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INTRODUCCIÓN
La medicina regenerativa (MR) tiene como objetivo sustituir o complementar los procesos de regeneración tisular mediante el uso de factores de crecimiento, biomateriales y células [1,2,3]. Por otro lado, las investigaciones realizadas por Fredeinstein y cols., mostraron la existencia de un tipo particular de células (células troncales mesenquimales, CTM) en médula ósea (MO), actualmente se sabe que estás residen en diferentes tejidos y comparten características, como: capacidad de auto-renovación y de diferenciación [4-7]. Aunque es posible obtener CTM de tejidos embrionarios, cuestiones éticas y legales no permiten esta práctica. Aunque el principal sitio para la obtención de CTM es la médula ósea, otros tejidos como el adiposo y la gelatina de Wharton poseen una gran reserva de este tipo celular [8]. Independientemente de su origen mesodérmico, las CTM pueden adoptar un destino endodermal o ectodermal, lo que se conoce como: plasticidad celular, la cual se atribuye a la influencia que ejerce el microambiente donde residen, característica relevante para su uso en MR [9-15].
Para que las CTM puedan ser utilizadas en la clínica se debe; a) disponer de un gran número de ellas, b) ser aisladas con procedimientos mínimamente invasivos, c) tener capacidad de diferenciación, d) de ser posible trasplantarlas autóloga o alogénicamente, e) el aislamiento y cultivo deben estar basado en guías de buenas prácticas de manufactura, y cumplir con los postulados de la sociedad internacional para la terapia celular (ISCT) [16,17].
Es por ello que en este trabajo aislaron CTM de médula ósea (MO), tejido adiposo (TA) y gelatina de Wharton (GW) humanos y se caracterizaron en base a los criterios de la Sociedad Internacional para la Terapia Celular (ISCT): morfología fibroblastoide y adherencia al recipiente de cultivo, diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica, y expresión de CD90, CD73 y CD105 [18].
METODOLOGÍA
Aislamiento: la medula ósea fue diluida con solución de buffer de fosfatos (PBS) y se realizó la separación por diferencia de gradiente de densidad con FicollTM Hypaque (SIGMA), las células se recuperaron y se cultivaron con medio MSCBMTM (Mesenchymal Stem Cell Basal Medium PIoeticsTM, Lonza) por 7 días y después fue reemplazado por D-MEM-F12 más 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) y 1% de antibiótico-antimicótico (anti-anti) (GIBCO). El tejido adiposo se incubó con colagenasa tipo 2/PBS (1mg•15mL-1) a 37 °C en agitación constante, se recuperó el botón celular y se cultivó con medio DMEM-F12 más SFB al 10% y 1% de anti-anti. Del cordón umbilical se disecaron los vasos y el tejido restante fue seccionado e incubado con colagenasa tipo 2 y tripsina al 0.1% en PBS a 37 °C, finalmente el sobrenadante se cultivó como se menciona antes.
Todos los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera con humedad saturada y 5% de CO2. Caracterización: a) morfología fibroblastoide y adherencia; los cultivos se mantuvieron en observación con un microscopio Inverso y se realizó el registro fotográfico. b) pruebas de plasticidad celular; para la diferenciación osteogénica las células se cultivaron con medio Stempro® Osteogenesis Differentiation por 21 días y se verifico su diferenciación con una tinción con rojo de Alizarina S (1,2-dihidroxiantraquinona, Merck), 2) para la diferenciación adipogénica, las células se cultivaron en medio Stempro® Adipogenesis Differentiation por 21 días y la diferenciación se corroboró por una tinción con rojo oleoso (Sigma-Aldrich). Citometría de flujo: los cultivos en pase 3 se desprendieron con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM y fueron incubadas con los anticuerpos anti-human; CD105, CD73, CD90 (Biolegend), CD34 (Santa Cruz Biotechnology) y CD45 (ThermoScientific), se fijaron con paraformaldehído (Sigma-Aldrich) y se leyeron en un citómetro de flujo FACScalibur (BectonDickinson).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La medicina regenerativa tiene por objetivo el desarrollo de órganos o tejidos in vitro mediante el empleo de andamios en 3D, factores de crecimiento y células [19], por lo que, las expectativas sobre esta área para el tratamiento de diferentes enfermedades son elevadas. El descubrimiento de las CTM durante el siglo pasado impulsó enormemente el desarrollo de esta área [4,5,20]. En un inicio, las CTM fueron descritas en cultivos derivados de médula ósea, sin embargo, posteriormente se demostró su presencia en la mayoría de los tejidos adultos, embrionarios y extraembrionarios, y que además compartían características, esto sirvió como base para que en el 2006 la ISCT propusiera los criterios básicos que actualmente rigen la caracterización de todas las CTM [4,5,18,21-24].
Aunque en un principio las CTM de MO han constituido el “estándar de oro”, el contar con ellas es limitado debido a que: a) la obtención es invasiva y dolorosa, b) no todas las muestras son adecuadas, c) la capacidad de diferenciación y proliferación es menor, si se comparan con otros tejidos menos desarrollados como la gelatina de Wharton, d) las probabilidades de que los pacientes afecten sus características, principalmente la de autorenovación y diferenciación y e) el tiempo necesario para disponer del número adecuado de células para trasplante autólogo es elevado (>2 meses). Por otro lado, independientemente de la fuente, todas las CTM deben ser cultivadas en base a las buenas prácticas de manufactura para asegurar un producto inocuo [21,25-37]. En el presente trabajo, se aislaron las CTM de MO, TA y GW y se caracterizaron de acuerdo a los criterios de la ISCT. Las células obtenidas de los tres tejidos adquirieron morfología alargada con citoplasma prominente y núcleo céntrico o fibroblastoide, ya que comparten similitud a los fibroblastos [27]. Por otro lado, la plasticidad celular es un elemento clave para el desarrollo de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos, por ello, se comprobó mediante la inducción osteogénica y adipogénica. Las células de los tres tejidos cultivadas con medio osteogénico mostraron positividad para la tinción con rojo de Alizarina (tinción específica para evidenciar acúmulos Ca++ y fosfatos extracelulares), de manera que se manifiestan como estructuras extracelulares que se observan al microscopio. En cuanto a la diferenciación osteogénica, las células presentaron vesículas lipídicas intracelulares en presencia de medio adipogénico durante 21 días; estas vesículas fueron evidentes cuando se tiñeron con rojo Oleoso, por lo tanto, ambos experimentos confirman la capacidad de las CTM para diferenciarse hacia otros tipos celulares, en este caso osteoblastos y adipocitos, respectivamente (Figura 1).
Figura 1: CTM de médula ósea. (a), tejido adiposo (b) y gelatina de Wharton (c) con morfología alargada (flecha) núcleo céntrico, semejante a fibroblastos, por la similitud con este tipo de células. (d, e, f), formación de depósitos extracelulares en CTM de médula ósea, tejido adiposo y gelatina de Wharton respectivamente, las cuales fueron cultivadas con medio osteogénico, donde se puede apreciar la positividad para el colorante rojo de Alizarina (flechas), donde la distribución fue mayor en las CTM de médula ósea. En g, h, i, se observan CTM de médula ósea, tejido adiposo y gelatina de Wharton respectivamente, en donde el medio adipogénico indujo la formación de vesículas lipídicas intracelulares positivas para la tinción con rojo oleoso (flechas). En este caso, se presenta una mayor formación de vesículas lipídicas en las células derivadas de médula ósea.
Lo anterior confirma que las CTM utilizadas se apegaron al segundo de los criterios de la ISCT [16,22,38-46]. El tercer criterio evaluado fue la expresión de CD90, CD73 y CD105. El análisis por citometría de flujo mostró que las células derivadas de MO, TA y GW eran positivas para los antígenos CD73 y CD90 en similares proporciones, mientras que CD105 fue variable, con mayor expresión en las CTM-GW. Sin embargo, la expresión de los tres marcadores fue significativamente mayor en GW. Para el caso de CD34 y CD45, en CTM-TA y CTM-GW la presencia de estos marcadores fue menor al 20% o ausentes, aunque en las CTM de médula ósea, la expresión fue cercana al 0% (figura 2);
Figura 2: Expresión de antígenos CD73, CD90 y CD105 en las CTM de los diferentes tejidos evaluado mediante citometría de flujo. Donde las CTM de médula ósea presentaron el menor porcentaje y por otro lado, los valores de los antígenos hematopoyéticos CD34 y CD45 permanecieron bajos. n = 3. Análisis estadístico mediante ANOVA de una vía. *Diferencia significativa con respecto al control. **Diferencia significativa con respecto a todas las condiciones.
nosotros creemos que esta variación es originada desde el proceso de obtención celular, como se ha comentado en diferentes trabajos, donde los resultados varían de acuerdo al método de obtención [41,47,48]. Con los resultados anteriormente mencionados, se comprueba que existen fuentes alternativas a la MO, que se apegan a los criterios de la ISCT y que cuentan con potencial terapéutico donde la Medicina Regenerativa puede disponer de ellos para su aplicación en diferentes padecimientos. Sin embargo, se propone que las CTM-GW pueden ofrecer grandes ventajas en comparación con las que provienen de médula ósea o tejido adiposo, ya que además de que su obtención no es riesgosa y el tejido es considerado de desecho, el estudio y aplicación de CTM-GW no ocasiona problemas éticos, médicos o legales [23,32,38,45,49,50].
CONCLUSIONES
Las poblaciones celulares obtenidas de las tres fuentes de CTM a través de los métodos convencionales en nuestro laboratorio, mostraron que sus características se apegan a los criterios establecidos por la ISCT [18], ya que cuentan con la morfología, adherencia, plasticidad y por último los marcadores de superficie. Aunque las células de médula ósea se han reconocido como una alternativa terapéutica, las CTM derivadas de gelatina de Wharton representan una mejor opción, ya que éstas provienen de una fuente más accesible y pudieran ser de uso potencial en Medicina Regenerativa en base a los marcadores de superficie y a la plasticidad. Esto significa que, en un futuro no lejano se puedan estar utilizando para la ingeniería de tejidos en nuestro país, como lo hacen en las naciones de gran desarrollo.
