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Veterinaria México

versão impressa ISSN 0301-5092

Vet. Méx vol.39 no.1 Ciudad de México Jan./Mar. 2008

 

Artículos científicos

 

Regeneración del nervio ciático axotomizado del perro con prótesis de quitosana precargadas con pregnenolona y la técnica de tubulización

 

Regeneration of the dog's axotomized sciatic nerve with pregnenolone–saturated chitosan prosthesis implanted through the tubulization technique

 

Manuel Rosales–Cortés* Jorge Peregrina–Sandoval** Jorge Hernández–Mercado* Guillermo Nolasco–Rodríguez* María Estela Chávez–Delgado*** Ulises Gómez–Pinedo Esther Albarrán–Rodríguez*

 

* Laboratorio de Morfofisiología, Departamento de Medicina Veterinaria, División de Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Guadalajara Km. 15.5, Carretera Guadalajara–Nogales, predio Las Agujas, Zapopan, Jalisco, México.

** Laboratorio de Inmunología, Departamento de Biología Molecular, División de Ciencias Biológicas y Ambientales, Centro Universitario de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Guadalajara Km. 15.5, Carretera Guadalajara–Nogales, predio Las Agujas, Zapopan, Jalisco, México.

*** Departamento de Otorrinolaringología del Hospital General de Zona 89, Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México.

División de Patología y Biotecnología Ambiental, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del estado de Jalisco, A. C. y Laboratorio de Patología Clínica, OPD, Antiguo Hospital Civil de Guadalajara, Guadalajara, Jalisco, México.

 

Correspondencia:
Manuel Rosales Cortés,
Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias,
Universidad de Guadalajara,
Kilómetro 15.5, Carretera Guadalajara–Nogales,
predio Las Agujas, Zapopan, Jalisco,
45110, México,

Tel. (+52–33) 3682–0918, Fax (+52– 33) 3682–0918,
Correo electrónico: mrosales@cucba.udg.mx

 

Recibido el 25 de enero de 2006
Aceptado el 22 de agosto de 2007.

 

Abstract

Peripheral nerves can be injured by traumatisms or mechanical causes, and thermal, ischemic or tumoral damage, this could present inconveniences of the mobility, sensibility and loss of motor function at the denervated area. The surgical techniques applied to repair nerves have gone through several phases of evolution such as the tubulization technique which consists of a prosthesis with a pipe shape at the segment injured. In this work the biomaterial utilized to manufacture the prosthesis was chitosan, since this compound allows to incorporate to its matrix promoting nervous growing substances that are released in situ for a long time while being degraded by titular lysosomes of organic origin. It is known, by diverse studies, that several neurosteroids are involved during the regeneration process of peripheral nerves, which functions are already described, as pregnenolone. In order to determine if there was or not regeneration and the degree of maturity of this ,12 young French Poodle female dogs of 1 to 1.5 years old were used (four were used as intact control group, four were subjected to tubulization technique with chitosan, and four went into tubulization technique with chitosan and pregnenolone neurosteroid, which is a stem hormone), in order to correct 15 mm of axotomized segment. The regenerated nerves were evaluated by means of electronic microscopy of transmission and light, performing cross cuts of 60–70 nm and 1 urn in thickness for their histological analysis. The morphological findings showed a similar structure to that of an intact nerve, since the number of myelinated axons, not myelinated and the proportion "g" (which indicates the ripening degree of the axon), were similar, indicating that the regeneration of the axotomized nerves and tubulization was achieved, independently of the administered treatment.

Key words: Biomaterial, Chitosan, Axotomized Sciatic Nerve, Regeneration, Peripheral Nerves and Pregnenolone.

 

Resumen

Los nervios periféricos se pueden lesionar por traumatismos o causas mecánicas, térmicas, daño isquémico o tumoral, pudiendo presentar trastornos de la movilidad, sensibilidad y pérdida de la función motora en el área denervada. Las técnicas quirúrgicas aplicadas en la reparación nerviosa han pasado a través de varias etapas de evolución, como la técnica de tubulización, que cosiste en usar una prótesis en forma de tubo en el segmento lesionado. En este trabajo se utilizó el biomaterial quitosana para fabricar las prótesis, ya que permite incorporar a su matriz sustancias promotoras del crecimiento nervioso que se liberan de forma prolongada in situ al ser degradado por lisosomas titulares por ser de origen orgánico. Se sabe, por diversos estudios, que en el proceso de regeneración participan diversos neuroesteroides en nervios periféricos, cuyas funciones están ya descritas, como la pregnenolona. Para determinar si había o no regeneración y el grado de madurez de ésta, se utilizaron 12 hembras, adultas jóvenes, de la raza French Poodle, de entre 1 y 1.5 años de edad (cuatro se utilizaron como grupo testigo intacto, cuatro fueron tubulizadas con quitosana, y cuatro se tubulizaron con quitosana y el neuroesteroide pregnenolona, que es una hormona madre), para corregir un segmento de 15 mm que fue axotomizado. Los nervios regenerados se evaluaron mediante microscopía electrónica de transmisión y de luz, efectuando cortes transversales de 60–70 nm y ljim de espesor, para su análisis histológico. Los hallazgos morfológicos evidenciaron una estructura similar a la de un nervio intacto, ya que el número de axones mielinizados, no mielinizados y la proporción "g" (que indica el grado de maduración del axón) fueron semejantes, lo que indica que la regeneración de los nervios axotomizados y tubulizados se logró, independientemente del tratamiento aplicado.

Palabras clave: Biomaterial, Quitosana, Reparación del nervio ciático , Regeneración, Nervios periféricos y Pregnolona.

 

Introducción

Un nervio periférico está compuesto de fibras nerviosas (axones) que pueden variar en tamaño y calibre, ser mielínicas o amielínicas, y su función es transmitir impulsos en dirección aferente o eferente al sistema nervioso central. Los nervios periféricos a menudo se refieren como nervios mixtos porque están compuestos tanto de fibras sensitivas como de fibras motoras. La organización estructural del nervio cambia a lo largo de él por la repetida división y unión de diferentes fascículos nerviosos, produciendo formaciones fasciculares complejas. Un nervio periférico puede estar compuesto de miles de axones, pero el número de ellos en cada nervio periférico es variable.1

La médula espinal, que pasa por el canal intervertebral, emite entre 36 y 37 pares de nervios espinales que emergen del canal por los agujeros intervertebrales distribuidos en las regiones cervical, torácica, lumbar y sacra. De las ramas ventrales de los últimos nervios lumbares y los primeros nervios sacros, se forma el plexo nervioso lumbosacro, que inerva a todo el miembro pelviano mediante los siguientes nervios: por la cara interna del muslo emerge el nervio femoral, que inerva motora y sensitivamente al músculo recto interno, pectíneo abducens, y por la escotadura ciática mayor aparece el nervio ciático, que da inervación a la cara externa del muslo, que está formado por los músculos semitendinoso, semimembranoso y vasto externo del cuadríceps femoral. El nervio ciático se dirige hacia la rodilla del miembro y se bifurca, propiciando dos nervios: tibial y peroneo; el primero da origen a los nervios digitales y del segundo se desprenden los nervios popitleo y safeno.2,3

La transección del axón (axotomía) representa un paradigma poderoso para estudiar la regeneración y muerte celular en neuronas. En función del sitio donde se lleva a cabo la lesión, el daño axonal permite que las neuronas regeneren sus axones, restablezcan su contacto funcional con sus células diana, o que dé inicio a un proceso complejo que lleve a la muerte neuronal.4

Se reconoce que la degeneración axonal es causa importante de morbilidad, y que los mecanismos patogenéticos aún no han sido bien identificados.5,6 El daño de un nervio periférico en mamíferos induce a una compleja pero reproducible secuencia de eventos histopatológicos. Después de la sección de un nervio, la primera respuesta sucede en el extremo distal de las fibras nerviosas, este fenómeno se denomina degeneración anterógrada (degeneración walleriana);7–11 luego se manifiesta, en las fibras proximales de la lesión, el fenómeno conocido como degeneración neuronal retrógrada;12,13 en el soma celular suceden cambios degenerativos progresivos que llevan a la muerte neuronal.13,14

La capacidad de los nervios periféricos para regenerar contrasta con la inhabilidad del sistema nervioso central. Esta habilidad regenerativa del sistema nervioso periférico ha sido atribuida al microam–biente que proveen las células de Schwann del muñón nervioso distal. A pesar de la capacidad regenerativa, la recuperación funcional de un nervio periférico dañado es aún decepcionante, incluso después de aplicar inmediatamente la microcirugía para reparar el nervio. La experiencia clínica ha establecido que la recuperación funcional es particularmente mala para daños en nervios grandes, como los que surgen del plexo lumbar, ya que necesitan recorrer grandes distancias para restablecer conexiones con sus células diana, las cuales han sido denervadas por el daño. El ritmo lento de regeneración, 1–3 mm/día, puede llevar meses o incluso años.15,16

Diversos autores han informado sobre la participación del sistema endocrino en la reparación neural, demostrando que las sustancias ACTH, T3, T4 y testosterona17–20 incrementan la regeneración nerviosa. Asimismo, se sabe que los sistemas nervioso central y periférico presentan la capacidad de sintetizar algunos esteroides (neuroesteroides), entre ellos la pregnenolona, hormona madre de la cual se forman otros esteroides que también se hallan durante la regeneración de un nervio lesionado.21,22

Los neuroesteroides se sintetizan en tejido nervioso central y en nervios periféricos, independientemente de la actividad glandular esteroidogénica. Se forman a partir de las cadenas colaterales del colesterol mediante la participación de la enzima citocromo P450scc en las membranas internas de las mitocondrias, que convierten el colesterol en pregnenolona y ésta da origen a la progesterona, principal hormona gonadal femenina.22,23

Las elevadas concentraciones de pregnenolona que se detectan en el nervio ciático del humano confirman la síntesis de este compuesto en nervios periféricos.24 Después, en el nervio ciático de la rata, se registraron concentraciones de pregnenolona diez veces mayor que en el plasma (10 ng/g).25

Entre la funciones de la pregnenolona que apoyan a la regeneración nerviosa se encuentra que estimula el crecimiento de neuritas en las neuronas sensoriales de la raíz dorsal ganglionar, que acelera la maduración de axones regenerados de nervios lesionados y estimula la remielinización de fibras nerviosas regeneradas.22,26

La funcionalidad de la regeneración de nervios periféricos depende de interacciones entre axones en regeneración, células no neuronales, factores de crecimiento y sus receptores, moléculas celulares de adhesión y materiales de la matriz extracelular.12 La regeneración del nervio periférico comprende la formación de brotes axónicos, proyección del axón regenerado y, finalmente, la reinervación al tejido diana (formación de placa terminal);27,28 sin embargo, se desconocen los factores que controlan la regeneración de nervios periféricos.17,29

Weiss14 introduce la técnica de tubulización como alternativa para reparar y regenerar nervios periféricos seccionados en los que se pierden segmentos, que se sustituyen con prótesis en forma de tubo, para permitir la concentración de los exudados axoplasmales que contienen los factores neurotróficos y mitogénicos necesarios para inducir el crecimiento del nervio, además de permitir la orientación de rebrote axónico.

En las lesiones nerviosas en que se tubulizó un nervio seccionado, el primer evento necesario para la regeneración nerviosa fue la formación de una matriz acelular fibrinoide entre ambos segmentos, ésta actúa como puente para el crecimiento axonal y permite la migración de células no neuronales y el crecimiento axonal;30,31 más tarde, aparece la fibronectina y laminina, glucoproteínas presentes en lámina basal, con efectos importantes sobre el crecimiento axonal.30 Experimentos in vitro revelaron la participación de colágena tipos I y IV, fibronectina y laminina, en la adhesión de neuritas al sustrato; asimismo, mediante cultivos de células nerviosas de Schwann y fibroblastos, se evidencia la importancia de una membrana basal para lograr la regeneración axonal exitosa.32

Debido a la falta de materiales adecuados para fabricar prótesis útiles en la reparación de nervios, los investigadores han buscado nuevas alternativas y ahora se están usando materiales orgánicos que permiten su biodegradación y bioabsorción por parte del organismo, evitando con ello una segunda cirugía para retirarlos, como sucedía con las prótesis de silicona. Se ha estado ensayando con diversos biomateriales como el gortex,33 millipore34 surgicel,9 colágena,35,36 ácido poliglicólico37 y materiales endógenos, como duramadre, vena y componentes de membrana basal.26,33

El presente trabajo se basa en la combinación de dos elementos muy importantes: por un lado, el uso del neuroesteroide pregnenolona como factor neurotrófico, precargado en la matriz de un biomaterial llamado quitosana, que proviene de la quitina que está presente en el tallo de varias plantas, hongos, insectos, moluscos y en el caparazón de algunos invertebrados.38,39 La quitina es un homopolímero de estructura lineal con enlaces beta (1–4)–2– amino– desoxy–D–glucosa (o glucosamina),39–41 se obtiene en diferentes presentaciones físicas (solución, hojuelas, polvo, gotas, fibras, entre otras); su solubilidad depende del pH, pues se muestra insoluble en agua, solventes orgánicos y soluciones alcalinas, pero es hidrosoluble en medios ácidos,8,38,39,42 es biodegradable y bioabsorbible en 75% por las enzimas quitosanas y en 35% por las lisoenzimas titulares,40,43,44 tiene un porcentaje de desacetilación >74%, con baja toxicidad, afinidad hidrofílica, estabilidad ante la putrefacción y modelable.8,45 La quitosana ofrece las ventajas de permitir la liberación local y prolongada de compuestos al actuar como vehículo porque permite la incorporación de sustancias a su matriz, promotoras del crecimiento nervioso, como la pregnenolona, que es el segundo elemento que se utilizó en este trabajo por sus cualidades benéficas en el proceso de regeneración, al evitar efectos colaterales indeseables en un tratamiento sistémico.22,46

A partir de distintos estudios con nervios axotomizados–tubulizados de roedores, se ha evidenciado que el éxito de la regeneración depende fundamentalmente de diversos factores:47,48 las variaciones en el diámetro del tubo,49 la distancia entre los segmentos del nervio (10 mm/15 mm),49,50 el uso de diferentes sustancias tróficas como el NGF e implantes de prótesis elaboradas con materiales sintéticos o biomateriales, y la naturaleza del traumatismo nervioso.51

En el presente trabajo se evaluó el efecto de la pregnenolona en la regeneración de un segmento del nervio ciático de perro, de 15 mm de longitud, axotomizado y tubulizado mediante el uso de una prótesis de quitosana.

 

Material y métodos

Se utilizaron 12 hembras French Poodle, adultas, jóvenes, de 1.5 años de edad y de 7 ± 2 kg, alojadas y mantenidas en condiciones de bioterio con alimentación ad libitum.

Se formó un grupo testigo que sólo fue axotomizado, otro que también fue axotomizado y tubulizado con prótesis de quitosana y uno que fue axotomizado y tubulizado con prótesis de quitosana y 50 mg de pregnenolona precargada en su matriz, todos con n = cuatro animales por grupo. La regeneración fue inducida en un defecto de 15 mm. Se les aplicó clorhidrato de promazina,* 25 mg/kg peso/IM como preanestésico y pentobarbital sódico,** 40 mg/kg peso/IV como anestésico para practicarles la axotomía del nervio ciático y axotomía–tubulización para los animales programados.

Los animales se sacrificaron a los 60 días poslesión y se obtuvieron los segmentos de nervios regenerados para aplicarles exámenes macroscópico y morfométrico, con el fin de determinar el grado de regeneración y madurez. Se cuantificó el número de axones no mielinizados, mielinizados y la proporción "g", que se obtiene dividiendo el área total de la fibra entre el axoplasma interno o área interna que indica el grado de madurez del axón y que es inversamente proporcional, o sea, a mayor superficie ocupada por mielina, menor proporción "g", y entre más mielina, mayor grado de madurez.28

A partir de cada segmento nervioso se obtuvieron fragmentos longitudinales de 1 mm de espesor, que fueron deshidratados mediante cambios en series crecientes de etanol*** y acetona**** preincluidos en mezclas de solvente y resinas epóxicas finalmente los tejidos se incluyeron en resinas utilizando cápsulas. Se realizaron cortes transversales de 1 µm de espesor en un ultramicrotomo, se tiñeron con azul de toluidina para el análisis morfométrico.

Con el propósito de valorar la población celular presente y la organización de sus componentes tisulares del segmento regenerado, se destinaron tejidos previamente incluidos también en resina, con cortes finos de 60–70 nm de espesor en un ultramicrotomo (rango dorado a plateado del espectro de difracción de luz visible). Se montaron tres cortes por rejilla y seis por animal, contrastándose con una solución de acetato de uranilo y citrato de plomo, en una atmósfera saturada con NaOH para medir su precipitación. Los cortes se examinaron con microscopio electrónico y se obtuvieron negativos en película de 63 x 88 mm a 3 000 X en campos aleatorios de una superficie por campo visual de 368 um2. Con fines de comparación, se tomó como testigo el nervio intacto no lesionado; así, con base en las características morfológicas se identificaron elementos celulares y no celulares que están presentes en el proceso de regeneración, como fibras de colágena o elastina, fibroblastos, axones mielinizados y no mielinizados en diferente estadio de maduración.

El análisis estadístico se realizó a partir de los resultados del análisis morfométrico, y de cada animal se revisaron ambos muñones, proximal y distal, cuantificando el número de axones mielinizados y no mielinizados, y la proporción "g". Los valores obtenidos se compararon con los resultantes del segmento nervioso del testigo no lesionado y posteriormente se les aplicó el análisis estadístico ANDEVA, seguido de una prueba de Tukey a un nivel de significancia de 0.05.

 

Resultados

Después de la axotomía, todos los animales presentaron el miembro lesionado recogido hacia el vientre, pero a los 15 días de la lesión, los animales que fueron tubulizados empezaron a apoyarlo y a caminar con ligera claudicación, que desapareció al cabo de 30 días, esto no ocurrió con los que sólo se axotomizaron.

Todos los animales se sacrificaron a los 60 días poslesión, se separaron los músculos que cubren al ciático y se observó que las prótesis habían desaparecido por completo, comprobando que fueron biodegradadas y absorbidas por el organismo; en su lugar se encontraron muñones nerviosos reconectados de 15 mm de longitud y con un calibre y estructura semejante al del testigo (Figura 1).

Se compararon los hallazgos macroscópicos de las hembras que fueron axotomizadas y tubulizadas con prótesis de quitosana con o sin neuroesteroide precargado en su matriz, contra las hembras del grupo testigo que sólo fueron axotomizadas pero no tubulizadas, se observó que los muñones de nervio que quedaron en el lugar de la axotomía fueron reabsorbidos y desaparecieron por completo; o sea, se presentó degeneración anterógrada y retrógrada del muñón distal y proximal.

En el análisis estructural con microscopía electrónica de transmisión del grupo tubulizado con quitosana, sin neuroesteroides, se observaron axones mielinizados y no mielinizados de diferente diámetro, células con morfología diversa y vainas de mielina con espesor variable, de aspecto compacto y formas esféricas distribuidas en el corte, así como células de Schwann en diferente grado de maduración. En el grupo de quitosana con pregnenolona se distinguieron los mismos estadios de regeneración que el de quitosana. Se encontraron los espaciamientos que dividen a un nervio normal, como el epineuro, perineuro y endoneuro, formados por una gran cantidad de fibras de colágena elastina a manera de tejido fibroconectivo que envuelven y soportan los componentes celulares y a las fibras nerviosas (Figuras 2 y 3).

 

Análisis morfométrico

El análisis estadístico indicó que no hubo diferencias significativas (F, 4, 25 = 0.18, P > 0.05) del número de fibras mielinizadas entre los grupos experimentales con respecto a un nervio intacto no lesionado (Cuadro 1).

El análisis de axones no mielinizados de los nervios regenerados no indicaron diferencias significativas (F, 4, 45 = 0.98, P > 0.05) entre los grupos experimentales, en relación con el número de fibras no mielinizadas de un nervio intacto (Cuadro 2).

El análisis de la proporción "g" de los axones mielinizados indicó que no hubo diferencias significativas entre los tratamientos con respecto al grupo testigo (F, 5, 45 = 0.64, P > 0.05). Sin embargo, cabe aclarar que de nuevo el grupo quitosana seguido de pregnenolona mostró menor proporción, ello demuestra que los axones de estos grupos tienen mayor espesor de mielina; por lo tanto, presentan mejor regeneración (Cuadro 3).

 

Discusión

La recuperación de la herida quirúrgica de todos los animales se logró a los diez días poslesión y poco a poco las hembras que fueron axotomizadas y tubulizadas recuperaron la función motora y sensitiva de la pierna lesionada, ello comprobó la efectividad de la técnica de tubulización, pues permitió la concentración de factores tróficos y la reconexión axonal, evitando así su degeneración.14,35,37 Como consecuencia de ello, los nervios se regeneraron en su totalidad de acuerdo con los hallazgos macroscópicos y microscópicos observados, lo cual coincide con otros autores.19,35,47

De acuerdo con los resultados, la quitosana, por sus propiedades especiales, como la baja toxicidad, catiónica, biodegradable, antimicrobiana e hipoalergénica, permitieron mostrar su utilidad en la reparación de nervios con calibres semejantes al del humano, ya que a los diez días poslesión, las hembras que fueron axotomizadas y tubulizadas con o sin pregnenolona, recuperaron la función motora y sensitiva de la pierna lesionada.14,35,37 Debido a estos factores, los nervios se regeneraron en su totalidad según los hallazgos macroscópicos y microscópicos observados.19,35,47

Aunque la regeneración se dio sin que importara el tratamiento en las hembras tubulizadas, se comprobó que el biomaterial quitosana funciona para aplicar tratamientos in situ, evitando los efectos de los tratamientos sistémicos, así una segunda cirugía para retirar la prótesis, como ocurre con otros materiales, ya que permitió ser degradada lentamente durante los 60 días del estudio, asegurando con esto la liberación prolongada del neuroesteroide pregnenolona que fue precargado en su matriz.39

Los hallazgos macroscópicos de la regeneración de los nervios se comprobaron con microscopía de luz y electrónica de transmisión, lo cual determinó que se encontraba en una etapa avanzada y madura. Se presentó la reconexión de los nervios axotomizados y tubulizados sin importar si tenían o no pregnenolona precargada en las prótesis y la citoarquitectura estaba organizada igual que la de un nervio intacto.30,47

Se concluye que el uso de prótesis de quitosana es una alternativa terapéutica adecuada para la reparación de defectos de nervios periféricos de 15 mm y de un calibre mayor a los evaluados en roedores y conejos, y de esta forma se aporta al neurocirujano una herramienta más en la reparación de nervios periféricos lesionados.

Es necesario realizar estudios complementarios dirigidos a evaluar la respuesta inmune del receptor, posibles efectos a largo plazo por la degradación de la prótesis, el uso de este tipo de prótesis en la reparación de defectos mayores, así como demostrar que la conducción del impulso y la regeneración de la placa neuromotora del nervio regenerado es semejante al del nervio intacto.

 

Agradecimientos

El financiamiento para la realización de este proyecto fue aportado por el Conacyt (número M–30437) y por la Universidad de Guadalajara.

 

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NOTAS

*Promece, Fort Dodge Animal Health, Estados Unidos de América.

**Anestesal, Pfizer, México.

***Sigma R 8382, Estados Unidos de América.

****Aldrich, clave 67–64–1, Estados Unidos de América.

SPI Chem 02660 AB, Estados Unidos de América.

Been, 16659–1 Polysciences Laboratorios, Inc Warrington Balleyroad, Estados Unidos de América.

Sorvall, Equipar, SA de CV, México.

Sigma T 0394, clave 92319, Estados Unidos de América.

Segulab, Estados Unidos de América.

Spi–Chem, Weschester, Estados Unidos de América.

JEOL, Bid–Service LLC, Estados Unidos de América.

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