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ANTECEDENTES
Las infecciones vaginales son la primera causa de consulta ginecológica. Diferentes especies de Candida spp son agentes causales comunes de estas infecciones que llegan a provocar incluso un tercio de ellas.1 Este hongo también puede habitar en la vagina de mujeres sanas, como comensal, cuando se encuentra en forma de levadura, cambiando a forma de hifa cuando origina una infección sintomática.2
Se estima que 75% de las mujeres tienen, al menos, un episodio de candidiasis vulvovaginal durante su vida y de éstas 10% tendrá cuatro episodios por año, condición conocida como candidiasis vulvovaginal recurrente.3,4
En los últimos años se ha visto un incremento importante en las especies no albicans como agentes etiológicos de este padecimiento, en especial de C. glabrata, sobre todo debido al uso indiscriminado de azoles de venta libre, a los que estas especies suelen ser resistentes.3 Además, C. glabrata puede causar síntomas leves que pasan inadvertidos por las mujeres.5
En 2004, en un estudio efectuado en el Metro Health Medical Center de Cleveland, con un tamaño de muestra de 709 mujeres asintomáticas, se encontró que 70% de ellas estaban colonizadas; 98% por C. albicans y 2% por C. glabrata y C. parapsilosis. Otros resultados de la misma investigación sugieren, además, que los dos factores que más predisponen a la colonización son la actividad sexual reciente y los anticonceptivos hormonales.6 La coexistencia de estas levaduras en mujeres asintomáticas puede llegar a ser, según reportes de México, incluso de 55%.7,8
En la práctica médica, el diagnóstico de candidiasis vulvovaginal suele establecerse con base en los síntomas y signos clínicos y no se acude, rutinariamente, a técnicas microbiológicas o moleculares para conocer, con certeza, el agente etiológico, lo que puede provocar una mala elección del tratamiento. Además, en México se carece de estudios recientes que indiquen la prevalencia de las dos especies más comunes de Candida, C. albicans y C. glabrata, en mujeres en edad reproductiva carentes de síntomas de vaginitis.
Puesto que no se sabe con exactitud qué factores son los que provocan que la colonización por estas levaduras se transforme en infección sintomática aunado al hecho de que distintas especies de Candida spp tienen diferentes susceptibilidades a los antimicóticos más usados, se buscó explorar, por métodos moleculares, si las dos principales especies causales de candidiasis son las responsables de las recurrencias y si las mismas suelen colonizar la vagina de mujeres mexicanas asintomáticas en edad reproductiva.
MATERIALES Y MÉTODOS
Estudio analítico, transversal, prospectivo, experimental, de casos y controles, efectuado en mujeres de 18 a 45 años de edad, atendidas en la consulta del servicio de Ginecología del Centro Médico ABC de la Ciudad de México. Para el establecimiento de diferencias se recurre a la prueba de ANOVA. El trabajo experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Referencia y Apoyo para Caracterización de Genomas, Transcriptomas y Microbiomas del Departamento de Genética y Biología Molecular del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Unidad Zacatenco. El trabajo fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Centro Médico ABC.
Criterios de inclusión y exclusión
Para los casos, se tomaron muestras de pacientes con diagnóstico clínico de al menos cuatro episodios de candidiasis vulvovaginal en los últimos doce meses y que refirieran síntomas en ese momento. Para los controles, se tomaron muestras de mujeres sanas que acudieran a consulta para toma de estudio de Papanicolaou. Todas las pacientes aceptaron participar en el estudio y firmaron un consentimiento informado. Se excluyeron las pacientesa con tratamiento antibiótico o antimicótico por vía oral o vaginal en los últimos 30 días y pacientes controles con diagnóstico de candidiasis vulvovaginal en el último año.
Los datos clínicos se obtuvieron mediante interrogatorio dirigido para conocer: edad, número de episodios de candidiasis vulvovaginal en el último año, método anticonceptivo, fecha de la última menstruación, menarquia, inicio de la vida sexual activa y número de parejas sexuales, embarazos, partos, cesáreas o abortos, tabaquismo, última toma de antibióticos o antimicóticos y síntomas característicos de vaginitis, incluidos: prurito, flujo, disuria o dispareunia.
Obtención del hisopado
La muestra se tomó de la pared posterior de la vagina después de colocar el espejo vaginal con hisopo estéril Catch AllTM Sample Collection Swabs (Epicentre-llumina, EUA) y dejarlo en un tubo de 2 mL con solución PBS estéril, que se guardó a 4 oC hasta la extracción del ADN. Cada muestra se etiquetó con la clave de la paciente, que consiste en las tres o cuatro iniciales de nombres y apellidos y un número consecutivo del 1 al 100. Por último, se efectuó la toma del pH vaginal, con tira reactiva Hydrion (Micro Essential Laboratory, EUA).
Extracción del ADN
Se utilizó el equipo GeneAll ExgeneTM Stool SV (GeneAll Biotechnology, Corea del Norte) siguiendo los pasos indicados por el fabricante. Las muestras se cuantificaron con espectofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA) y se observaron en gel de agarosa al 0.5% para corroborar la existencia e integridad del ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa
Para determinar la existencia de C. albicans y C. glabrata se efectuaron amplificaciones con reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos para cada especie. Los iniciadores se alinean al espacio transcrito intergénico (ITS por sus siglas en inglés, Internal Transcribed Spacer) de C. albicans (GenBank: AJ249486.1) y de C. glabrata (GenBank: LC042135.1) respectivamente, como se ilustra en la Figura 1. Para determinar la existencia de C. albicans se utilizó el iniciador sentido CALB1 (5' - TTT ATC AAC TTG TCA CAC CAG A - 3'), complementario a las posiciones 131-152 y el antisentido CALB2 (5' - ATC CCG CCT TAC CAC TAC CG - 3'), complementario a las posiciones 384-403, que producen un amplicón de 273 pb.9 Para la presencia de C. glabrata se utilizó el iniciador sentido CGL1 (5'- TTA TCA CAC GAC TCG ACA CT -3'), complementario a las posiciones 228-247 y el antisentido
Figura 1 Esquema del ITS1 e ITS2 (Internal Transcribed Spacer) de C.
albicans y C. glabrata con los iniciadores
sentido y antisentido para PCR diagnóstica de candidiasis.
A. Los ITS de C. albicans, que se
ilustran en flechas azul oscuro y los genes rRNA 18S, 5.8S y 28S en
barras azul claro, con un tamaño de 536 pb. En letras azules y flechas
verdes se localizan el iniciador sentido CALB1 y el antisentido CALB2,
que producen un amplicón de 273 pb. B. Los ITS de
C. glabrata, que se ilustran en flechas moradas y
los genes rRNA 18S, 5.8S y 28S en barras violetas, con un tamaño de 846
pb. En letras azules y flechas verdes se localizan el iniciador sentido
CGL1 y el antisentido CGL2, que producen un amplicón de 423
pb.
Abreviaturas: rRNA gen ribosomal, ITS Internal transcribed
spacer.
CGL2 (5'-CCC ACA TAC TGA TAT GGC CTA CAA -3'), complementario a las posiciones 637-660, que producen un amplicón de 423 pb.9 Las reacciones se realizaron a un volumen final de 20 μL, con 10X ExTaq Buffer (20mM Tris-HCl, 100 mM KCL, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT), 2.5 mM mezcla de dNTP, 0.01 U de enzima Takara Ex TaqTM de alta fidelidad (Takara Bio Inc, Japón) y 100 ng de ácidos nucleicos totales de cada muestra.
Como testigo positivo se utilizó ADN de C. albicans y C. glabrata para sus respectivos iniciadores y como testigo negativo se utilizó la mezcla de reacción sin ADN molde. El programa de PCR fue de 5 minutos a 96 oC de desnaturalización inicial y 30 ciclos (30s 94 °C; 30s 58 °C; 30s 72 °C)9 utilizando un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, EUA). Posteriormente se fraccionaron 5 μL del producto con electroforesis en gel 0.5X TBE y agarosa al 1.5%, con colorante Midori Green (Nippon Genetics, Japón) y registrado con Bio-Rad Molecular Imager Gel DOC XR+ Imaging System (Bio-Rad, EUA).
Se consideró como diagnóstico positivo de cualquiera de las dos especies la presencia del amplicón del tamaño esperado. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor para cada una de las características clínicas con respecto a la existencia de Candida spp para determinar su papel como factor de riesgo y sus diferencias entre los dos grupos de estudio.
RESULTADOS
Se estudiaron 93 pacientes: 46 casos y 47 controles. Las características clínicas cualitativas se resumen en el Cuadro 1 y las cuantitativas en el Cuadro 2. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de estudio con respecto a estas variables, excepto en el número de episodios de candidiasis vulvovaginal en el último año y en los síntomas de vaginitis (p= 0.001), lo que confirma que la muestra fue homogénea entre ambos grupos. La media de edad de los casos fue de 34.1 años y de los controles 31 años. La media de pH vaginal en los casos fue de 4.46 y en los controles 4.37 (p = 0.1).
En el Cuadro 1 se muestran los porcentajes de casos y controles que usan diferentes métodos anticonceptivos, de la fase del ciclo en la que se encontraban al momento del muestreo (folicular: día 1 a 12; ovulatoria: día 13 a 16, lútea: día 17 a 28), de los casos de promiscuidad (más de tres parejas sexuales), fumadoras y con síntomas de vaginitis (prurito, disuria, dispareunia o leucorrea). La prueba de ANOVA para determinación de diferencias estadísiticamente significativas entre grupos fue de p≤0.05, que en el cuadro se señalan en negritas.
En el Cuadro 2 se mencionan las medidas de dispersión de la edad, pH vaginal, antecedentes obstétricos y episodios de candidiasis en el último año de los casos y controles. La prueba de ANOVA reportó una p≤ 0.05, señalada en negritas en el cuadro.
En el diagnóstico molecular con PCR de Candida spp se buscaron los amplicones de 273 pb y de 423 pb para C. albicans y C. glabrata, respectivamente, como se ejemplifica en la Figura 2. En todos los casos se corroboró la coexistencia de Candida spp. Una paciente (2.2%) con sólo C. albicans, 37 pacientes (80.4%) con C. glabrata y 8 pacientes (17.4%) con coinfección por C. albicans y C.glabrata. En los controles se encontraron: 29 pacientes con C. albicans, 2 (4.2%) con C. glabrata, 9 (19.1%) con C. albicans y C.glabrata y 7 (14.8%) con ausencia de Candida. La prueba de ANOVA demostró diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos en la ausencia de Candida (p = 0.037), coexistencia de C. albicans (p = 0.001), C. glabrata (0.001) y sin diferencia en la coexistencia de ambas especies (p = 0.717), como se resume en la Figura 3.
Figura 2 Diagnóstico molecular de C. albicans y C. glabrata en un caso y una paciente control. Electroforesis en gel de agarosa típico al 1.5% donde se observan amplicones de PCR para un caso, con un amplicón de 273 pb en el carril 1 que indica la existencia de C. albicans y un amplicón de 423 pb en el carril 2 que indica coexistencia de C. glabrata. Para un control se encuentra un amplicón de 273 pb en el carril 3 que indica existencia de C. albicans y ningún amplicón en el carril 4, que indica ausencia de C. glabrata. En el carril 6 se observa el control positivo para los iniciadores CALB1 y CALB2 con ADN de C. albicans como molde y en el carril 7 el control negativo para dichos iniciadores sin ADN molde. En el carril 8 se observa el control positivo para los iniciadores CGL1 y CGL2 con ADN de C. glabrata como molde y en el carril 9 el control negativo para esos iniciadores sin ADN molde. En el carril 10 está el marcador de peso molecular de 100 pares de bases.
Mediante ANOVA se determinó la diferencia estadística del diagnóstico de Candida spp entre los casos y los controles. La detección nula de Candida spp fue estadísticamente significativa con p= 0.037; C. albicans tuvo una p= 0.001 al igual que C. glabrata, mientras que la coinfección no fue estadísticamente significativa (p= 0.717). Valores estadísticamente significativos p≤0.05.
DISCUSIÓN
Este estudio identificó, por medio de pruebas moleculares, a C. albicans y C. glabrata, como agentes causales de candidiasis vulvovaginal recurrente en 46 pacientes. Si bien se sabe que C. albicans es responsable de 98.0% de la candidiasis vulvovaginal esporádica, se ha reportado que las especies no-albicans pueden causar incluso 32.0% de las recurrencias.3 En 2006, por medio de pruebas bioquímicas tipo API 20C, se determinó como especies más frecuentes en mujeres mexicanas con vaginitis a C. albicans (39.0%), C. glabrata (35.9%) y C. tropicalis (16.2%).10 Esta última especie no se evaluó en nuestro estudio; sin embargo, se encontró una importante diferencia en los porcentajes de C. albicans (2.12%) y C. glabrata (80.4%), además de coinfecciones (17.4%), lo que puede deberse a que todas las pacientes del estudio eran casos de recurrencia.
Es posible que la alta prevalencia de C. glabrata se deba a que se trata de pacientes multitratadas con antimicóticos y antibióticos prescritos por diferentes médicos e, incluso, existe la posibilidad de que las pacientes se hayan automedicado en algún momento. Todo esto lleva a una probable disbiosis vaginal tanto en su componente bacteriano como micótico, que provoca que los microorganismos más resistentes, incluida a C. glabrata, adquieran la capacidad de provocar infecciones de repetición.
Existen reportes que relacionan las concentraciones de estrógenos con los síntomas de candidiasis vulvovaginal;11 sin embargo, sólo 13.0% de los casos utilizaban algún método anticonceptivo hormonal, y 29.8% de las pacientes asintomáticas sí los usaban .
El pH vaginal normal en una paciente con síntomas de vaginitis es parte importante del cuadro clínico de la candidiasis vulvovaginal pues descarta la posibilidad de vaginosis bacteriana.11 No se encontró diferencia significativa entre los grupos, la media de pH fue de 4.46 y 4.37 en casos y controles, respectivamente.
En 2014 se reportó, solo por medio de cultivos, a 12.5% de mujeres asintomáticas mexicanas colonizadas por Candida spp.8 En nuestro estudio 85% de las mujeres sin síntomas de vaginitis resultaron positivas para al menos una especie de Candida spp, y C. albicans fue la más común (61.7%). Las pacientes de ambos grupos tuvieron coexistencia similar de Candida spp, con tan sólo 14.9% de diferencia. Este resultado es similar a los descritos en 2000 por Giraldo y su grupo, quienes encontraron, mediante PCR, una diferencia de solo 1.2% de Candida spp entre pacientes sanas y con antecedente de candidiasis vulvovaginal recurrente.12 En ese estudio, además, encontraron diferencias importantes en los resultados arrojados por distintas pruebas paraclínicas, incluido RCP, cultivos y tinción de gram; las últimas dos fueron las que identificaron en menor porcentaje a pacientes sanas con Candida spp (6.6 y 4.4%, respectivamente).
Los resultados de Giraldo y su grupo, y los nuestros, indican que a pesar de que todos los procedimientos de laboratorio son de gran valor para llegar a un diagnóstico definitivo que identifique al agente etiológico, los métodos moleculares complementan de una manera importante el diagnóstico, aportando mayor sensibilidad y especificidad pues incluso pueden determinar la coexistencia de patógenos en pacientes sanas que solo se encuentran formando parte de la microbiota normal de esa localización anatómica.
CONCLUSIONES
La candidiasis vulvovaginal representa un serio problema de salud pública que se agudiza aún más cuando es recurrente. Está demostrado que la colonización por C. albicans y C. glabrata es muy común. Por esto es importante investigar los factores que ayudan a dichos microorganismos a causar infección sintomática y dejar de ser simplemente comensales de la vagina. En la actualidad, el diagnóstico clínico es el más utilizado por médicos generales y ginecólogos para determinar la candidiasis vulvovaginal y, aunque valioso en casos esporádicos, puede dar lugar a errores en el tratamiento farmacológico de los casos recurrentes causados por especies no albicans, lo que hace que los síntomas se agraven y se incremente el número de cuadros. Si bien se dispone de varios métodos diagnósticos de laboratorio que pueden aportar información valiosa al diagnóstico etiológico, es claro que los métodos moleculares son una opción viable para el diagnóstico definitivo de enfermedades tan comunes como la candidiasis vulvovaginal, lo que de esta manera hace que el tratamiento prescrito sea el correcto y evite resistencias y, por lo tanto, las recurrencias, que tanto afectan a las mujeres en su calidad de vida y en su salud reproductiva.
