semicuantificaron comparando el valor de intensidad de las bandas mediante un análisis densitométrico y se normalizaron con los valores obtenidos de un gen constitutivo (GADPH). Los resultados se presentan como la relación citocina/GADPH.

Ensayo de estimulación alogénico

Las células no adherentes se tiñeron con 0.1 μM de CFSE durante 10 min a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad. Posteriormente, el exceso de CFSE se inactivó con medio RPMI con 10% de SFB. Las células no adherentes (5 × 10⁵) se cocultivaron con mDC infectadas y no infectadas en una relación de mDC/linfocito 1:10 durante cinco días. Al quinto día de cultivo, las células se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de proliferación se determinó con el programa WinMDI 2.8.

Análisis estadístico

Para identificar diferencias significativas entre mDC no infectadas e infectadas y entre inmaduras, maduras y maduras infectadas, se realizó la prueba Mann Whytney. Para ello se utilizó el paquete estadístico SigmaSTAT versión 3.1, considerando una P < 0.05 como estadísticamente significativa.

 

Resultados

Morfología de las células dendríticas de cerdo

Después de eliminar las células no adherentes y antes de estimular la diferenciación a DC, las células adherentes (día 0) tienen un aspecto redondeado y pequeño (Figura 1a). Resultados obtenidos en el laboratorio han confirmado que más de 95% de las células adherentes expresan el marcador CD14 (datos no mostrados). Al quinto día de incubación en presencia de IL–4 y GM–CSF (Figura 1b), las células adherentes adquieren una morfología de células alargadas, con proyecciones. Cuando estas células se estimularon durante 48 h con LPS, se observó un cambio en su morfología y muchas se desprendieron. El estímulo con LPS provocó que las células con morfología de DC se desprendieran y se observaran flotando (Figura 1c).

El virus PRRS regula la expresión de ciertos marcadores de superficie en DC

Para confirmar que las características morfológicas descritas corresponden al fenotipo iDC y mDC, se determinó la expresión de la molécula de coestimulación CD80/86 y de la molécula de presentación MHC–II. También se determinó la expresión de las moléculas CD172a y CD14. Adicionalmente, se determinó el efecto del virus PRRS en la expresión de estas moléculas después de 24 h de infección. La expresión de CD172a, un marcador de células mieloides, como se esperaba, se mantuvo constante en iDC, mDC y mDC infectadas (85% de células positivas), con intensidad media de fluorescencia (IMF) de 40. Los resultados obtenidos para la expresión de CD14 muestran que no existe diferencia significativa (P > 0.05) entre el porcentaje de células positivas ni en la IMF de las iDC, mDC y mDC infectadas (Figuras 2a y 2b). En el caso del MHC II no hubo diferencias significativas (P > 0.05) en el porcentaje de células entre las iDC y mDC, pero sí un incremento significativo (P < 0.05) en el IMF en las mDC respecto de las iDC (Figuras 2a y2b). En las mDC infectadas se observó una disminución significativa (P < 0.05) en el porcentaje de células positivas (25%) y en el IMF (aproximadamente 40). El porcentaje de células que expresan CD80/86 y el IMF aumentó significativamente cuando se indujo la maduración de las DC (en 50% y 10%, respectivamente; P < 0.05). En las mDC infectadas con el virus PRRS, el porcentaje de células positivas disminuyó significativamente (en 10%; P < 0.05), no así para el IMF (Figuras 2a y 2b).

El virus PRRS disminuye la proliferación alogénica en las células no adherentes

Se evaluó la proliferación de células no adherentes estimuladas con mDC sin infectar y mDC infectadas durante 24 h, para determinar la capacidad de estimular respuestas alogénicas por parte de las DC infectadas. Los resultados de los cocultivos (mDC/células no adherentes) mostraron que el virus PRRS provocó una disminución en 50% (P < 0.05) de la proliferación respecto de las DC sin infectar (Figura 3).

La infección con el virus PRRS modula la expresión de citocinas en mDC

Se evaluó la producción de citocinas proinflamatorias (IL–1β, IL–6, TNF–α) y la citocina anti–inflamatoria IL–10, en mDC infectadas con el virus PRRS para determinar si éste es capaz de modular la producción de este tipo de citocinas. Los resultados obtenidos muestran que en las citocinas proinflamatorias hubo una disminución no significativa en la expresión de IL–1–β IL–6 en mDC infectadas respecto de las tratadas con el testigo. Por el contrario, se observó aumento no significativo en la expresión de TNF–α en DC infectadas, respecto de las tratadas con mock o testigo (Figura 4). En la IL–10 se observó un aumento significativo (P < 0.05) en las mDC infectadas respecto de las tratadas con el mock o testigo (Figura 4).

 

Discusión

Los primeros registros sobre la generación de DC en el cerdo se hicieron en 2001,^3,27 pero en los últimos años estos informes han ido en aumento.^3,27,29–36 La ventaja de contar con esta metodología abrió la posibilidad de analizar la interacción de las DC con diferentes virus, como con el virus PRRS, y entender mediante esta relación la inmunopatología de la enfermedad. En estudios previos realizados por este grupo de trabajo, se demostró que las DC son susceptibles al virus PRRS,³⁷ lo cual concuerda con los trabajos publicados por Charerntantarakul et al.,²³ Wang et al.²⁴ y Loving et al.²² Aquí se obtuvieron DC derivadas de monocitos, las cuales se infectaron con el virus PRRS para determinar cómo se alteran sus funciones por efecto del virus. Se encontró que el virus no modifica la expresión de CD14 y CD172a, mientras que disminuye la expresión de CD80/86 y MHC II. Estos resultados coinciden con la baja estimulación alogénica de células T encontrada. Además el virus PRRS afectó la producción de citocinas, disminuyendo la expresión de ARNm de IL–6 e IL–1 (P > 0.05), y aumentando la expresión del TNF–α e IL–10 (sólo el aumento de IL–10 fue significativo, P < 0.05).

Al quinto día de cultivo, las células adherentes estimuladas con IL–4 y GM–CSF, adquirieron una morfología de células alargadas, con proyecciones similares a las del fenotipo descrito para las iDC en cerdo y otras especies.¹⁰ Después de la estimulación con LPS, se observó cambio en su morfología. Las células se desprendieron de la superficie y se observaron flotando. En este caso, el efecto del LPS supone que las células han dejado el fenotipo inmaduro y pasaron a ser células dendríticas maduras.^38–40 Para confirmar que las características morfológicas descritas corresponden al fenotipo iDC y mDC, se determinó la expresión de ciertos marcadores de superficie (CD80/86, MHC II, CD172a y CD14). Estas moléculas también fueron evaluadas en mDC infectadas para determinar el efecto del virus en la expresión de ellas. El virus PRRS no afectó la expresión del marcador CD172a, lo cual era natural pues esta molécula se expresa en monocitos/ macrófagos, granulocitos y células dendríticas, y su expresión no está modulada por la infección.⁴¹

En este contexto, el CD14 es expresado en mono–citos y macrófagos, aunque existe controversia en su expresión en DC, pues en las DC de origen humano y murino, disminuye su expresión cuando se induce su maduración.⁴² Mientras que en el cerdo Foss et al.⁶ encontraron disminución en la expresión de esta molécula, Carrasco et al.2⁷ no observaron cambio en la expresión. Estas diferencias pueden deberse a la concentración de citocina utilizada en la diferenciación, incluso por el sistema de expresión de alguna de las citocinas, o de la clona del anticuerpo utilizado. En ciertas ocasiones la expresión del CD14 en las células dendríticas se mantiene incluso después de su infección, como en el caso del virus de la estomatitis vesicular (VSV) y virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGFV).^27,30 Esto último coincide con lo encontrado aquí, ya que no se observaron diferencias significativas (P > 0.05) entre el porcentaje de células positivas y en el IMF, de las iDC, mDC y mDC infectadas. Sin embargo, es necesario resaltar que en este estudio el porcentaje de células positivas fue muy bajo, alrededor de 7%, con un IMF de 15. Estos resultados se podrían explicar por la manera en que se indujo la maduración de las DC, ya que la expresión de CD14 está regulada por la concentración de LPS utilizada para inducir la maduración. Entre más baja sea la concentración de LPS, disminuye la expresión de CD14, lo que podría explicar la baja expresión de esta molécula en las DC generadas, ya que la concentración de LPS utilizada fue baja.^30,38,39

En el caso del MHC II no hubo aumento en el porcentaje de células positivas entre las iDC y mDC, pero sí en el IMF entre ambas. Lo anterior sugiere que sólo la estimulación con LPS aumenta el número relativo de esta molécula en las mDC.^6,13,39 El virus PRRS disminuyó significativamente el porcentaje de células positivas y el IMF. Por ello se puede suponer que el virus regula la expresión del MHC II y así podría evadir la respuesta inmune, como el virus de la varicela zoster o el de la hepatitis C.^16,17 Resultados similares han sido descritos por Wang et al.²⁴ en la expresión del MHC II utilizando el virus PRRS a un moi de 1.

En el caso del CD80/86, el porcentaje de células aumentó al inducir la maduración, de forma similar a trabajos previos.^2,6,13,27 Mientras que el virus PRRS disminuyó significativamente el porcentaje de células que expresan estas moléculas. Esta expresión baja de moléculas de presentación y coestimulación se refleja en la baja capacidad de las mDC infectadas para promover la proliferación de linfocitos, pues ésta disminuyó significativamente (P < 0.05) respecto de los cocultivos donde se utilizaron DC tratadas no infectadas. Respuestas similares se observan con virus como el de la varicela zoster, herpes simple, o virus de la hepatitis tipo C.^43,44

Lo anterior concuerda con los datos de Loving et al.,²² sólo que ellos usaron DC tratadas con PolyIC en lugar de DC no infectadas. Por otra parte, nuestros resultados de proliferación difieren de los publicados por Wang et al.,²⁴ ya que no encontraron diferencias significativas entre DC no infectadas e infectadas. Estas discrepancias se pueden deber a la cepa del virus utilizado, la concentración de éste y el tiempo de infección de las DC. Con base en lo anterior, se puede suponer que el virus PRRS provoca que las DC no sean capaces de presentar antígenos y coestimular correctamente a los linfocitos T, siendo ésta una vía para modular la respuesta inmune. Para apoyar esta hipótesis, se analizó la capacidad de las DC infectadas para estimular respuestas alogénicas. Los resultados indican que la proliferación de linfocitos disminuye cuando se estimulan mDC infectadas, como resultado de la baja expresión de moléculas de MHC y coestimulación que induce el virus PRRS, que concuerda con lo notificado por Wang et al.²⁴ pero difiere de lo publicado por Lovinget al.,²² quienes no encontraron cambios en la proliferación entre células infectadas. Ellos utilizaron DC aisladas de pulmón, que no son infectadas por el virus PRRS, lo cual podría explicar, en parte, que no encuentren disminución en la expresión de estas moléculas ni en la proliferación.

Una parte importante de la función de las células dendríticas es la producción de citocinas para inducir la diferenciación de los linfocitos T. Cuando las DC sintetizan IL–12 y expresan moléculas CD80/86, promueven la diferenciación de células Th1. Por el contrario, si las DC sintetizan IL–10 y expresan bajos niveles de CD80/86, se estimulará la diferenciación de células Th2. La baja expresión de CD80/86, síntesis de IL–10 y TGF–β, inducirá la generación de linfocitos T reguladores (Treg) .⁴⁵ En este estudio se evaluó la producción de citocinas pro–inflamatorias (IL–1, IL–6, TNF–α) y la citocina antiinflamatoria IL–10 en mDC infectadas para determinar si el virus es capaz de modular la producción de citocinas. Se observó aumento significativo (P < 0.05) en la expresión de transcritos de IL–10 en mDC infectadas respecto de las tratadas con el testigo (testigo sin infectar). Lo anterior concuerda con los resultados encontrados por este grupo de trabajo para mDC, en donde sólo éstas y no iDC, son capaces de producir IL–10.⁴⁶

Respecto de los resultados de las citocinas inflamatorias IL–1 e IL–6, se observó disminución no significativa para ambas citocinas, mientras que en la expresión de TNF–α se observó aumento no significativo. Estos resultados concuerdan parcialmente con Wang et al.,²⁴ quienes describen aumento en la producción de TNF–α; sin embargo, no detectan incremento en la expresión de IL–10. Estas diferencias se podrían deber a que ellos utilizaron ELISA para determinar la IL–10, y en el presente trabajo se analizó a través de RT–PCR convencional. Asimismo, Charerntantanakul et al. no encontraron aumento en la expresión de IL–10, sólo cuando utilizaron cocultivos de monocitos/linfocitos; sin embargo, en este caso no es posible discriminar entre monocitos y linfocitos como fuente de la IL–10.

La IL–10 es una citocina capaz de modular la respuesta de las DC contra virus debido a que inhibe a la producción de IL–12,⁴⁷ y así puede comprometer la diferenciación de linfocitos a Th 1, esenciales en una respuesta antiviral.⁴⁸ Además, la IL–10 producida por las DC durante la activación y diferenciación de los linfocitos, genera células Treg, inhibiendo con esto la respuesta inmune.⁴⁵ La IL–10 también regula la expresión de las citocinas inflamatorias como IL–1, IL–6, TNF–α, afectando la respuesta inflamatoria.²³ Disminuye la expresión de moléculas de coestimulación y MHC, induciendo disminución en la presentación de antígenos y una nula respuesta inmune.⁴³ De acuerdo con los altos niveles de transcritos de IL–10 encontrados en mDC infectadas, es posible que por este mecanismo el virus PRRS suprima la respuesta inmune y sea un mecanismo de evasión. Lo anterior podría ayudar a explicar la inmunopatología de la enfermedad, pues al modular la respuesta de DC, mediante altos niveles de IL–10, combinados con la baja expresión de moléculas de presentación y coestimulación, el virus PRRS estaría modulando, en parte, la respuesta inmune contra sí mismo.

En conclusión, este trabajo muestra que el virus PRRS modula la expresión del CD80/86 y el MHC II, y disminuye la proliferación en las células no adhe–rentes. En cuanto a la función de las mDC, el virus PRRS aumentó la expresión del ARNm de IL–10 en mDC infectadas.

 

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Fondos Sectoriales SEP–Conacyt (Proyecto 43602) y por USDANRICGP (Proyecto 005–01810). Lilian Flores Mendoza y Erika Silva Campa fueron becarias del Conacyt, de México.

 

Referencias

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Notas

* VMRD, Estados Unidos de América.

** Ancell, Estados Unidos de América.

*** Southern Biotech, Estados Unidos de América.

† Biosource Internacional, Estados Unidos de América.

‡ GenBank AF299398.

* Invitrogen, Estados Unidos de América.

** Invitrogen, Estados Unidos de América.

*** Invitrogen, Estados Unidos de América,

† lnvitrogen, Estados Unidos de América.