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Introducción
En la actualidad, el estudio de la interacción de fenómenos fisiológicos en los seres vivos ha tenido avances significativos, específicamente la medición de correlaciones entre señales fisiológicas ha sido motivo de diversas investigaciones. Hallazgos importantes combinan la aplicación de métodos de análisis de series de tiempo con el registro simultáneo de una o más señales fisiológicas [1]. En particular, la interacción de fluctuaciones R-R extraída del electrocardiograma (ECG) con la actividad respiratoria, es uno de los fenómenos fisiológicos más explorados con estos métodos [2, 3].
En diversos estudios se ha investigado la existencia de un vínculo funcional entre el ritmo cardiaco y respiratorio, al que se le ha denominado acoplamiento cardiorrespiratorio (CRP) [4-6]. El acoplamiento CRP, describe las influencias de la respiración sobre la frecuencia cardiaca y la presión arterial [3], [7], [8]. Adicionalmente se ha utilizado al acoplamiento CRP para cuantificar la relación entre el sistema cardiaco y respiratorio bajo el control del sistema nervioso central [9].
Gholami et. al han reportado que las manifestaciones clínicas relacionadas a una exagerada reacción inflamatoria (ej. endotoxemia) se asocian con un desacoplamiento parcial de las células marcapasos del sistema nervioso autónomo (SNA), lo que origina la disminución de la variabilidad de la frecuencia cardiaca (VFC) [10]. Debido a la alta asociación entre el SNA con las células marcapasos cardiacas, la VFC no es el único parámetro fisiológico afectado, sino también lo es el ritmo respiratorio [10].
La inyección de lipopolisacárido (LPS) causa un desacoplo en la regulación autonómica en ratas conscientes [11], dicho desacoplamiento se manifiesta como taquicardia, pérdida de la dinámica fractal de series de tiempo R-R, cambios en la temperatura corporal y comportamiento letárgico [11]. Por otro lado, la neurohormona oxitocina tiene funciones fisiológicas ampliamente conocidas en mamíferos, Gamer et. al sugieren que tiene propiedades inmunitarias y cardioprotectoras; principalmente mediante la modulación de la actividad del sistema nervioso parasimpático [12]. Nuestros estudios previos respaldan las propiedades antiinflamatorias y cardioprotectoras de la oxitocina, puesto que una dosis baja de oxitocina periférica redujo el comportamiento de enfermedad (sickness behavior) y disminuyó la taquipnea en ratas [11]. En dichas investigaciones concluimos que la oxitocina parece restablecer las interacciones cardiorrespiratorias y el acoplamiento colinérgico cardiaco [11,13].
Bajo este contexto, el objetivo del presente estudio fue comparar diferentes métodos matemáticos lineales y no lineales para la detección del acoplamiento cardiorrespiratorio entre series de tiempo cardiacas y respiratorias obtenidas de un modelo experimental de roedores sometidos a endotoxemia mediante la aplicación de lipopolisacárido y suministración conjunta de oxitocina exógena. Hipotetizamos que los métodos no lineales podrán identificar modificaciones en el acoplamiento CRP de una manera más apropiada que los métodos lineales.
Metodología
Base de datos de electrocardiogramas telemétricos
Las señales de ECG utilizadas para esta investigación fueron extraídas de investigaciones previas [11], dichos datos fueron obtenidos de ratas macho Dark Agouti implantadas con un transmisor de ECG telemétrico (frecuencia de muestreo 2000Hz) como se ha descrito previamente [11,13].
Los datos fisiológicos corresponden a cuatro grupos a los que se les aplicó el siguiente tratamiento: 1) vehículo (V; solución salina n=7); 2) oxitocina (Ox; 3 UI/Kg administrada subcutáneamente, n=8); 3) lipopolisacárido (LPS; 0.1mg/Kg administración intraperitoneal, n=8); 4) LPS + Oxitocina (LPS + Ox; administración combinada de 0.1 mg/Kg LPS intraperitoneal y 3 UI/Kg oxitocina subcutánea, n=8).
Análisis de datos
Se seleccionaron segmentos de ECG de cinco minutos de duración en las siete horas posteriores al tratamiento (+7 h), puesto que nuestros estudios previos han demostrado que los mayores desajustes autonómicos cardiacos debido a la endotoxemia se manifiestan hasta este lapso de tiempo [11,13]. Los segmentos de cinco minutos de ECG se analizaron para la detección del complejo QRS y la generación de series de tiempo R-R utilizando algoritmos propios desarrollados en el software MATLAB (The MathWorks Inc., Massachusetts, Estados Unidos).
Adicionalmente se aplicó una técnica de procesamiento de señales para obtener la respiración derivada del electrocardiograma (EDR, por sus siglas en inglés) en función del área bajo la curva del complejo QRS. El algoritmo de esta técnica se encuentra disponible en PhysioNet (www.physionet.org) y proporciona datos confiables relacionados con señales fisiológicas respiratorias [14]. La ventana móvil del algoritmo se ajustó a 0.1 s; las series de tiempo EDR y R-R se interpolaron mediante un spline cúbico a 100 Hz, posteriormente fueron filtradas digitalmente con un pasa altas utilizando una frecuencia de corte de 0.5 Hz.
Para la cuantificación del acoplamiento CRP se utilizaron técnicas lineales: la correlación cruzada (X-Corr) algoritmo incorporado al/ software MATLAB, y no lineales: la entropía muestral cruzada (CrossSampEn), la entropía condicional (CondH), la información mutua (MI) y la información mutua de Rényi (RényiMI) provenientes de los scripts de PhysioNet y MIToolbox[15] (Universidad de Manchester, Inglaterra) disponibles en (http://academic.adampocock.com/index.html). La descripción matemática de estos parámetros se detallará a continuación.
Correlación Cruzada
La función de correlación cruzada (X-Corr) ha sido empleada para estudiar la fuerza y la dirección de la relación entre dos procesos estocásticos conjuntamente estacionarios. Considerando dos procesos conjuntamente estacionarios como xt y, yt para t = 0, ±1, ±2, … la covarianza cruzada γxy de orden k entre xt y yt está definida como:
Para k = 0, ±1, ±2, …, γxy (k) es llamada la función de covarianza cruzada entre xt y yt.
La estandarización de γxy (k) produce la función de correlación cruzada (ecuación 2):
Para k = 0, ±1, ±2, …, donde σx y σy son las desviaciones estándar de los procesos xt y yt.
Para valores positivos de k, γxy describe la influencia lineal de los valores pasados de xt en yt indicando un mayor acoplamiento en las señales. Un resultado de la X-Corr cercano a 1 indica una interacción lineal positiva entre dos señales dado un retardo k[16].
Entropía muestral cruzada
La entropía muestral cruzada (Cross-SampEn) es un parámetro utilizado para medir el grado de asincronía de dos series de tiempo relacionadas, por lo que se correlaciona negativamente con un nivel de acoplamiento no lineal entre dos señales [17]. El valor de la Cross-SampEn cuantifica las interacciones entre dos series de tiempo distintas pero que interactúan entre sí (en este caso, la frecuencia cardiaca y la respiración bajo la influencia del sistema nervioso central) [8]. Cuando la asociación entre los intervalos R-R y la señal EDR es fuerte, el valor de entropía cruzada será pequeño, lo que sugeriría un alto nivel de CRP. En contraste, cuando hay una asociación débil entre los dos conjuntos de datos de series de tiempo, los valores de la Cross-SampEn serán mayores, lo que indicaría una sincronía relativamente baja [18]. Al calcular las entropías cruzadas, los patrones que se comparan se toman en pares de las dos series de tiempo diferentes con N puntos {u(i)} y {v(i)}, i=1, ..., N. De un vector de m secuencias de u y de v respectivamente. Los vectores se construyen de la siguiente forma:
Siendo el número de vectores ym (j) cuya distancia de xm (j) se define como:
Correspondiente a una tolerancia r. Similarmente
Es habitual que las dos series de tiempo se normalicen primero, al restar el valor medio de cada serie de datos y luego dividiéndolas entre la desviación estándar. Esta normalización es válida, ya que el interés principal es comparar patrones [19].
Entropía Condicional
La entropía condicional (Conditional entropy, CondH) corresponde a la incertidumbre que permanece en una variable cuando otra variable tiene un valor conocido [20]. Está delimitada por 0 y por la entropía de la variable original. El límite inferior es verdadero cuando X es completamente dependiente de Y, y el límite superior es verdadero cuando X e Y son independientes entre sí. [20] (Ecuaciones 7 y 8).
Donde la entropía dependiente
Por lo tanto, si la CondH es más cercana a la entropía de la variable +H(x), el acoplamiento CRP será mayor y si CondH tiende a 0 el acoplamiento CRP será menor.
Información Mutua
La información mutua (Mutual information, MI) se define como una medida cuánta información de una variable determina la información de otra variable [20]. La información mutua se puede definir de dos maneras diferentes pero equivalentes, ya sea en términos de entropías o en términos de distribuciones de probabilidad, y es simétrica con respecto al orden de X y Y [20] (ecuaciones 10, 11 y 12).
La información mutua es la superposición entre las variables, y por lo tanto, se puede obtener como la suma de las dos entropías H(X), H(Y), menos la entropía conjunta H(X,Y); lo cual elimina toda la información mutua que no está contenida en las variables [20].
De ello se puede inferir que, si la MI tiende a 0, hay una menor asociación entre las variables; por el contrario, si la MI tiende a un valor positivo de X o Y como resultado de la resta de H(X;Y)-H(X|Y), la asociación entre las variables es mayor.
Información Mutua de Rényi
La información mutua de Rényi (Rényi’s Mutual Information, RényiMI) es definida como la divergencia entre la densidad de probabilidad conjunta y el producto de las marginales. En general, RényiMI es definida como Iα (X;Y) [20]. Donde la divergencia de Rényi está definida como:
Cuando
Donde α es el parámetro para encontrar la divergencia entre dos distribuciones de probabilidad y se define: ∀α≠1.
La RényiMI cuantifica la cantidad de información compartida entre dos variables, con un valor alto cuando las variables están fuertemente correlacionadas, y un valor bajo cuando son fuertemente independientes [20].
Análisis estadístico
Los datos se analizaron para determinar la normalidad de los grupos utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov utilizando el software estadístico GraphPad Prism (San Diego, California, EE.UU.).
Se aplicaron comparaciones entre todos los grupos mediante ANOVA de dos vías, seguida de una prueba de Fisher LSD post-hoc. Los datos se expresaron como promedio ± EEM y el nivel de significancia se estableció en α=0.05. Finalmente se compararon los niveles de probabilidad (p) para establecer el algoritmo que mejor detectara la presencia o ausencia del desacoplamiento CRP debido a la endotoxemia.
Resultados
En la Figura 1 se pueden observar con gráficas de barras los resultados del análisis del acoplamiento CRP de los cinco métodos utilizados:
Figura 1 Gráficas de barras para los cuatro grupos de estudio en el largo plazo +7 h: Vehículo (V), Lipopolisacárido (LPS), Lipopolisacárido + Oxitocina (LPS + Ox) y Oxitocina (Ox). En los diferentes paneles se muestran los resultados de los diferentes análisis para cuantificar el acoplamiento cardiorrespiratorio: a) correlación cruzada (X-Corr) b) entropía muestral cruzada (Cross-SampEn) c) entropía condicional (CondH) d) información mutua (MI) y e) información mutua de Renyi (RényiMI), * significancia estadística entre grupos donde p<0.05.
1a) correlación cruzada (X-Corr); 1b) entropía muestral cruzada (Cross-SampEn); 1c) entropía condicional (CondH); 1d) información mutua (MI) y 1e) información mutua de Rényi (RényiMI).
La Figura 1a muestra los resultados de la X-Corr, en los cuales se puede notar una disminución en su valor en el grupo LPS + Ox en comparación con V, el cual fue estadísticamente significativo de acuerdo con la prueba ANOVA (F = 2.467; p = 0.0120). Adicionalmente, los resultados de la Cross-SampEn mostrados en la Figura 1b muestran diferencias significativas (F = 5.676) entre los grupos V vs LPS (p = 0.0031), V vs LPS + Ox (p = 0.0029) y LPS vs Ox (p = 0.0260). Por otro lado, la CondH arrojó diferencias significativas (F = 4.489) entre los otros grupos: V vs LPS (p = 0.0016), V vs LPS + Ox (p = 0.0168) y V vs Ox (p = 0.0375), Fig. 1c.
La Figura 1d exhibe los resultados del método de MI; los grupos que tuvieron diferencias significativas (F = 1.71) fueron únicamente V vs LPS + Ox (p = 0.0358). Finalmente, la Figura 1e revela los resultados de la RényiMI, en donde los grupos con diferencias estadísticas (F = 2.219) fueron V vs LPS + Ox (p = 0.0300).
La Figura 2a muestra señales representativas de EDR y R-R de una rata del grupo V a las +7 h, por otro lado, la Figura 2b muestra de igual manera las señales EDR y R-R de una rata del grupo LPS a las +7 h. De manera visual se puede apreciar la presencia de un mayor acoplamiento CRP en la rata del grupo V en comparación con la rata del grupo LPS.
Figura 2 Señales representativas de las series de tiempo R-R (rojo) con unidades en ms y señales respiratorias derivadas del electrocardiograma EDR (azul) con unidades arbitrarias (U.A.) interpoladas con un spline cúbico a 100 Hz. De manera visual se aprecia un mayor acoplamiento cardiorrespiratorio en el inciso a) roedor del grupo vehículo a las + 7 h posteriores al tratamiento (V, solución salina) en comparación con b) roedor del grupo lipopolisacárido a las + 7 h posteriores al tratamiento (LPS). En el marco inferior izquierdo se indican los valores de entropía condicional (CondH) y entropía muestral cruzada (Cross-SampEn) como indicadores del acoplamiento cardiorrespiratorio (CRP).
Discusión
Este es uno de los primeros estudios que comparó diversos métodos lineales y no lineales para evaluar los efectos de la oxitocina en el acoplamiento CRP durante la endotoxemia. El acoplamiento CRP se asocia a la sinergia entre los sistemas cardiovascular y respiratorio. Estudios indican que esta interacción se origina en el tronco cerebral y las neuronas cardiacas vágales del SNA [21]. Dichas estructuras cerebrales son esenciales para el control de la respiración y del ritmo cardiaco.
Adicionalmente, se ha demostrado que la manifestación de ciertas patologías como las apneas de prematuridad, el síndrome de muerte súbita del lactante, la apnea obstructiva del sueño y el síndrome de Rett favorecen el desacoplamiento CRP, lo cual estaría ligado a una presunta disautonomía en las funciones reguladoras de los sistemas cardiaco y respiratorio [21].Otros hallazgos sobre endotoxemia bacteriana inducida por LPS en mamíferos indican que el LPS provoca un cuadro de inflamación sistémico y de estrés biológico que afecta a múltiples sistemas corporales como lo son el cardiaco, respiratorio, renal y termorregulador, lo cual origina ajustes en las frecuencias cardiaca y respiratoria, vasodilatación cutánea, aumento de la temperatura, entre otras [11,13,22,23].
De acuerdo con la literatura, los valores de los métodos X-Corr[24], CondH[25], MI[24] y RényiMI[26] al ser más cercanos al valor de cero (
Los hallazgos del presente estudio indican que las fluctuaciones cardiacas y respiratorias están desacopladas durante el periodo de endotoxemia, esto sugiere que las funciones reguladoras de estos sistemas se ven modificadas debido al proceso de inflamación sistémico que desencadena el LPS ([11,13]). También se encontró que el grupo LPS + Ox tuvo un menor acoplamiento CRP en comparación con el grupo V (Fig. 1a; Fig. 1d; Fig. 1e), lo que sugiere que la oxitocina no posee efectos fisiológicos que favorezcan el acoplamiento CRP [27].
Estudios revelan que la oxitocina es un neuropéptido que provoca excitación en el sistema arterial y endocrino, lo que podría provocar de manera indirecta un aumento de la frecuencia respiratoria [28]. En contraste, nosotros no encontramos diferencias significativas en la frecuencia cardiaca y respiratoria en roedores tratados únicamente con oxitocina en nuestros estudios previos [11,13]. Las investigaciones apuntan a que la oxitocina en ratas activa los receptores neuronales de esta hormona provocando cambios en los parámetros cardiorrespiratorios [29]. En este sentido, una alteración en la frecuencia cardiaca o respiratoria debido a la oxitocina podría promover el desacoplamiento CRP (Fig 1c). En nuestros estudios previos encontramos que la oxitocina parece actuar como un péptido cardioprotector al favorecer el acoplamiento autonómico colinérgico cardíaco durante la endotoxemia [13]. Dicho efecto cardioprotector se origina debido a que la oxitocina estimula la secreción de péptido natriurético atrial, el cual tiene efectos cardioprotectores comprobados [30]. A pesar de los efectos comprobados de la oxitocina como agente cardioprotector y antiinflamatorio, los hallazgos del presente trabajo indican que no parece restablecer el acoplamiento CRP durante endotoxemia.
Finalmente, la Figura 2 muestra las señales EDR y R-R de una rata del grupo V y del grupo LPS a las + 7 h. De manera visual se puede apreciar un mayor acoplamiento CRP en el grupo V (Fig 2a) en comparación con LPS (Fig 2b). Dicha apreciación visual es concordante con los valores de los métodos CondH y Cross-SampEn. Estos datos sugieren que existe un desacoplamiento CRP producido por la endotoxemia inducida por LPS a largo plazo y que todos los métodos explorados aquí son capaces de detectarlo. Otros hallazgos señalan que la frecuencia cardiaca y la respiratoria están altamente ligadas, por lo cual el cambio en la frecuencia de ventilación o del ritmo cardiaco afecta el ritmo cardiorrespiratorio, estas fluctuaciones se ven mayormente afectadas en procesos patológicos que alteran la actividad nerviosa vagal [4,31], como ejemplo se presenta la endotoxemia inducida por LPS.
Es importante mencionar que la aportación adicional de los resultados aquí presentados respecto a trabajos previos [13], se basan en la implementación de métodos lineales y no lineales para evaluar el desacoplamiento CRP durante la endotoxemia inducida por LPS y los efectos de la oxitocina sobre este. Entre los métodos no lineales se encontró que CondH y Cross-SampEn tuvieron los valores más bajos de (p) entre el grupo V vs LPS en comparación con los métodos MI y RényiMI e incluso el método lineal de X-Corr. Esto puede deberse a que tanto CondH y Cross-SampEn están basados en el análisis de la entropía, el cual ya ha sido utilizado para evaluar satisfactoriamente el acoplamiento CRP en jóvenes y adultos de edad media [1] y recientemente en estados de depresión [32].
Limitaciones
Los algoritmos computacionales utilizados fueron seleccionados por su robustez y validez para la detección de acoplamientos entre series de tiempo; sin embargo, existen otros métodos novedosos que podrían complementar nuestros resultados. Por ejemplo, se ha explorado el método de análisis simbólico conjunto para cuantificar el acoplamiento CRP entre las series de tiempo R-R y señales respiratorias [33]. En estudios futuros se implementarán nuevas metodologías para la cuantificación del acoplamiento CRP.
Por otro lado, la dosis y la vía de administración de la oxitocina (subcutánea) podrían no ser las indicadas para revelar sus efectos en el acoplamiento CRP, a pesar de que en nuestros estudios previos fue capaz de demostrar efectos cardioprotectores durante la endotoxemia inducida por LPS [11]. En estudios futuros es deseable incrementar la dosis de oxitocina y probar nuevas vías de administración, como es el caso de la vía intracerebroventricular (ICV), ya que se ha demostrado que esta administración intracerebral produce cambios en la frecuencia cardiaca [34]. La vía de administración de la dosis podría marcar una diferencia en los efectos de la oxitocina en el acoplamiento CRP.
Conclusiones
En el presente estudio encontramos como hallazgo principal que los métodos de Cross-SampEn y CondH fueron los que presentaron mayores diferencias estadísticas para identificar el desacoplamiento CRP. Adicionalmente se encontró que el desacoplamiento CRP en ratas se ve aumentado por la endotoxemia inducida por LPS en el largo plazo y que la oxitocina administrada subcutáneamente no parece disminuir el desacoplamiento CRP durante la endotoxemia. En conclusión, los métodos no lineales (CondH y Cross-SampEn) parecen ser más apropiados para detectar el desacoplamiento CRP durante la endotoxemia inducida por LPS en comparación con la correlación cruzada. Por lo cual podrían ser una herramienta prometedora para el diagnóstico / pronóstico de procesos inflamatorios sistémicos.
