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INTRODUCCIÓN
A nivel mundial, nuevos patógenos zoonóticos emergen (Laperche, 2011), derivados principalmente de la fauna silvestre y de las malas prácticas del manejo de animales domésticos (vacas, cabras, entre otros), lo cual genera problemas en la salud pública (Gummow, 2010; Cabello & Cabello, 2008). Sin embargo; la dinámica ecológica y mecanismos de acción de este tipo de patógenos sigue siendo poco conocida (Whatmore et al., 2015; Valenzuela & Medina, 2014; Woolhouse & Gowtage-Sequeria, 2005; Cleaveland et al., 2001). En este sentido, la brucelosis es una enfermedad zoonótico emergente (EZE) que tiene un impacto significativo en la salud y la economía de comunidades rurales en muchas partes del mundo (Whatmore et al., 2015; Cabello & Cabello, 2008).
Brucella son bacterias Gram negativas, aerobias, no motiles, no esporuladas, capaces de sobrevivir fuera del ambiente celular y otros medios como agua embotellada (2 meses, pH= 8.0 y 8°C) y agua mineral (hasta 72 días, pH 4.2-8.4, 20°C) (Falenski et al., 2011). La supervivencia es de hasta 200 días en el agua natural (pH 9-9.3, 15-18°C, 0.5-9.8%) de la misma región donde el problema de la brucelosis humana data desde 1921 (Cruz-Aviña et al., 2015, Pláceres, 1923). Actualmente, Brucella comprende 14 especies, de las cuales solo el 70% han sido descritas en los últimos 25 años, incluyendo la descripción de nuevos hospedadores acuáticos en cautiverio. Por ejemplo, la trucha arcoíris (Onchoryncus mykiss), el bagre del Nilo (Clarias gariepinus) y diversas especies ranas (Whatmore et al., 2015; Eisenberg et al., 2012; Pappas, 2010; El-Tras et al., 2010). Es por lo anterior que se considera un género en expansión hacia nuevos reservorios o nichos (O’ Callaghan & Whatmore, 2011; El-Tras et al., 2010; Pappas et al., 2006; Gelev & Gelev, 1988). Esta expansión se detectó en el Lago Cráter de la Cuenca Oriental, el cual es de carácter endorreico y está considerado por CONABIO como área prioritaria importante (ANP 122 y RHP 71), que abarca los estados de Puebla, Tlaxcala y Veracruz, donde se presenta una notable prevalencia y morbilidad de brucelosis en el humano (BrH 12-15 %) y en el ganado caprino (BrA 20-30 %) desde hace casi 100 años (Cruz-Aviña et al., 2015; Cruz-Aviña, 2013; Castañeda-Roldán et al., 2005; Pláceres, 1923).
Las infecciones por este tipo de bacterias presentan un efecto negativo sobre la biodiversidad, debido a que alteran significativamente sus tasas de crecimiento y reproducción (O´Callaghan & Whatmore, 2011; Cabello & Cabello, 2008), lo cual vulnera la fauna nativa como resultado de un aumento en la tasa de mortalidad y el potencial riesgo de extinción (Cabello & Cabello, 2008). En México existe un notable incremento en el impacto de las Enfermedades Zoonóticas Emergentes, mismas que pueden afectar la vida silvestre (Bulman & Lamberti, 2011; Jones et al., 2008). El charal de La Preciosa, Poblana letholepis (Álvarez, 1950) es un aterinópsido endémico, restringido al lago cráter La Preciosa de la que existe poca información (Hernández-Rubio et al., 2016; Ceballos & Ortega, 2011; Lira-Guerrero et al., 2008; Flores-Negrete, 1998; Espinosa-Pérez et al., 1993; Díaz-Pardo, 1992; Guerra Magaña, 1986; Álvarez, 1950; De Buen, 1945). Una especie que desde tiempos prehispánicos representa un recurso alimenticio y económicamente importante para los lugareños (Alcocer et al., 2004). Las poblaciones silvestres de P. letholepis se encuentran en riesgo debido a la contaminación de su hábitat. La NOM-059-ECOL-2010 la reporta como una especie amenazada (A) y la lista roja de especies amenazadas IUCN la considera en peligro crítico (CR) (Cruz-Aviña et al., 2015, Cruz-Aviña, 2013, SEMARNAT, 2010; Can-Chulim et al., 2011; Castañeda-Roldán et al., 2005; Alcocer et al., 2004; Contreras-Balderas et al., 2002).
A pesar del reconocimiento científico del charal del lago La Preciosa (P. letholepis), desde hace 70 años, poco se conoce sobre su ecología, enfermedades y aspectos específicos para el logro de su aprovechamiento sustentable. Además, a la fecha no existen acciones concretas para su conservación (Ceballos et al., 2018; Cruz-Aviña et al., 2015; Woolrich-Piña et al., 2012; Alcocer et al., 2010; Bloom et al., 2009; Miller, 1986). El objetivo del presente estudio fue detectar la presencia de la bacteria Brucella melitensis en el charal Poblana letholepis de La Preciosa, mediante métodos microbiológicos y moleculares (PCR), para contribuir así a su preservación y al estudio científico de esta especie mexicana.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de estudio. El Lago La Preciosa (Las Minas) es un lago cráter tipo Maar, monomíctico, cálido tropical de altura (2400 m. snm), de tipo atalasohalino e hipohalino (1.1 gL-1), un pH alcalino (≤9) considerado oligotrófico y con una profundidad máxima de 36 m. Ubicado entre los 19º 21’N y 97º 23’W en la Cuenca Oriental (Alcocer & Bernal, 2010; Armienta et al., 2008; Arredondo-Figueroa, 1983) (Fig. 1).
Trabajo de campo. Para este estudio se realizó un muestreo simple completamente aleatorizado para poblaciones finitas, lo que arrojó una N total de 263 individuos que deberían ser capturados en las estaciones planteadas. Sin embargo, el esfuerzo de muestreo (abril 2014 a mayo 2016) solamente permitió capturar un total de 60 ejemplares de P. letholephis del lago cráter La Preciosa en sitios cercanos a la orilla. La colecta se realizó con un chinchorro (12 x 3 m) de malla cerrada a diferentes profundidades. Los ejemplares se colocaron en bolsas de plástico con agua del lago y hielo conforme a las técnicas descritas por Hernández-Rubio et al., (2016) y Blancas-Arroyo et al., (2014). Los peces se transportaron al Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana del Centro de Investigación en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (CICM-IC-BUAP) para su análisis respectivo. Los organismos fueron sacrificados por shock térmico y se diseccionaron para obtener el tracto digestivo y gónadas. Los charales estudiados se donaron institucionalmente a la Colección Nacional de Peces del Instituto de Biología de la UNAM (CNPE), con número de colección: PE 10146- PE10203.
Trabajo de laboratorio. Se diseñaron dos análisis a partir de métodos diagnóstico directo (aislamiento en placa-agar y PCR punto final).
1. Aislamiento de Brucella sp. en placa-agar. De los ejemplares de P. letholephis se obtuvieron muestras del tracto digestivo y gónadas conforme a la técnica de Amato et al., (1991). Los tejidos fueron centrifugados en tubos Falcon de 50 mL con suero fisiológico (Ringer lactato) y del botón del sedimento se tomó una alícuota de 10 mL para realizar series de diluciones por triplicado en el intervalo de 103 a 108 L, las cuales fueron inoculadas en placas de Petri con agar del medio específico BrucellaBUAP® (Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, CICM, IC, BUAP, Puebla, 2015), con cristal violeta y antibióticos (Alton et al,.1988; Alton et al., 1976; Alton et al., 1972). Las placas se incubaron dentro de frascos de vidrio (2.5 L), con una atmósfera de CO2 al 5%, a 37°C por 48 h (Castañeda-Roldán et al., 2005 modificado; Alton et al., 1988; Alton et al., 1976). La identificación inicial de Brucella fue por morfologia, donde a partir del total de colonias obtenidas se seleccionaron colonias con características típicas del género Brucella, a las cuales se les realizaron pruebas de aglutinación con suero específico anti-Brucella, tinción de Gram, tinción de Zihel-Neelsen (ZH) modificada y pruebas bioquímicas (TSI, Citrato; Urea, LIA, producción de H2S en tiras de acetato de plomo, aglutinación con acriflavina). La identificación de Brucella melitensis se estableció mediante pruebas de sensibilidad a colorantes con Tionina (diluciones 1:100,000, 1:50,000 y 1:25,000), Fucsina (115937 Merck Millipore) (dilución 1:10,000) y Safranina (115948 Merck Millipore) (dilución de 1:10,000) (Alton et al., 1988). También se calculó el total de resultados positivos obtenidos para Brucella melitensis derivados de las muestras. Los primo aislamientos se separaron durante las siguientes 8 a 24 h y se resembraron en el medio BrucellaBUAP® bajo las condiciones anteriormente descritas. Posteriormente se les realizaron las pruebas (SAT), 2-β-mercaptoetanol (2BME) y Serion ELISA classic Brucella IgG/IgM/IgA. Éstos se llevaron a cabo en el depósito y comparativamente con los controles positivos de cepas vacunales de Brucella Rev-1 y Brucella M16 (Yagupsky,1999; Alton et al.,1988).
Test rosa de Bengala.- El antígeno rosa de Bengala (8% concentración celular) y suero control positivo (22°C), se mezclaron con la suspensión bacteriana (30 µL cada uno). La mezcla se agitó suavemente en un agitador de balanceo (Boyn, SK-R330-Pro), durante 5 min y se depositó la suspensión como gota de 2 cm de diámetro, en placa de vidrio esmerilada. La aglutinación visible se consideró positiva (OIE, 2004; Alton et al., 1988).
Test de Rivanol.- El antígeno de Rivanol-Brucella y la solución de Rivanol fueron obtenidos en el Laboratorio de Patogenicidad bacteriana del CICM-IC-BUAP. El ensayo se realizó mezclando 40 mL de muestra de suero con igual volumen de Rivanol. La solución se agitó en un tubo de ensayo, se dejó reposar durante 5-60 minutos y se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm. Se mezclaron 30 mL de antígeno de Rivanol con 80 mL, 40 mL, 20 mL y 10 mL del sobrenadante, respectivamente, para obtener diluciones 1:25, 1:50, 1: 100 y 1: 200. Las placas se rotaron y mantuvieron durante seis minutos bajo cubierta para evitar la evaporación, seis minutos después las placas fueron rotadas de nuevo. La aglutinación completa a la 1:25 fue considerada positiva (Quinn et al., 1994).
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2. PCR-Punto Final
- Purificación de ADN. Se procedió a purificar el ADN bacteriano de los aislamientos derivados del tejido de P. letholephis con sospecha de Brucella, a través de un Kit genómico de purificación ADN-NORGEN 21550 (Norgen Biotek Corporation, Ontario, Canadá) que permite obtener ADN de alta calidad, a partir de tan sólo 10 células bacterianas en 1 mL de muestra (Shell et al., 2013) hasta obtener 5 ng/µL de ADN bacteriano en cada muestra, con una pureza en la absorbancia de 260/280 nm.
- Análisis Molecular. Se realizó un análisis de la cadena en reacción de la polimerasa PCR para comprobar que el ADN de las colonias aisladas pertenecía al género Brucella, para lo cual se extrajo el ADN total bacteriano de cepas de referencia. La amplificación del gen bp26 se realizó con cebadores específicos para el género Brucella (Cloeckaert et al., 2011), mediante el Kit comercial (Genomic DNA Purification, Thermo ScientificTM, Kit Fermentas). Para la cuantificación de ADN extraído se usó un Kit comercial (Quant-iTR ds DNA HS Assay Kit, de Invitrogen). En los cebadores y la PCR se usó el método descrito por García-Yoldi et al., (2006) y el programa miniPCRTM (Cambridge, Ma, USA). Los cebadores utilizados fueron: Oligo 1: 5’GCCCCTGACATAACCCGCTT3’ y Oligo 2: 5’GAGCGTGACATTTGCCGATA3’. El carril M indica el Marcador molecular. Las cepas de referencia empleadas como controles positivos fueron B. S19 (carril 1) y B. M16 (carril 2) y como control negativo se utilizó Escherichia coli (carril 3), y el ADN bacteriano extraído de P. letholepis (carril 4).
RESULTADOS
Analisis Microbiológico y Primoaislamiento.- Se logró el primoaislamiento para Brucella en 40 de las 60 muestras de P. letholepis (66.66%) en el tracto digestivo y gónadas de los ejemplares. Las muestras se resembraron por triplicado y posterior a las 48 hrs fueron positivas a pruebas de diagnostico de rutina para Brucella melitensis: rosa de Bengala, Gram, Rivanol, SAT y 2ME (Tabla 1). Las muestras restantes de este estudio resultaron negativas o indeterminadas con un bajo porcentaje en concentraciones de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en rango de 1x106 hasta 1x 1010.
Tabla 1 Resultados de las pruebas positivas a las pruebas bioquímicas de diagnóstico de rutina para la identificación de Brucella aislado de MM de P. letholepis: rosa de Bengala, Gram, Rivanol, SAT y 2ME. Los muestras restantes de este estudio resultaron negativas o indeterminadas a estas pruebas con un bajo porcentaje en concentraciones de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de 1x106 hasta 1010.
| Especie | Biotipo | Oxidasa | Necesidad de CO2 | Producción de H2S | Ureasa | Tionina 1:25 000 y 1:50 000 | Safranina 1: 10 000 | Fucsina 1:50 000 |
| B. melitensis 16 M | Biotipo 1 | (+) | (-) | (-) | V | (+) | (+) | (+) |
| B. melitensis aislada de MM de P. letholepis | Biotipo 1 | (+) | (-) | (-) | V (24 horas) (+) | (+) | (+) | (+) |
Actividad metabólica.- CO2 independiente. No produjo H2S. Mostró crecimiento positivo en presencia de fucsina básica y de tionina, positivo para safranina e hidrolizó de manera normal la urea.
Detección por PCR punto final.- Se obtuvo la ampliación del gen bp26 con longitud de 1029 pb (carril M, marcador molecular) de las muestras del ADN bacteriano purificado (carril 4) y se les comparó con los controles positivos B. M16 (carril 1), B. S19 (carril 2), se utilizó ADN de E. coli como control negativo (carril 3); siendo positivas 24 muestras a Brucella (40%) del total analizado (Fig. 2).
Figura 2 Ampliación del gen bp26 (específico para el género Brucella). Los cebadores fueron: (Oligo 1: 5’GCCCCTGACATAACCCGCTT3’, Oligo 2: 5’GAGCGTGACATTTGCCGATA3’). Carril M (Marcador molecular); Carril 1 y 2, cepas de referencia empleadas como controles positivos, B. S19 y B. M16, respectivamente y Carril 3, cepa de referencia de E. coli como control negativo; línea 4, ADN bacteriano extraído de tejidos blandos de Poblana letholepis.
DISCUSIÓN
Aunque la brucelosis ha sido reportada con anterioridad en humanos, animales domésticos, animales silvestres y animales marinos (Godfroid et al., 2011; Godfroid et al., 2010; OIE, 2004; Pedley & Pond, 2003; Moreno et al., 2002; Godfroid, 2002; Corbel & Brinley-Morgan, 1984), este es el primer reporte sobre la presencia de Brucella melitensis en P. letholepis dentro de un sistema acuático léntico endorreico, siendo descritos los peces de agua dulce como portadores sintomáticos. El reporte de la diseminación de Brucella hacia nuevos organismos o reservorios representa un hito epistemológico, ya que antiguamente se consideraba que la brucelosis era una patología exclusiva de los mamíferos (Jones et al., 2008; OIE, 2004). Los resultados encontrados comprueban la complejidad del problema ambiental, así como la evolución constante del patógeno; su migración y colonización hacia nuevos hospederos, incluido el ambiente acuático (Cruz-Aviña et al., 2015; Osterman & Moriyón, 2006). Además, su función de vector para varios patógenos bacterianos zoonóticos, donde se incluyen Aeromonas spp. (Palumbo et al., 1985), Vibrio spp. (Lehane & Rawlin, 2000), algunas especies de la familia de las enterobacterias como Edwardsiella spp. (Meyer & Bullock, 1973), Mycobacterium spp. (Ho et al., 2006), Streptococcus spp. (Weinstein et al., 1997) y Erysiplothrix (Gorby & Peacock, 1988). En cuanto a la relación con Brucella melitensis, El-Tras et al. (2010) y Salem & Mohsen (1997), reportan que el bagre del Nilo (Clarias gariepinus) es susceptible a contraer esta bacteria. Sin embargo, se trata de B. melitensis biovar 3, una biovariedad que no está reportada para México. Los resultados del presente estudio (nt=60; n1=40 muestras positivas en placa de Agar (66.66%) y n2=24 muestras positivas para PCR (40%)), demuestran que el charal endémico del lago cráter La Preciosa puede ser infectado naturalmente por B. melitensis biovar 1 y sugerir que P. letholepis debe ser considerada como potencial reservorio para B. melitensis biovar 1, representando un papel clave en la epidemiología de la enfermedad en la región del Cuenca Oriental, área endémica de brucelosis humana y de ganado caprino (Cruz-Aviña et al., 2015). Aunque el objetivo del estudio no era estimar la frecuencia de la infección por Brucella en el charal del lago La Preciosa en la región, la detección de B. melitensis biovar 1 en un 66.66% de las muestras de peces en varios sitios del lago cráter, sugiere un alto nivel de exposición en estos cuerpos de agua de la Cuenca Oriental. En contraste, a lo reportado por Salem & Mohsen (1997) y El- Tras et al. (2010); los resultados de esta investigación mostraron un número de positivos por PCR importante (40%). Adicionalmente, en estos cuerpos de agua endorreicos y lénticos, hay una mayor probabilidad de contaminación microbiológica como resultado del acceso directo al ganado caprino que pace sin control (libre) en la zona y sus materiales contaminantes (fetos abortados, membranas fetales, placenta, orina, etc.). Por lo que se incrementa el potencial de contaminación por Brucella. Aunado que los peces pueden infectarse con facilidad por bacterias zoonóticas en ambientes acuáticos contaminados (Guzmán & Campos 2004; Pal & Gupta, 1992; Geldreich & Clarke, 1966;). Por su parte, Salem & Mohsen (1997) reportan lesiones cutáneas en bagres (Clarias gariepinus) inoculados experimentalmente con 105 células de B. melitensis biovar 3. Sin embargo, en la recolección de organismos, no se detectaron lesiones cutáneas superficiales visibles. Aunque hay que hacer énfasis entre la gran diferencia de tamaño del bagre C. gariepinus comparado con el aterínido P. letholepis. La evidencia sugiere por primera vez, un posible vínculo entre la brucelosis en peces de agua dulce y la brucelosis en otras especies. En este sentido, B. melitensis biovar 1 es la causa principal de la brucelosis en caprinos y humanos en la zona de la Cuenca Oriental, donde existe una incidencia del 10% de brucelosis en humanos y del 30% de brucelosis en ganado caprino, datos que se encuentran por encima de la media nacional (Cruz-Aviña et al., 2015; García-Juárez, 2014). Lo anterior también se relaciona con el hecho de que las cabras infectadas pacen libres por el campo abierto y a la orilla de los Lagos Cráter (La Preciosa), ambientes susceptibles debido al tipo de suelo (cinerítico) y la naturaleza endorreica de estos cuerpos de agua, lo que facilita la contaminación microbiológica de tipo mecánica por arrastre, misma que se maximiza en la época de lluvias (Cruz-Aviña et al., 2017; Cruz-Aviña et al., 2015; Cotruvo et al., 2004; Alcocer et al., 2004). Asimismo, persiste entre los lugareños una alta incidencia de brucelosis humana por el contacto con rumiantes (ganado caprino) expuestos e infectados y el consumo de algunos de sus productos o derivados, por ejemplo, leche sin pasteurizar y queso crudo (Cruz-Aviña et al., 2015). Esta alta incidencia también se ha reportado para el bagre del Nilo (Clarias gariepinus), derivado del consumo humano de productos lácteos crudos o sin hervir procedentes de los hatos de ganado artiodáctilo o camellos (Jennings et al., 2007; Almuneef et al., 2004; Namiduru et al., 2003; Kiel & Khan, 1993; Bilal et al., 1991).
Por su parte, la aparición de un nuevo agente patógeno tras un salto de taxón o de especie representa la colonización exitosa de un nuevo hábitat. Pese a poseer distintos hospedadores preferentes, tanto B. abortus como B. suis se han aislado en varias especies silvestres en el mundo, lo que resulta menos frecuente con B. melitensis (Dobson & Foufopoulos, 2001; Daszak et al., 2000).
Cabe señalar, que los resultados del estudio por métodos microbiológicos son más cercanos a B. melitensis biovar 1, lo cual coincide en línea a lo reportado por Cruz-Aviña et al. (2017) y Cruz-Aviña et al. (2015) en este cuerpo de agua (Lago Cráter La Preciosa). Sin embargo, la patogénesis de Brucella spp. en las especies silvestres no se ha definido todavía con suficiente precisión (Kang et al., 2011), su prevalencia es generalmente baja o muy baja, por lo que el comportamiento individual y las interacciones entre fauna silvestre y ganado doméstico, no son los factores de mayor relevancia epidemiológica en la potencial transmisión de esta bacteria. Puesto que las pruebas indirectas, basadas normalmente en el diagnóstico serológico en muestras de sangre o leche, no pueden identificar la especie de Brucella involucrada. Es preciso recurrir, siempre que sea posible, al diagnóstico bacteriológico utilizando técnicas clásicas que siguen vigentes como confirmatoria a nivel mundial (OIE, 2004) o aquellas basadas en la biología molecular (PCR). Sin embargo; las pruebas serológicas no siempre son capaces de determinar el microorganismo patógeno, y menos aún; cuando no hay información de las capacidades genéticas de respuesta al ambiente de la brucelas procedente del medio silvestre (Kang et al., 2011). Por estas razones, se utilizaron tanto las técnicas clásicas microbiológicas como por PCR, donde se amplificó al gen bp26 especifico del género Brucella. Estos resultados concuerdan con lo sugerido por Cloeckaert et al. (2011), Pappas (2010), Scholz et al. (2008) y Pappas et al. (2006), quienes sugieren que el género Brucella puede potencialmente afectar a una gama ecológica amplia (Scholz et al., 2016), incluyendo actualmente a peces nativos como P. letholepis. Al respecto, P. leptholepis ha aumentado su potencial estatus de peligro crítico (CP), debido área de distribución restringida (≤100 km2) de Grado 4 de acuerdo con el criterio de distribución (MER) de carácter microendémica (Aldama et al., 2007). La especie P. letholepis solo reside en el lago cráter La Preciosa y este lago al igual que los otros lagos cráter de la Región sufre problemas de contaminación microbiológica sistemática e histórica (Cruz-Aviña et al., 2017 Alcocer et al., 2004). Adicionalmente se reportan hasta 22 tipos diferentes de parásitos para este Atherínido, incluyendo especies zoonóticas (Moreno-Navarrete & Aguilar-Aguilar, 2013; De León et al., 2008 y Coyote, 2000) y ahora se incluye a Brucella como de potencial riesgo zoonótico (López-Goñi et al., 2011).
Hasta hace unas décadas se reconocía históricamente las diferencias entre especies de Brucella por el tropismo, la patogenicidad y la expresión fenotípica del huésped, hoy en día habrá que pensar en otros aspectos, nuevas posibilidades y generar nuevos métodos de diagnóstico para especies nativas. La cepa aislada de Brucella melitensis biovar 1, es capaz de migrar del ganado caprino, al agua natural, peces y potencialmente al resto de biodiversidad nativa, con incidencia directa en los habitantes de las comunidades aledañas. A pesar de las nulas prácticas zoosanitarias en la Cuenca Oriental (cabras infectadas pastando sin control), esta investigación aporta datos relevantes para mejorar entendimiento del papel que juegan estos nuevos hospederos de la enfermedad. Aunque faltan estudios concluyentes a largo plazo para entender el rol de estos “nuevos jugadores” epidemiológicos, se requiere alertar sobre la incidencia potencial de este patógeno en reservorios no convencionales, para establecer medidas de prevención en la Región de estudio, con la finalidad de comprender mejor a esta enfermedad zoonótica y reconocer la importancia de la fauna nativa en la transmisión y permanencia de la brucelosis en áreas naturales.
CONCLUSIONES
Se determinó la presencia de Brucella melitensis en tejidos blandos del Charal Poblana letholepis del lago cráter La Preciosa Puebla, México, por medio de métodos microbiológicos y moleculares, con una incidencia del (66%) del primoaislamiento y (40%) de las pruebas confirmatorias por PCR, demostrándose la transmisión por interfaz de la enfermedad y el potencial riesgo ecológico en la ictiofauna nativa de la región de los lagos cráter como nuevo reservorio de Brucella.
