INTRODUCCIÓN

Después de una lesión que afecta al sistema nervioso, el restablecimiento de las conductas motoras depende de que las fibras nerviosas regeneren y se conecten correctamente a sus blancos, por tanto en el campo de la rehabilitación motora se han realizado grandes esfuerzos y creado múltiples terapias tendientes a fortalecer las conexiones intactas por la lesión y a promover la reconexión de los axones dañados, sin embargo la recuperación de conductas motrices sigue siendo dependiente de la capacidad de regeneración de células del sistema nervioso central (SNC), es decir, de la conectividad de axones periféricos con sus blancos ya que el grado de rehabilitación depende del número de conexiones saludables y nivel máximo en que pueden fortalecerse.

Para comprender el proceso de regeneración del SNC se han estudiado a las sanguijuelas desde hace más de 40 años^[1], pues en ellas se conoce la ubicación, la morfología y la actividad eléctrica de las neuronas mecanosensoriales así como sus conexiones en el SNC, además ofrecen diversas ventajas, como lo son: la capacidad de regenerar in vivo como in vitro, la posibilidad de realizar diversos estudios, tanto moleculares, como electrofisiológicos, bioquímicos y conductuales entre otros, por tanto permite abordar el problema de regeneración neuronal a diferentes niveles con técnicas modernas^[2], y puesto que este organismo es capaz de recuperarse de lesiones en su SNC de forma natural, el estudio de la recuperación motriz después de una lesión inducida en el SNC da la posibilidad de probar diversas formas de estimulación tanto físicas como químicas en un tiempo relativamente corto (2 a 4 semanas), además, las propiedades eléctricas de la membrana neuronal, los canales iónicos y los neurotransmisores, son semejantes o idénticos a los del resto de los animales^[3].

Por otra parte, estudios realizados en animales, han generado resultados alentadores al colocar dispositivos generadores de campos eléctricos en la zona de lesión de médula espinal, lo que ha favorecido la rehabilitación de conductas motoras en animales adultos^[4], también se ha probado la estimulación eléctrica en la rehabilitación periférica^[5,6] y se ha mostrado que favorece la regeneración de neuronas cultivadas del SNC^[7], sin embargo los resultados siguen siendo limitados y aún quedan muchas preguntas por responder. Por este motivo la implementación de técnicas físicas, como lo es espectroscopía fotoacústica (EFA), en áreas biomédicas^[8,9] ha permitido comprender como es la interacción de la luz visible con muestras biológicas, para poder diagnosticar^[10,11] o tratar algunas enfermedades, como lo son diferentes tipos de cáncer^[12,13]. La absorción de luz modulada^[14] y luz continua en la región visible del espectro electromagnético puede generar fenómenos físicos y químicos, ejemplo de esto es la fotosíntesis, la fluorescencia, absorción de vitamina D, entre otros. Para el problema específico de la regeneración del SNC, en este trabajo se propone estudiar la absorción óptica de muestras de tejido y de SNC de la sanguijuela Haementeria officinalis, y con esto determinar cuál es el rango de longitudes de onda óptimo en el que las moléculas de estas muestras están absorbiendo la radiación, y posteriormente analizar si la absorción de luz puede inducir regeneración en estas células y bajo qué condiciones lo haría, si bien existen otros grupos de investigación que trabajan con H. officinalis, hasta donde se sabe no se han reportado estudios acerca de sus propiedades ópticas. Los estudios en sanguijuelas buscan los mecanismos básicos de funcionamiento y respuesta del SNC, precisamente, estos estudios pretenden ayudar a comprender como responde el sistema nervioso a un protocolo de estimulación y dar la pauta para aplicarlos en organismos más cercanos evolutivamente al humano.

METODOLOGÍA

Para producir la lesión en el SNC del organismo adulto completo de H. officinalis, esta se anestesia durante 15 minutos en 10 % de etanol, luego se fija con alfileres entomologicos en un plato con cera y se realiza una incisión ventral en la piel para descubrir el nervio conectivo, el esquema de las partes del organismo de la sanguijuela se muestra en la Figura 1, luego se genera la lesión del cordón nervioso aplicando compresión con unas pinzas (Dumont No. 5) en una extensión de 300 µm, con lo cual los axones se separan interrumpiéndose la continuidad física y eléctrica^[15,16], como se aprecia en la Figura 2. Después se realiza una microdisección para extraer el SNC lesionado, este procedimiento es el mismo para extraer el SNC sin lesionar. Tambien se tomaron segmentos de tejido de la pared corporal del lado ventral de la sanguijuela con aproximadamente 500 µm de espesor.

Figura 1: Diagrama de una sanguijuela y de su SNC, el cual está compuesto de 21 ganglios intermedios y ganglios fusionados en la cabeza y en la cola del animal. La lesión se hace por obturación con pinzas de microdisección sobre el nervio conectivo entre los ganglios segmentales 7 y 8. 

Figura 2: Lesión inducida en el SNC de H. officinalis, se muestra parte del nervio conectivo que une dos ganglios segmentales y el efecto de obturar las fibras nerviosas que conectan a los mismos debido a la lesión. 

Después las muestras de SNC con lesión, sin lesión y de tejido fueron procesadas en un espectrómetro fotoacústico empleando la configuración de transmisión, para cada medición se utilizaron organismos con masa de 0.3 gr. Los espectros de absorción ópticos fueron obtenidos en un rango de longitudes de onda de 250 nm a 900 nm, el arreglo experimental se muestra en la Figura 3 y consta de una lámpara de Xe con monocromador, y un modulador mecánico con una frecuencia fija de 17 Hz. La luz modulada es guiada a través de una fibra óptica hasta la celda fotoacústica, donde se encuentran las muestras a estudiarse. La señal fotoacústica, generada por la absorción óptica de la muestra, es detectada por un micrófono que está conectado a un amplificador Lock-in que a su vez está acoplado a una PC que procesa los datos de amplitud (reportados en unidades arbitrarias u.a.) y fase en función de la longitud de onda.

Figura 3: Arreglo experimental usado para realizar espectroscopía fotoacústica. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La Figura 4 muestra que el SNC de estos organismos absorbe en la region comprendida de 300 nm a 500 nm con 0.20 u.a. (σ = 0.018 u.a., con n=4) y 0.23 u.a. (σ = 0.018 u.a., con n=4) respetivamente en estas longitudes de onda, esto cuando el SNC no está lesionado, a su vez el SNC con lesión tiene una banda de absorción óptica que comienza proxima a 300 nm con 0.25 u.a. (σ = 0.065 u.a., con n=4) decayendo paulatinamente a mayores longitudes de onda. Para el caso de las muestras de tejido se encontró que la absorción óptica presenta un máximo alrededor de 300 nm (σ = 0.039 u.a., con n=2), seguido de un decaimiento lineal hasta 600 nm (σ = 0.063 u.a., con n=2), como lo muestra la, posteriormente una banda de absorción en el rango de 600 nm a 800 nm debida a la presencia de algas que viven en simbiosis con H. officinalis, entonces es posible atribuir está última banda de absorción a que las algas contienen clorofilas.

Figura 4: Espectros de absorción ópticos, obtenidos por EFA, del SNC de H. officinalis. a) Sin lesión, b) con lesión. 

Figura 5: Espectro de absorción óptico, obtenidos por EFA, de tejido de H. officinalis. 

Los resultados mostraron que la absorción de luz modulada, en la región visible del espectro electromagnético, es mayor cuando el SNC se ha lesionado, esto podría atribuirse a que después de una lesión en el nervio conectivo existe una acumulación de células microgliales en la zona de lesión ^[17], por tanto la densidad de la muestra cambia después de la lesión y entonces la luz que llega a la muestra puede ser mayormente absorbida y dispersada, lo cual provoca cambios en el espectro de absorción óptico. Las diferencias obtenidas entre los espectros abren la posibilidad de estudiar la evolución en la regeneración del nervio lesionado y de distinguir ópticamente un SNC con lesión de uno sin lesión.

CONCLUSIONES

El presente trabajo permitió determinar las longitudes de onda en las cuales el SNC y tejido de H. officinalis está absorbiendo más la radiación electromagnética, lo cual indica una mayor interacción con las moléculas que los componen. Es necesario mencionar que este estudio no es posible con técnicas espectroscópicas convencionales, por la naturaleza biológica de las muestras, siendo así importante la implementación de espectroscopía fotoacústica en este tipo de estudios, pues además, esta técnica no es invasiva con la muestra a estudiar. A partir de esto se propone el uso de luz modulada o continua, en las regiones de absorción obtenidas, para investigar si es posible inducir regeneración en el SNC con un haz de luz LED que emita en las longitudes de onda especificas obtenidas en el presente estudio.