Notas de investigación

 

Los productos de excreción–secreción de Fasciola hepatica disminuyen la producción de células productoras de anticuerpos contra antígenos timodependientes en ratones

 

The Fasciola hepatica excretory–secretory products reduce the production of cells producing antibodies against thymus–dependent antigens in mice

 

Carlos Ramón Bautista Garfias* Adriana Lebrija Rodríguez*

 

*Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Km 11.5, Carretera Federal Cuernavaca–Cuautla, 62550, Jiutepec, Morelos, México.

 

Recibido el 18 de octubre de 2007
Aceptado el 18 de agosto de 2008.

 

Abstract

The aim of the present study was to evaluate the effect of adult Fasciola hepatica excretion–secretion products administered intraperitoneally (ip) to NIH mice, on the number of cells producing antibodies against sheep erythrocytes (thymus dependent antigen). Thirteen mice were distributed at random into two groups which were treated ip, daily during seven days, with either phosphate buffered saline (Group I: PBS, n = 6) or excretion–secretion products of adult Fasciola hepatica (Group II: ESP_Fh, n = 7). At day eight, each mouse in both groups was immunized ip with sheep erythrocytes and four days later, the number of plaque–forming cells (PFC) in a suspension of spleen cells per each mouse was recorded. The mean number (± SEM) of PFC obtained in the group PBS was significantly higher (72 ± 10; P < 0.01) than the value observed in the group ESP_Fh (27 ± 9). The results indicate that ESP_Fh induce immunosupression to thymus–dependent antigens in mice.

Key words: Fasciola hepatica Excretion–Secretion Products, Immunosuppression, NIH Mice.

 

Resumen

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de los productos de excreción–secreción de Fasciola hepatica adulta administrados vía intraperitoneal (ip) a ratones NIH, sobre el número de células productoras de anticuerpos contra eritrocitos de borregos (antígeno timodependiente). Trece ratones fueron distribuidos al azar en dos grupos que fueron tratados ip, diariamente durante siete días, ya sea con solución salina amortiguadora de fosfatos (Grupo I: SSAF, n = 6) o con productos de excreción–secreción de Fasciola hepatica adulta (Grupo II: PES_Fh, n = 7). Al día ocho, cada ratón en ambos grupos fue inmunizado vía ip con eritrocitos de borrego y cuatro días más tarde se determinó el número de células formadoras de placa (CFP) en una suspensión de células del bazo de cada ratón. El número promedio (± EEM) de CFP obtenido en el grupo SSAF fue significativamente más alto (72 ± 10; P < 0.01) que el valor observado en el grupo PES_Fh (27 ± 9). Los resultados indican que los PES_Fh inducen inmunosupresión a antígenos timodependientes en ratones.

Palabras clave: Productos de Excreción–Secreción de Fasciola hepatica, Inmunosupresión, Ratones NIH.

 

Introducción

A la infección producida por el trematodo Fasciola hepatica en los ganados vacuno y ovino se le conoce como fasciolosis, enfermedad que provoca pérdidas anuales por dos mil millones de dólares.¹ Este padecimiento, de importancia en seres humanos,^2,3 puede incrementarse por los cambios climáticos (por ejemplo, el calentamiento global). El control de la fasciolosis se lleva a cabo principalmente por medio de antihelmínticos; sin embargo, el parásito ha desarrollado resistencia a éstos,⁴ por lo que se requiere de medidas alternas de control, entre éstas se ha propuesto el desarrollo de vacunas,⁵ para lo cual se requiere conocer la respuesta inmunitaria del portador contra el parásito, así como los mecanismos que utiliza el trematodo para evitarla. En este sentido, se ha demostrado que F. hepatica altera la respuesta inmunitaria de bovinos,⁶ ovinos^7–9 y ratones.^10–13 Con base en la utilidad que ha mostrado el uso de ratones para estudios de inmunología de la fasciolosis^10–13 y en la relativa facilidad de ejecución de la prueba de células formadoras de placas hemolíticas (CFP),^14,15 para la detección de células productoras de anticuerpos en la respuesta inmunitaria primaria, se decidió llevar a cabo el presente estudio, en el que se determinó el efecto de los productos de excreción–secreción de F. hepatica adulta (PES_Fh), inoculados en ratones NIH, sobre la producción de CFP a eritrocitos de borrego (antígeno timodependiente).

 

Animales

En el estudio se usaron ratones NIH, hembras de dos y tres meses de edad, con peso promedio de 20 g. Luego, bajo condiciones adecuadas de bioterio, se alojaron en jaulas de acrílico con aserrín esterilizado y se les dio alimento comercial y agua ad libitum.

 

Parásitos

Se recolectaron ejemplares adultos íntegros de Fasciola hepatica a partir de hígados de bovinos con fasciolosis, sacrificados en el rastro, y luego se procedió a lavarlos varias veces con solución salina amortiguadora de fosfatos estéril (SSAF), de acuerdo con Bautista y Morilla.¹⁶

 

Productos de excreción–secreción de F. hepatica adulta (PES_Fh)

Luego de recolectar las fasciolas adultas íntegras y limpias, se procedió a preparar los PES_Fh utilizando solución de Hedon–Fleig, según lo descrito por Bautista y Morilla.¹⁶ Al obtenerse los PES_Fh se determinó el contenido de proteína por medio de Lowry et al. ¹⁷

 

Eritrocitos de borrego (EB)

Se recolectaron EB en solución de Alsever y se mantuvieron a 4°C hasta su uso.

 

Determinación de células formadoras de placas hemolíticas (CFP)

Se siguió el método descrito por Cunningham y Szenberg.¹⁵ Brevemente se formaron tres áreas de igual tamaño sobre una laminilla de microscopio (75 x 25 mm) con cinta adhesiva de dos caras. Luego, tres cubreobjetos limpios (22 mm cuadrados) se presionaron firmemente sobre la cinta para formar tres cámaras huecas. Posteriormente se preparó una mezcla de las células del bazo junto con complemento (dilución final del suero de cuye 1:10) y eritrocitos de borrego (a concentración final aproximada de 4 x 10⁸/mL). A continuación se adicionó la mezcla por medio de una pipeta por un lado de las cámaras que fueron luego selladas con parafina caliente. Se permitió que las células se asentaran en el fondo de las cámaras al colocarlas en posición horizontal para formar una monocapa. Enseguida se incubó a 37° C en una estufa de CO₂ durante 45 minutos y luego se llevó a cabo la lectura para determinar el número de placas hemolíticas en un microscopio óptico compuesto usando el objetivo seco débil.

 

Diseño experimental

Trece ratones NIH fueron distribuidos al azar en dos grupos: los del Grupo I (n = 6) fungieron como testigo y recibieron SSAF por vía ip diariamente durante siete días. En el Grupo II (n = 7) cada ratón fue inoculado diariamente por siete días por vía ip con 100 ug de productos de excreción–secreción de Fasciola hepatica adulta (PES_Fh). En el octavo día todos los ratones de ambos grupos fueron inmunizados por vía ip con 0.2 mL de eritrocitos de borrego al 10%/ratón. Cuatro días después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados humanitariamente para extraerles el bazo, con el fin de preparar una suspensión celular en medio 199 para determinar el número de células formadoras de placa (CFP), de acuerdo con la técnica de Cunningham,¹⁵ que se llevó a cabo por triplicado/ animal. Con los datos obtenidos se practicó un análisis de varianza y cuando hubo diferencias, éstas fueron sometidas a la prueba de Tukey.¹⁸

Los resultados indicaron que el tratamiento de ratones con productos de excreción–secreción de Fasciola hepatica adulta (PES_Fh) redujo significativamente el número de CFP en comparación con el grupo testigo tratado con SSAF (P < 0.01) (Figura 1). El número promedio (+ EEM) de CFPH fue de 72 ± 10 para el grupo tratado con SSAF y de 27 ± 9 para el grupo tratado con PES_Fh (Figura 1). Asimismo, los resultados señalan que los PES_Fh en ratones reducen la formación de CFP a antígenos timodependientes en la respuesta inmunitaria primaria, en este caso EB y son consistentes con la observación de que el tratamiento ip de ratones tratados con un antígeno de F. hepatica adulta suprime la respuesta contra Bordetella pertussis (también un antígeno timodependiente);¹¹ similarmente, ovinos infectados con F. hepatica han presentado respuestas de anticuerpos significativamente más bajas a eritrocitos de pollo en comparación con testigos no infectados.⁸ En este sentido, estudios en ratones indican que la thioredoxin–peroxidasa contenida en los productos de excreción–secreción de F. hepatica induce la activación alterna de macrófagos, ello contribuye, entre otras causas, a que haya respuestas tipo Th2¹³ y se supriman las respuestas tipo Th1.¹² Esas observaciones y las obtenidas en el presente trabajo sugieren que la respuesta protectora inducida por la inoculación ip de adyuvante completo de Freund en ovinos, siete días antes de la infección con F. hepatica,^19,20 genera una respuesta tipo Th1 que influye en dicha protección. De acuerdo con los resultados del presente trabajo, se concluye que la prueba de CFP resultó adecuada para demostrar la inmunosupresión inducida por los PES_Fh en ratones. Dicha técnica, además de sencilla y barata, también se puede utilizar para llevar a cabo estudios de la respuesta inmunitaria con otras infecciones parasitarias en modelos de laboratorio e inclusive en ovinos, puesto que la prueba se ha adaptado para la determinación de células formadoras de anticuerpos en nódulos linfáticos y linfa de esta especie.²¹

 

Referencias

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