Artículos científicos

 

Patogenia de Salmonella enteritidis FT 13a y Salmonella enteritidis biovar Issatschenko en pollos de engorda

 

Pathogenesis of Salmonella enteritidis PT 13a and Salmonella enteritidis biovar Issatschenko in broiler chickens

 

Griselda Ruiz Flores* Fernando Constantino Casas** José Antonio Quintana López* Carlos Cedillo Peláez** Odette Urquiza Bravo*

 

* Departamento de Producción Animal: Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

** Departamento de Patología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

 

Recibido el 5 de julio de 2006
Aceptado el 8 de enero de 2008.

 

Abstract

The objective of this study was to determine Salmonella enteritidis phage type 13a (SE PT 13a) and Salmonella enteritidis biovar Issatschenko phage type 6a (SI) pathogenesis in 4 days old broiler chickens. Twenty–eight birds per treatment were inoculated with a dose of 1x10⁸ (SE PT 13a) and 1x10⁹ (SI), respectively, and fourteen chickens were inoculated with physiological saline solution (PSS) as negative controls. Samples from liver, spleen, heart, lung, crop, duodenum, jejunum, ileum and blind guts were taken during fourteen different times postinfection (6, 18, 30, 42, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246 and 270 hours postinfection (hpi) in order to obtain Salmonella spp isolation for bacteriological, histopathological and ultrastructural examination. During the first week, some depressed birds were observed, and the second week birds were found with yolk sac retention in both treatments. SE PT 13a was isolated at 18, 30, 42, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 246 and 270 hpi from all organs previously described. SI was isolated at 42, 150, 174 and 222 hpi, from crop, jejunum, ileum and blind gut samples. Ileum was the main organ where more frequently SE PT 13a and SI were isolated. There was no mortality in either treatments. Histopathology revealed inflammation, coagulative necrosis, congestion and hemorrhages in gastrointestinal tract (GIT) and visceral organs since 6 hpi in both treatments, with lesions from mild to severe. Ultrastructurally changes in enterocytes' cytoplasm: degeneration, necrosis, invasion and penetration of SE PT 13a and SI were observed. Results of this research showed the ability of SE PT 13a as well as SI to penetrate and invade enterocytes in experimentally infected broiler chicken, demonstrating that SI is able to infect broiler chickens and not only Muridae family.

Key words: Pathogenesis of Salmonella, Isolation of Salmonella, Salmonella in Broiler Chickens.

 

Resumen

El objetivo del presente estudio fue determinar la patogenia de Salmonella enteritidis fagotipo 13a (SE FT 13a) y de Salmonella enteritidis biovar Issatschenko fagotipo 6a (SI) en pollitos de engorda de cuatro días de edad. Veintiocho aves por tratamiento fueron inoculadas con dosis de 1 x 10⁸ (SE FT 13a) y 1 x 10⁹ (SI), respectivamente, y 14 pollitos fueron inoculados con solución salina fisiológica (SSF), como testigos negativos. Se tomaron muestras de hígado, bazo, corazón, pulmón, buche, duodeno, yeyuno, íleon y ciegos durante 14 tiempos posinfección (6, 18, 30, 42, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246 y 270 horas posinfección (hpi)), para realizar el aislamiento bacteriológico de Salmonella spp, exámenes histopatológico y ultraestructural. Durante la primera semana, se observó que algunas aves estaban deprimidas, y en la segunda semana se encontraron aves con retención de saco vitelino en ambos tratamientos. Se aisló SE FT 13a a partir de las 18, 30, 42, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 246 y 270 hpi, en todos los órganos previamente descritos. SI fue aislada a las 42, 150, 174 y 222 hpi de muestras de buche, yeyuno, íleon y ciegos. El íleon fue el órgano de donde se aisló SE FT 13a y SI con mayor frecuencia. No se registró mortalidad en ningún tratamiento. El examen histopatológico reveló inflamación, necrosis coagulativa, congestión y hemorragias en tracto gastrointestinal (TGI) y órganos viscerales a partir de las 6 hpi en ambos tratamientos, con grados de lesión de leve a severo. Ultraestructuralmente se observaron cambios en el citoplasma celular de enterocitos: degeneración, necrosis, invasión y penetración de SE FT 13a y SI. Los resultados de la presente investigación evidenciaron la capacidad de SE FT 13a y SI para penetrar e invadir enterocitos de los pollitos infectados experimentalmente, demostrando que SI es capaz de infectar pollos de engorda y no sólo a la familia Muridae.

Palabras clave: Patogenia de Salmonella, Aislamiento de Salmonella, Salmonella en Pollos de Engorda.

 

Introducción

Desde principios de 1980 se produjo un aumento mundial de casos de infecciones por Salmonella enterica serotipo enteritidis (SE), lo que produjo incremento de estas infecciones en el humano y en aves comerciales, provocando pérdidas económicas en la industria avícola.^1,2

Mientras que la mayoría de los estudios sobre la patogénesis de Salmonella spp se enfocaron en Salmonella typhimurium, la patogénesis de SE ha sido muy poco investigada, aunque estos últimos años SE ha superado a S. typhimurium como el serotipo más común registrado en Estados Unidos de América. En Europa y Estados Unidos se han identificado, entre otros, los fagotipos 4, 6, 8, 13a y 14b de SE como los más importantes actualmente.³

Estudios previos han demostrado alta susceptibilidad a infecciones por Salmonella en pollos recién nacidos, lo cual disminuye su rendimiento durante las primeras semanas de vida.⁴ Son escasas las descripciones de lesiones macroscópicas y microscópicas después de la infección experimental de pollos con SE en aves. En 1974, Turnbull y Snoeyenbos describieron lesiones en pollos infectados con cepas de SE, pero el fagotipo no fue identificado. Este estudio se realizó antes de que las infecciones por SE aumentaran en el mundo. Gorham et al. realizaron un estudio sobre persistencia de SE FT 13a en pollitos infectados al primero y séptimo días de edad; también en 1994, Gorham et al. describieron lesiones producidas en pollitos libres de patógenos (SPF), infectados oralmente al primero y séptimo días de edad con SE FT 13a, por ello es necesario generar información actual sobre la virulencia y patogenia de Salmonella spp en la industria avícola.

Así como en la avicultura actual se ha registrado el aumento de S. typhimurium y S. enteritidis, se ha observado también que las ratas llevan más frecuentemente esos serotipos, por lo que son de las más estudiadas en todo el mundo.⁸ La salmonelosis en ratas puede ser un serio problema porque éstas actúan como reservorios y vectores al tener convivencia estrecha con aves de corral. En la literatura, S. enteritidis biovar Issatschenko, Danysz, Gaertner, Liverpool, Ratin, Projorov, se consideran como sinónimos de S. enterica variedad 17 F4, subgrupo 1, grupo D, que matan a múridos. Según la clasificación de Kauffmann–White, SE pertenece al grupo D, subgrupo 1 con antígenos O: 1, 9, 12 y H: g, m; este serotipo afecta a todas las especies animales, incluyendo el humano.^9–12 Al respecto, Salmonella enteritidis biovar Issatschenko (SI) presenta nomenclatura similar (O: 1, 9, 12 y H: g, m), con la diferencia de que contiene antígenos flagelares en fase 2; 1,7, la descarboxilación a la lisina es negativa y la fermentación de rhamnosa es positiva.¹³

Debido a la posibilidad de poner en riesgo la sanidad aviar y la salud pública, dichos antecedentes muestran la necesidad de generar información sobre la patogenia de Salmonella spp en aves, por eso el objetivo de este trabajo fue demostrar y determinar la patogenia de Salmonella enteritidis fago tipo 13a (SE FT 13a) y SI en pollos de engorda.

 

Material y métodos

Se empleó una cepa de SE FT 13a para el tratamiento 1, y otra cepa de SI para el tratamiento 2, que fueron obtenidas del Laboratorio de Bacteriología del Departamento de Producción Animal: Aves, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Las cepas de SE FT 13a y SI se sembraron por separado en caldo infusión cerebro–corazón (Brain Heart Infusion, por sus siglas en inglés, BHI) y se incubaron 18 horas a 37°C. Las cepas se centrifugaron a 1 000 g¹ durante 60 minutos a 4°C. El sobrenadante de cada cepa fue desechado y se depositó en su lugar solución amortiguadora de fosfatos (PBS) para resuspender las pastillas de bacterias, luego se centrifugó durante 60 minutos a 4°C. El mismo procedimiento se repitió una vez más. Después del último lavado, la cepa de SI se ajustó con PBS a concentración final de 1 x 10⁹ UFC/mL (unidades formadoras de colonia/mililitro) y SE FT 13a a concentración de 1 x 10⁸ UFC/mL, para su posterior inoculación vía oral en los pollitos.

 

Diseño del experimento

En el presente estudio se utilizaron 75 pollitos de engorda estirpe Ross, de un día de edad. El primer día se analizaron muestras de órganos y heces de cinco pollitos para descartar presencia de Salmonella spp, utilizando métodos de cultivo estándar (Norma Oficial Mexicana NOM–005–ZOO–1993). El estudio se inició al cuarto día y se distribuyeron los pollitos en tres tratamientos, con repetición para los tratamientos 1 y 2. El tratamiento 3 constó de un solo grupo de 14 pollitos; el tratamiento 1 integró dos grupos, de 14 pollitos cada uno. A cada pollito de estos dos grupos se le administró suspensión de 250 µL vía oral con concentración de 1 x 10⁸ UFC/mL de SE FT 13a como dosis única. El tratamiento 2 también constó de dos grupos (14 pollitos en cada grupo), a cada pollito se le administró suspensión de 250 µL vía oral con concentración de 1 x 10⁹ UFC/mL de SI como dosis única. Por último, el tratamiento 3, o sea un grupo de 14 pollitos que fungió como testigo negativo al cual se le administró 250 µL de solución salina fisiológica (SSF) vía oral. Posteriormente, a todos los pollitos se les dio alimento comercial y agua ad libitum. El experimento duró 12 días y diariamente se registró el estado clínico y mortalidad de los pollitos.

 

Toma de muestras

Un pollo de cada grupo por tratamiento fue sacrificado humanitariamente (NOM–033–ZOO–1995) a las 6, 18, 30, 42, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246 y 270 horas posinoculación. Antes del sacrificio de cada uno de los pollitos se tomó 1 mL de sangre con anticoagulante ácido etilen–diamino–tetraacético (EDTA), para realizar el conteo de leucocitos. Finalmente, cada 24 horas posinoculación, se tomaron muestras de heces (1 g) con el propósito de realizar análisis bacteriológicos.

Para los análisis bacteriológicos, histológico y ultraestructural, se tomaron asépticamente muestras de buche, corazón, pulmón, hígado, vesícula biliar, bazo, duodeno, yeyuno, íleon y ciego. Cada muestra se dividió en tres porciones. Durante la necropsia se registraron las lesiones macroscópicas de los pollos de todos los tratamientos.

 

Análisis bacteriológico

Las muestras de órganos y heces obtenidas para el aislamiento de SE FT 13^* y SI se depositaron en bolsas de plástico asépticas y se maceraron en un mortero. Se realizó análisis bacteriológico cualitativo, que consistió en sembrar cada una de las muestras en agar soya tripticasa^** (TSA, por sus siglas en inglés), agar verde brillante^***(AVB) y en Chromagar^**** (CHR), luego se incubaron a 37°C (18 horas) para permitir el desarrollo bacteriano.^16,17 También se realizó el análisis bacteriológico cuantitativo, que consistió en depositar las muestras de órganos macerados y heces en caldo tetrationato (CT),^***** para realizar diluciones decuples (1:10) en PBS, sembrando tres gotas de 20 µL en TSA, AVB y CHR, de la dilución 10–1 a 10–6, luego se incubaron 18 horas a 37°C para su lectura. Se contaron las colonias lactosa negativa del AVB y colonias de color blanco mate de CHR, para determinar la concentración de bacterias sospechosas a Salmonella spp. Por último, se realizaron pruebas bioquímicas convencionales, incluyendo lisina descarboxilasa^****** (LD) y Ornitina descarboxilasa^******* (OD) a todas las colonias sospechosas aisladas (NOM–005–ZOO–1993).¹⁶

 

Conteo diferencial de leucocitos

Una vez obtenidas las muestras, se realizó el extendido de sangre sobre un portaobjetos de vidrio, que se tiñó con el colorante de Wright durante tres minutos. Después se aplicó el amortiguador de fosfatos por 10 minutos y luego se enjuagó la preparación con agua corriente, dejando secar al aire. El conteo diferencial se obtuvo con el contador manual para leucocitos, y la observación del extendido sanguíneo con el objetivo 100X.¹⁸

 

Histopatología

Simultáneamente a la toma de muestras para aislamiento bacteriológico, se tomaron muestras de órganos para el examen histopatológico. Las muestras se fijaron en formalina al 10%, amortiguada a pH de 7.2 para su posterior procesamiento según las técnicas convencionales, las muestras se cortaron en el micrótomo a un espesor de 2 a 4 um y se tiñeron por la técnica de hematoxilina y eosina (H & E).¹⁹ Para cuantificar las lesiones se dieron grados; se consideró un grado de lesión leve cuando los cambios patológicos en los órganos en estudio abarcaron hasta 25%, grado moderado de lesión, del 25% a 50%, y grado severo de lesión, del 50% a 100% del órgano afectado.

 

Revisión ultraestructural (microscopía electrónica de transmisión)

Se tomaron secciones de íleon y ciego de 1 a 2 mm2 , las cuales se fijaron por inmersión en glutaraldehído^******** 2.5%, amortiguado en una solución de cacodilato de sodio 0.2 M, pH 7.2, por una hora a 4°C. Una vez fijadas las muestras, se lavaron con la misma solución amortiguadora de cacodilatos, posteriormente se fijó con una solución de tetraóxido de osmio^********* (OsO4) al 1% y se deshidrató con serie ascendente de acetonas^********** (60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%). Después de la deshidratación, se infiltraron con mezcla de resina epóxica,^******* para finalmente incluirse. Los cortes finos fueron de 70 a 80 nm de grosor, se montaron en rejillas de cobre de 200 mesh y se contrastaron con acetato de uranilo^******** y citrato de plomo^******** y se revisaron en un microscopio electrónico de transmisión, EM 900 (50 kv).^*******20

 

Resultados

Signos clínicos

En el tratamiento 1 (SE FT 13a), durante la primera semana posinfección, se observaron dos pollitos con depresión; en pollitos del tratamiento 2 (SI) no se observó ningún signo clínico durante el experimento.

 

Hallazgos a la necropsia

A la necropsia, entre las 6 y 126 hpi no se observaron cambios macroscópicos aparentes en ningún tratamiento. En pollitos del tratamiento 1, a las 150 hpi se observó congestión en hígado y bazo; en íleon, congestión y hemorragias equimóticas, y gas en ciegos. Durante las 174 hpi en pollitos del tratamiento 1 se observaron dos pollitos con retención de saco vitelino, en los pollitos del tratamiento 2 sólo se observó gas en ciegos. A las 198 hpi, en el tratamiento 2 se observó un pollito con retención de saco vitelino, congestión y áreas de hemorragias equimóticas en íleon. En pulmón y corazón no se observaron cambios patológicos aparentes en ningún tratamiento durante el experimento.

 

Análisis bacteriológico

En el Cuadro 1 se presentan los resultados del aislamiento de SE FT 13^* y SI. Durante las 6 hpi no se obtuvo aislamiento de Salmonella spp en ninguno de los tratamientos. Desde las 18 a 30 hpi sólo se obtuvo aislamiento de SE FT 13a en muestras de buche, yeyuno e íleon. A las 42 hpi en muestras de ciegos de pollitos del tratamiento 1 se aisló SE FT 13ª, y en muestras de buche de pollitos del tratamiento 2 se aisló SI, respectivamente. De las 54 a 126 hpi se aisló SE FT 13a en muestras de duodeno, hígado, bazo, vesícula biliar, yeyuno, íleon y ciegos; en muestras obtenidas de pollitos del tratamiento 2 no se obtuvo aislamiento. Durante las 150 y 174 hpi se aisló SE FT 13a de muestras de hígado, bazo, vesícula biliar, corazón, pulmón, duodeno, yeyuno, íleon y ciegos y SI sólo de yeyuno, íleon y ciegos en pollitos del tratamiento 2, respectivamente. A las 222 hpi no se logró aislar SE FT 13a de ningún órgano; sin embargo, en el tratamiento SI fue aislada en muestras del íleon y ciegos. Por último, a las 246 y 270 hpi sólo hubo aislamiento de SE FT 13a a partir de yeyuno, íleon y ciegos.

En el porcentaje de aislamiento de SE FT 13a en los órganos muestreados, íleon presentó 27.78% de aislamiento; ciegos, 18.06%; yeyuno, 13.89%, y duodeno, 11.11%; en el tracto gastrointestinal se registró el porcentaje de mayor frecuencia de aislamiento de SE FT 13a. En contraste, el buche presentó sólo 4.16%; de las muestras de hígado, bazo y de vesícula biliar, se obtuvo el mismo resultado de aislamiento, 11.11%; por último, de las muestras obtenidas de corazón–pulmón sólo se obtuvo 2.78% de aislamiento positivo a SE FT 13a. En los pollitos del tratamiento 2, de un total de 12 aislamientos positivos a SI, el buche obtuvo 8.22%; el yeyuno representó 16.67%; los ciegos, 25% y el íleon, 50%. En las muestras obtenidas de la combinación corazón–pulmón, hígado, bazo y vesícula biliar no se obtuvo aislamiento positivo de SI durante todo el experimento.

En los resultados del aislamiento y análisis bacteriológico cuantitativo de SE FT 13a por órganos, el rango mínimo de recuperación expresado en UFC de SE FT 13a fue en hígado (5.6 x 10³), y el máximo en ciegos (9 x 10⁹). En el caso de SI, los datos del análisis bacteriológico cuantitativo el rango mínimo de recuperación fue en muestras de buche (4 x 10⁵) y el máximo lo obtuvieron los ciegos (7 x 10⁹).

 

Análisis bacteriológico de heces

En los resultados obtenidos del análisis bacteriológico de las heces de pollitos infectados con SE FT 13a y SI, se encontró que en los días 1, 2, 4, 5, 6, 9, 10 y 12 se logró aislar SE FT 13a a partir de las heces, obteniéndose rangos mínimo y máximo de recuperación de 5 x 10⁵ y 9 x 10⁹ UFC/g, respectivamente. Las heces obtenidas de pollitos infectados con SE FT 13a de los demás días fueron negativas al aislamiento de Salmonella spp, pero se identificaron otras bacterias como Escherichia coli (E. coli), Citrobacter freundii, Proteus spp y el hongo Mucor spp; en cuanto al tratamiento 2, sólo se logró aislar SI en muestras de heces a los 5, 7 y 10 días posinfección, con rango de recuperación de 7.8 x 10⁸a6x 10⁹.

 

Lesiones microscópicas

Las lesiones microscópicas observadas en órganos tubulares y parenquimatosos de pollitos infectados con SE FT 13a y SI sugestivas a salmonelosis, fueron similares con variación en sus grados de lesión de leve, moderado y severo a diferentes horas posinfección.

 

Tratamiento 1 (SE FT 13a)

Desde las 6 a 18 hpi en mucosa y submucosa de íleon y yeyuno se observó descamación epitelial, infiltración de heterófilos y macrófagos leve, en buche, sólo descamación epitelial. En duodeno y ciego no se observaron cambios patológicos aparentes. En órganos parenquimatosos como hígado, bazo, corazón y pulmón, se observó congestión y hemorragia leve.

Desde las 30 hpi, en mucosa y submucosa de buche, duodeno, yeyuno, íleon y ciego, se observó congestión, hemorragia, descamación epitelial, áreas focales de necrosis coagulativa de las microvellosidades intestinales e infiltración de heterófilos y macrófagos en grado de lesión leve, moderado y severo hasta las 270 horas posinfección, que fue lo que duró el experimento. En hígado, desde las 30 a 126 hpi, se observó congestión, hemorragia e infiltración de heterófilos y macrófagos, y a partir de las 150 hpi se observaron, además, áreas focales de necrosis coagulativa. En bazo y pulmón se observó hemorragia y congestión de leve a moderada, y a partir de las 174 hpi, en bazo se observó también hiperplasia del tejido linfoide e infiltración de heterófilos y macrófagos; en pulmón, a las 198 y 222 hpi, infiltración de heterófilos y macrófagos. En corazón, desde las 42 a 270 hpi se observó congestión, hemorragia e infiltración focal y difusa de heterófilos y macrófagos en grado de lesión de leve a moderado.

 

Tratamiento 2 (SI)

En íleon y yeyuno desde las 6 a las 30 hpi, en mucosa y submucosa se observó leve descamación epitelial e infiltración de heterófilos y macrófagos. Además de las lesiones mencionadas, a partir de las 42 hpi se observó necrosis coagulativa del epitelio intestinal, con grado de lesión de leve a moderado. Por último, a las 174 y 222 hpi, se observó leve hiperplasia del tejido linfoide en íleon. En buche, duodeno y ciegos, a las 6 hpi no se observaron cambios histológicos sugestivos a salmonelosis. En mucosa y submucosa de buche, de las 18 a 78 hpi, sólo se observó descamación epitelial, congestión y hemorragia. A partir de las 102 hpi también se observó necrosis coagulativa del epitelio en grado de lesión leve a moderado. Desde las 18 hpi, en mucosa y submucosa de duodeno y ciego se observó congestión, hemorragia, infiltración de heterófilos y macrófagos, necrosis epitelial en grado de lesión leve a moderado hasta las 270 hpi.

En hígado, desde las 6 a 30 hpi, sólo se observó congestión y hemorragia. A partir de las 42 hpi se observaron áreas focales de infiltración de heterófilos y macrófagos en grado leve a moderado, y de las 222 y 246 hpi, además de las lesiones mencionadas, se observaron áreas focales de necrosis coagulativa. En corazón, de las 6 a 78 hpi se observó congestión y hemorragia; desde las 102 hpi se observó además, infiltración focal y difusa de heterófilos y macrófagos. En bazo y pulmones sólo se observó congestión y hemorragia que varió de leve a severa; en bazo a las 198 y 222 hpi también se observó hiperplasia del tejido linfoide (Figura 1).

 

Hallazgos ultraestructurales

De los grupos infectados con SE FT 13a y SI, entre las 6 y 30 hpi, ultraestructuralmente en secciones de íleon y ciego, se observaron bacterias en el lumen intestinal, pérdida de microvellosidades de enterocitos, en el borde apical de algunos, proyección leve del citoplasma hacia la luz, y degeneración de enterocitos. En las siguientes horas posinfección (42 a 270 hpi), se observaron cambios similares, así como degeneración de enterocitos (mitocondrias con crestas ligeramente hinchadas) y en otras zonas, enterocitos con necrosis (dilatación intensa de mitocondrias, formación de vacuolas, daño de la membrana celular y organelos, carriorexis, cariolisis y picnosis) y algunos en apoptosis (constricción celular, condensación y fragmentación de cromatina nuclear y formación de vesículas citoplásmicas y cuerpos apoptóticos). En algunas células se observaron pequeñas formaciones vacuolares que contenían estructuras de forma redondeada a oval, de 0.46 a 1.2 um, que presentaban pared celular delgada y contenido granular electrodenso, sugerentes de bacterias intracelulares. Asimismo, en algunas secciones se apreciaron células con núcleos irregulares, que presentaban en sus citoplasmas abundantes gránulos electrodensos de diferentes tamaños (heterófilos).

A las 30 hpi del grupo infectado con SE FT 13A en la sección de ciego, se apreció un enterocito con proyección de su citoplasma, semejando la formación de una copa, con lo que se englobaba parcialmente una estructura de forma ligeramente redonda, con pared celular delgada y contenido granular de moderada electrodensidad, sugerente a SE FT 13a.

A las 6 hpi del grupo infectado con SI, en la sección de íleon, se observó la siguiente secuencia en la mucosa intestinal: estructura de forma ligeramente redondeada, con pared celular delgada y contenido granular electrodenso, posteriormente se observó una estructura similar en contacto con las microvellosidades de un enterocito; en otra célula se apreció la proyección del citoplasma hacia la luz, formando una seudocopa, sobre la cual se encontraba una estructura con las mismas características que las descritas. En otros enterocitos, a nivel de citoplasma, de una a varias vacuolas, contenían estructuras de forma ligeramente redonda, pared celular delgada y ligeramente electrodensas, sugerente a SI (Figura 2).

 

Cambios leucocitarios observados durante la infección de SE FT 13a y SI

El conteo diferencial de leucocitos en los pollitos infectados con SE FT 13a y SI a los cuatro días de edad durante la primera y segunda semanas posinfección (poi) experimental, presentó bajo porcentaje de linfocitos, de 41.25% a 41.56%, y de 45% a 36%, respectivamente. El porcentaje de heterófilos se observó aumentado en la primera y segunda poi, para SE FT 13a fue de 25% a 28.33%, y en SI, de 28.33% a 49%. Eosinófilos en la primera semana poi con SE FT 13a fue de 0 y en la segunda semana fue 3.17% (aumentados). Con SI en la primera semana poi fue en 0 y en la segunda semana poi fue 3.42% (aumentados). Los basófilos aumentados en ambas semanas poi fue, para SE FT 13a, 10% en la primera semana, y 6.1% en la segunda semana; y con SI en la primera semana fue 20%, y en la segunda, 7.36%. Por último, los monocitos también estuvieron aumentados en ambas semanas poi con las dos bacterias, en la primera semana 15% y en la segunda semana 19.89% para SE FT 13a, y con SI, 18.75% en la primera semana y 21.57% en la segunda semana.

En los pollitos del tratamiento 3 (grupo testigo) no se aisló Salmonella spp de ningún órgano durante todo el experimento. Durante el examen histológico y ultraestructural, no se detectaron cambios anormales. Los valores de leucocitos se encontraron dentro de los rangos normales. Durante la identificación de las bacterias negativas al aislamiento de Salmonella spp en corazón, pulmón, hígado y bazo, se aisló E. coli en buche, duodeno, yeyuno, íleon y ciegos, además de E. coli, Citrobacter freundii y Proteus spp. Por último, en muestras de heces se obtuvo aislamiento de E. coli, Citrobacter freundii, Proteus spp y Mucor spp.

 

Discusión

En el presente estudio, los pollitos de cuatro días de edad fueron inoculados con 10⁸ y 10⁹ ufc de SE FT 13a y SI, respectivamente; de igual manera se demostró en experimentos previos que con estas dosis, las aves muestran un curso de infección similar, sugerente de salmonelosis.^21,22

Se aisló SE FT 13a de buche, hígado, bazo, vesícula biliar, corazón, pulmón, duodeno, yeyuno, íleon y ciegos; SI se aisló desde las 42 hpi en buche, yeyuno, íleon y ciegos. Íleon y ciegos fueron los órganos con mayor frecuencia de aislamiento en ambos tratamientos. Salmonella spp resiste el ambiente ácido del estómago, por lo que, después de la ingestión, coloniza el intestino delgado, penetra a las células epiteliales y migra hacia la lámina propia de la región ileocecal y ahí se multiplica en los folículos de la región linfoide. Los polimorfonucleares (heterófilos) son estimulados y la infección se limita al tracto gastrointestinal.²³ Si son serotipos productores de fiebre entérica, no son retenidas a este nivel, sino que migran a hígado y bazo por circulación hemática.²² Asimismo, las aves recién eclosionadas que carecen de microflora intestinal protectora son muy susceptibles a la colonización intestinal por Salmonella spp u otras bacterias patógenas. Las células blanco (células M, enterocitos y células caliciformes) para la invasión por bacterias patógenas revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del intestino grueso (íleon–ciego). Si la célula blanco no presenta salmonelas, es posible que se produzca la infección.^{22, 24, 25}

Los resultados de los pollitos infectados con SE a los cuatro días de edad, de acuerdo con los estudios de Turnbull y Snoeyenbos,⁵ indican que la penetración de Salmonella a través de la pared celular puede ocurrir temprano después de la infección. En otro estudio sobre persistencia de SE FT 13a, realizado por Gorham et al.,⁶ en pollitos infectados al primero y séptimo días de edad, se obtuvo aislamiento de la bacteria de la mayoría de los órganos (saco vitelino, hígado, bazo, íleon y ciego) después de la primera semana posinfección. Alva²⁶ logró aislar SE FT 13a de muestras de hígado y bazo a la primera semana, en 3/10 pollos, y en 1/10 pollos en la tercera semana posinfección; durante la segunda, cuarta y quinta semanas posinfección, su aislamiento fue negativo en estos órganos. Además, Desmidt et al.²¹ realizaron un estudio de la patogenia de SE FT 4 en pollitos de un día de edad, en los que se aisló a partir de las 3 hpi, en tracto gastrointestinal, y a partir de las 12 hpi, en órganos viscerales. Al respecto, se observó que la mayoría de los estudios realizados con SE en pollitos de uno a siete días, presentaron resultados muy similares a los obtenidos en el presente trabajo sobre la patogenia de SE FT 13a.

Sin embargo, en los pollitos infectados con SI no se logró aislar con la misma frecuencia que SE FT 13a; al respecto, Urquiza¹³ logró aislar SI a partir de órganos internos y heces de pollitos. González y Dreyfus²⁷ y Rejo, et al.²⁸ también demostraron en un modelo aviar, que con la inoculación de la cepa viva en dosis aproximadas de 10⁸–10⁹ ufc/mL, se lograba inducir respuesta inmune mediada por anticuerpos aglutinantes, en porcentajes que van desde 13% hasta 94% con la cepa del rodenticida. De la misma forma, Chils²⁹ realizó estudios en los que logró reaislar la cepa en deposiciones de perros, ovejas y cerdos inoculados experimentalmente. La baja frecuencia de aislamiento de SI en pollitos quizá se deba a las diferencias de patogenicidad entre los distintos fago tipos de SE; por ejemplo, el FT 4 frecuentemente se relaciona con cierto grado de elevada invasividad y letalidad para pollos recién eclosionados; además, otros estudios revelan que la especificidad de un serotipo para un portador particular no sólo estaría dada por factores de virulencia propios de la bacteria, sino también por la capacidad del serotipo para circular dentro de una población de portadores; es decir, el ambiente donde habitan las aves no permitiría que SI exprese sus factores de virulencia.^30,31

Durante la revisión de lesiones microscópicas en órganos de pollitos infectados por SE FT 13a y SI, se observó que desde las 6 hpi ambas bacterias en estudio presentaban lesiones, como descamación epitelial, enteritis severa con infiltración de leucocitos heterófilos y macrófagos, focos de necrosis coagulativa e hiperplasia de folículos linfoides, acompañadas de hemorragias y congestión, sugerentes a salmonelosis. Al respecto, Desmidt et al.²¹ realizaron un estudio de patogénesis de SE FT 4 en pollitos y observó enteritis del intestino delgado y ciego con necrosis coagulativa de microvellosidades e infiltración de heterófilos y macrófagos, en bolsa de Fabricio, hígado, bazo y corazón también se observaron focos de infiltración de heterófilos. En contraste con la gran diversidad molecular de microorganismos, los patrones de respuestas tisulares a estos agentes son ilimitados. Por tanto, microscópicamente muchos patógenos desencadenan patrones de reacción idénticos y son escasos los datos exclusivos o patognomónicos de cada agente. Además, lo que determina las características histológicas de la respuesta inflamatoria es la interacción entre el microorganismo y el portador. Por tanto, en un portador neutropénico, una bacteria piógena que normalmente desencadena una respuesta leucocitaria enérgica, puede suscitar una necrosis tisular rápida con escaso exudado leucocitario.³²

En este estudio, mediante microscopía electrónica de transmisión, se observó que a partir de las 6 hpi, tanto SE FT 13a como SI se hallaban en contacto con las microvellosidades de los enterocitos, con rizado o arrugamiento de la membrana celular y estructuras sugerentes a Salmonella spp dentro de los enterocitos y en las subsiguientes hpi se observaron cambios patológicos en el citoplasma celular, coincidentes con las lesiones microscópicas, además con estudios realizados por otros investigadores en aves y en otros modelos animales, como terneros, conejos, ratones, cerdos, para estudiar los mecanismos de patogenicidad de Salmonella spp.^33–36

Salmonella es hábil para explotar las funciones celulares preexistentes del portador y usar estas funciones para su propio beneficio. Esto último se ha visto durante la invasión, cuando la bacteria utiliza las señales de transducción del portador, lo cual afecta el rearreglo del citoesqueleto y proteínas superiores de membrana, produciendo el rizado (ruffling) de la membrana y la invasión bacteriana. También ocurre cuando Salmonella está dentro de una vacuola ligada a la membrana, tanto en células epiteliales como en macrófagos.³⁷

Si bien en el examen bacteriológico a las seis horas posinoculación no se aisló la bacteria en estudio de ninguno de los dos tratamientos, en el estudio ultraestraestructural sí se logró observar dentro de los enterocitos SE FT 13a y SI en íleon y ciego de pollitos infectados experimentalmente y en la secuencia de la penetración y otros cambios patológicos. El aislamiento negativo de SE FT 13a y SI a las 6 hpi, sugiere baja colonización y multiplicación en los tejidos de Salmonella spp. Al inicio de la infección bacteriana, la bacteria experimenta severos cambios ambientales en el organismo del portador al ingresar por vía oral y enfrentarse con mecanismos de defensa inespecíficos de éste, como el pH ácido del estómago, bajas tensiones de oxígeno, motilidad intestinal, flora microbiana y también con los mecanismos de defensa específicos, regulada por la presencia de leucocitos.

La bacteria responde a estos cambios modulando la expresión de sus genes, para penetrar e invadir tejidos.^16,38 Lo anterior sugiere que Salmonella después de combatir contra los mecanismos de defensa específicos e inespecíficos del portador, disminuye su concentración de los tejidos y se encuentra en fase de multiplicación lenta durante las primeras hpi, lo cual influye en su aislamiento en medios de cultivo en los que la bacteria enfrenta cambios de ambiente por la concentración de oxígeno del cultivo, temperatura, osmolaridad, disponibilidad de nutrimientos del medio de cultivo, etc., lo que puede influir en su aislamiento.

En este estudio fue evidente que los pollitos de engorda durante las primeras semanas de vida son susceptibles a la infección por Salmonella enteritidis FT 13a y Salmonella enteritidis biovar Issatschenko, y que esta última no es sólo para roedores de la familia Muridae. Actualmente la especificidad del portador se está estudiando en México y en otros países, pero no se han logrado aclarar las bases genético–moleculares que dan origen a esta situación tan particular. Lo cierto es que se trataría de una compleja interacción entre genes plasmidiales de virulencia spv y genes cromosomales ubicados en islas de patogenicidad, que, en su conjunto, derivan en el reconocimiento de una única especie en particular. El reciente hallazgo de infección, logrado con una cepa de Salmonella gallina–rum en ovejas,³¹ abre un nuevo escenario en la epidemiología de la salmonelosis. Este estudio reveló que la especificidad de un serotipo para un portador particular, no sólo estaría dada por factores de virulencia propios de la bacteria, también por la capacidad del serotipo de circular dentro de una población de portadores; es decir, el ambiente donde habitan los ovinos no permitiría que S. gallinarum expresara sus factores de virulencia. En este contexto se producen las primeras interrogantes sobre la monoespecificidad de SI.³⁰

Parece entonces de innegable interés considerar cuáles serían las consecuencias en explotaciones pecuarias, en salud pública y en la epidemiología de la salmonelosis, toda vez que se utilice un producto biológico contra roedores, elaborado con una cepa de SI que pertenece al serotipo enteritidis, que tiene un amplio rango de portadores.

De este trabajo se concluye que la patogenia de Salmonella enteritidis FT 13a y Salmonella enteritidis biovar Issatschenko en pollos de engorda, tiene similitud con la patogenia descrita de otros serotipos de Salmonella spp.

Salmonella enteritidis biovar Issatschenko puede ser aislada mediante bacteriología, y produce lesiones desde las 6 hpi, en diferentes órganos de pollos de engorda infectados experimentalmente.

La microscopia electrónica de transmisión permitió observar la penetración de Salmonella enteritidis FT 13a y de Salmonella enteritidis biovar Issatschenko, en enterocitos de íleon y ciego de pollos de engorda infectados experimentalmente.

 

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico con el Proyecto de Investigación para la Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) con el Proyecto IN 219803.

 

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^****** Hycel de Méxio, S.A., México.

^******* Merck, Alemania. regresar

^******** Electron Microscopy Sciences, Estados Unidos de América.

^********* Sigma Laboratorios, Estados Unidos de América.

^********** Dpto Cell Biology and Science, Estados Unidos de América. regresar