INTRODUCCIÓN

En biotecnología y medicina, el cultivo in vitro de células animales (vertebrados) se encuentra muy desarrollado y mayormente orientado al tratamiento y cura de padecimientos como el cáncer, enfermedades degenerativas y autoinmunes, etc. (^{Rinkevich, 1999}, ²⁰⁰⁵). En invertebrados de fila como Porifera, Mollusca, Crustacea y Echinodermata, la tecnología de cultivo celular in vitro es más reciente y reporta resultados mucho más modestos (^{Odintsova et al., 1994}; ^{Awaji & Machii, 2011}). En moluscos, por ejemplo, los pocos estudios relativos a esta tecnología se han llevado a cabo en grupos productores de perlas, como ostras perleras (Zhang et al., 2006; ^{Gong et al., 2008}), almejas de agua dulce (^{Barik et al., 2004}; ^{Van Phuc et al., 2011}), almejas marinas (^{Endoh & Hasegawa, 2006}), y abulón (^{van der Merwe et al., 2010}; ^{Pichon et al., 2013}; ^{Kim et al., 2014}). Estos estudios surgen como una necesidad de reducir las altas tasas de mortalidad y rechazo de injertos (30-50%) derivados de la cirugía de inserción de un núcleo esférico y una pieza de manto de un molusco donador en la gónada de un molusco receptor, con el fin de provocar su irritación y la secreción de nácar para formar la perla (^{Taylor & Strack, 2008}). La mayoría de estos estudios reportan la capacidad de algunas células somáticas, particularmente del manto, para regenerarse y proliferar in vitro, a expensas de moléculas y genes involucrados en el proceso de biomineralización y síntesis de cristales de aragonita y calcita. Sin embargo, la definición de una línea celular estable ha sido difícil de lograr en moluscos, básicamente por problemas de contaminación microbiana (^{Mirjalili et al., 2005}) y por el escaso entendimiento sobre la interacción de los principales factores que regulan la viabilidad e integridad del cultivo celular (^{Rinkevich, 2005}).

A nivel mundial, el cultivo de perlas es una actividad acuícola consolidada y muy lucrativa en algunos países de Asia y el Pacífico Sur (^{Taylor & Strack, 2008}). En esta actividad se utilizan comúnmente tres ostras perleras del género Pinctada: P. fucata (Gould), P. margaritifera (Linnaeus) y P. maxima (Jameson). En América Latina, el cultivo de perlas fue una actividad muy rentable a finales del siglo XIX y principios del siglo XX, y aunque después fue un tanto olvidada, vive un gradual resurgimiento en países como México, Chile, Ecuador y Venezuela (^{Saucedo et al., 2017}). En el noroeste de México en particular, existen dos especies que sustentan el cultivo de perlas, la madreperla P. mazatlanica (Hanley, 1856) y la concha nácar Pteria sterna (Gould, 1851) (^{Kiefert et al., 2004}). Dado que las estadísticas de mortalidad y rechazo post-injerto son altas en estas especies, la evaluación de opciones como el cultivo in vitro de manto, que representa una etapa previa al cultivo in vitro de perlas, resultan interesantes y novedosas para reducir estas cifras. El presente trabajo está dirigido a definir las condiciones básicas para el cultivo primario in vitro de células y explantes de manto de la madreperla P. mazatlanica, analizando la potencial aplicación de esta técnica en el cultivo de perlas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación del sustrato celular y medios de cultivo. Se utilizaron adultos cultivados de P. mazatlanica (60 ± 7.8 mm de altura de la concha), los cuales fueron limpiados de epifauna con un cepillo y alcohol etílico al 70% y mantenidos en agua de mar filtrada e irradiada con luz UV para depurar los tejidos. Para el cultivo celular, una solución de Poli-D-lisina (Cat #81358, Sigma, St. Louis, MO) se diluyó en amortiguador estéril de boratos (0.15 M; pH 8.3; 0.1 mg/mL), se agregó en placas multipozos por triplicado (24 pozos, 6´4; Cat #3526, Corning, NY), y se incubó a 37 °C por 3 h. Para evitar contaminación, cada placa se lavó tres veces con solución estéril de fosfatos bajo condiciones de bioseguridad en una campana de flujo laminar (Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA) (^{Odintsova et al., 1994}; ^{Mirjalili et al., 2005}).

Se evaluaron tres diferentes medios de cultivo preparados también bajo la campana de flujo laminar: (1) Medio MegaCell^® RPMI-1640 (Cat #3817, Sigma); (2) 50% de MegaCell^® Minimun Essential Medium Eagle (Cat #M-4067, Sigma) y 50% de MegaCell^® Dulbecco´s Modified Eagle’s (Cat #M-3942, Sigma); y (3) un medio de cultivo control con solución Hanks (Cat #H-8264, Sigma). Todos los medios se adicionaron con L-Glutamina (4 mM), 0.1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero fetal de bovino (SFB) y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Aislamiento mecánico y disgregación enzimática del manto. Se extrajo una pieza de manto de 40 mm de longitud de la región paleal de cada ostra depurada, la cual se colocó en una caja de Petri con solución Hanks, rojo Fenol y penicilina-estreptomicina (0.1%). Cada pieza se cortó a su vez en piezas más pequeñas (~1 mm) que se disgregaron con seis enzimas comerciales: (1) Tripsina-EDTA (E.C. 3.4.21.4; 1X); (2) Colagenasa I (5U/mg; 0.5%; E.C. 3.4.24.3); (3) Colagenasa I (414 U/mg; (4) Proteasa XIV (0.1%; 3.4.24.31); (5) Proteinasa K (2.5%; E.C. 3.4.21.64); y (6) 1% (p/v) de una enzima proteolítica de Trichoderma herzianum (Rifai).

La disgregación del manto se hizo también a tres temperaturas de incubación: 15, 37 y 46 °C. En cada caso se determinó el rendimiento (cel/mL) y viabilidad (%) de los cultivos mediante tinción con azul Tripano 0.4%. El conteo de células viables y no viables se hizo a intervalos de 20 min durante 120 min, utilizando un hemocitómetro (Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Siembra de células disgregadas y explantes de manto. Las células disgregadas se centrifugaron (180 g, 15 min, 4°C), se pasaron a través de una columna de fibra de vidrio para su depuración y se sembraron en placas multipozo (24 pozos, 4´6) (^{Dharmaraj & Suja, 2002}). Adicionalmente, dos explantes de manto de 3 mm de longitud se sembraron en cada pozo de nuevas placas de cultivo. Ambos modelos (células disgregadas y explantes) se manejaron por triplicado mediante un diseño experimental que incluyó los tres medios de cultivo (y el control), con sustrato y sin sustrato. Los cultivos se mantuvieron a 23 °C en una incubadora (Thermo Fisher Scientific) con 3% de flujo continuo de CO₂. La observación se hizo a diario bajo un microscopio invertido (Olympus The Americas, Central Valley, PA).

Evaluación de la osmolaridad. Se siguieron los mismos procedimientos arriba descritos, pero utilizando medio Megacell^® (RPMI-1640) adicionado con 3% de SFB. Se evaluaron cuatro diferentes osmolaridades del medio de cultivo: 0.15, 0.30, 0.45 y 0.60 M de NaCl. El medio en cada caso se preparó con agua de mar estéril a 4 °C, 0.1% de penicilina-estreptomicina y L-glutamina (4 mM). Después de un periodo de incubación de 48 h, se evaluó el cambio de coloración de cada medio de cultivo por efecto de su acidificación (^{Perez-Camps & García-Ximénez, 2008}).

Evaluación de la absorción de calcio. Para evaluar la absorción de calcio por parte del manto a cada osmolaridad, se siguió el mismo procedimiento anterior, sembrando dos explantes en placas de cultivo (24 pozos, 4´6), sin recubrimiento, con poli-D-lisina. Cada día se retiraron y se fijaron en formol al 10% dos explantes por tratamiento para evaluar la acumulación de calcio mediante la técnica histoquímica de rojo de Alizarina S (^{McGee-Russell, 1958}). Este procedimiento se repitió en tres ocasiones tuvo una duración de siete días. El nivel de absorción de calcio por parte del manto se analizó también por medio de espectrofotometría de absorción atómica, según la norma NMX-AA-051-SCFI-2001.

RESULTADOS

Rendimiento y viabilidad celular. No se presentó contaminación del sustrato ni los medios de cultivo durante la preparación y almacenamiento. El rendimiento de la colagenasa I (5 U/mg) y la enzima de T. harzianum fue muy pobre y no promovieron la liberación de células viables a ninguna de las tres temperaturas evaluadas (datos no mostrados). A 15 °C, un mayor número de células viables se liberaron con la colagenasa I a 414 U/mg (~100´10³ cel/mL) y la proteasa XIV (~60´10³ cel/mL) a los 60 min (Fig. 1a); la tripsina y proteinasa K liberaron muy pocas células (20 y 40´10³ cel/mL). La mayor viabilidad celular se obtuvo durante los primeros 40 min con la proteasa XIV (70-100%) y la tripsina y proteinasa K (50-100%) y la menor viabilidad celular con la colagenasa I (5 y 414 U/mg) (20-70%) (Fig. 2a).

Figura 1a-c Rendimiento in vitro (cel/mL) de células de manto de madreperla Pinctada mazatlanica disgregadas con cuatro enzimas a cuatro diferentes temperaturas de incubación: 15 °C (a), 37 °C (b), y 46°C (c). 

Figuras 2 Viabilidad in vitro (%) de células de manto de madreperla Pinctada mazatlanica incubadas a cuatro diferentes temperaturas: 15 °C (a), 37 °C (b), y 46 °C (c). 

A 37°C, el número de células viables obtenidas con la colagenasa I fue del 100% (Fig. 1b) y el rendimiento de 120×10³ cel/mL a los 60 min (Fig. 2b). La proteasa fue ineficiente bajo estas condiciones (<20×10³ cel/mL), aunque mantuvo una elevada viabilidad celular (100%). El número de células liberadas con la tripsina y proteinasa K osciló entre 40y 80×10³ cel/mL, aunque con valores de viabilidad muy dispares, dependiendo del periodo de exposición a la enzima (0-100%).

A 46 °C, las cuatro enzimas promovieron una buena viabilidad celular durante los primeros minutos de exposición (Fig. 1c), pero con rendimientos mínimos (Fig. 2c). La colagenasa I promovió la liberación del mayor número de células a los 40 min (222×10³ cel/mL), pero disminuyó su viabilidad (~40%).

Adhesión y proliferación celular. Los mejores resultados se obtuvieron con el medio RPMI-1640, con poli-D-lisina, a 37 °C. Bajo estas condiciones, las células disgregadas comenzaron a adherirse a la placa y a cambiar de la forma redonda a la típica de fibroblasto a partir de tres días (Fig. 3a). Aquí la viabilidad celular se mantuvo por 25 días sin contaminación y fue posible observar células en mitosis y proliferación celular continua. Por el contrario, los medios de cultivo restantes no permitieron obtener resultados satisfactorios en términos de adhesión y proliferación celular.

Figura 3 Microfotografías (40×) de manto de madreperla Pinctada mazatlanica cultivados en medio RPM-1640, mostrando células disgregadas cambiando de forma a fibroblastos (a), un explante con la típica estructura del tejido sano (b), y un explante con conglomerados de células migrando hacia fuera a la molaridad de 0.6 M (c). 

En los explantes se observó proliferación celular solo en el medio RPMI-1640, sin poli-D-lisina, a 37 °C. Bajo estas condiciones, la parte central del explante se regeneró, cubrió la totalidad del fondo y paredes del pozo y se mantuvo viable biológicamente hasta por 20 días. Incluso fue posible observar fibras musculares transversales y longitudinales en proceso de proliferación con abundante tejido conectivo (Fig. 3b).

Osmolaridad del medio de cultivo. Se trabajó con explantes de manto cultivados en el medio RPMI-1640, a 37 °C, sin sustrato, dado que estas variables arrojaron mejores resultados de los ensayos previos. El mayor crecimiento y migración de conglomerados de células hacia fuera del tejido ocurrió a partir del tercer día de siembra a 0.6 M, en comparación con las restantes osmolaridades. Estas células llegaron a cubrir casi la totalidad del pozo al cuarto día de cultivo (Fig. 3c), sin registro de crecimiento microbiano en ningún tratamiento.

Absorción de calcio. La acumulación aparente de calcio no se detectó con la tinción de rojo de Alizarina en ninguna de las osmolaridades durante los siete días del ensayo. Por el contrario, la técnica de espectrofotometría de absorción atómica reveló un 55% de abatimiento en los niveles de calcio a 0.6 M (335 a 210 µg/mL) entre el inicio y final del cultivo de explantes, en contraste con lo ocurrido en las restantes osmolaridades (Fig. 4).

Figura 4 Variaciones en la concentración de calcio en medio de cultivo RPMI-1640 a diferentes molaridades, en explantes de manto de madreperla Pinctada mazatlanica. 

DISCUSIÓN

La evidencia de este estudio indica que los mejores resultados de disgregación, adhesión y regeneración celular, así como de estructura celular (cambio a la forma de fibroblasto) del manto de P. mazatlanica ocurrieron con el medio RPMI-1640, a 37 °C, con poli-D-lisina (células) y sin poli-D-lisina (explantes). Considerando que el manto en los moluscos es responsable de numerosas funciones especializadas, incluyendo la biomineralización y formación de la perla, y que ambos procesos están regulados por una compleja interacción entre componentes orgánicos e inorgánicos (^{García-Gasca et al., 1994}; ^{Levi et al., 1998}; ^{Zang et al., 2006}), la definición de condiciones óptimas para su cultivo in vitro es aún contradictoria dependiendo de la especie y el tejido cultivado. Por ejemplo, la evaluación de medios de cultivo reporta una mayor adhesión, viabilidad y regeneración de las células del manto en el medio DMEN/F12 para el caso de las almejas de agua dulce Lamellidens marginalis (Sippi) (^{Barik et al., 2004}) y Sinohyriopsis cumingii (Lea) (^{Van Phuc et al., 2011}); el 2´L15 de Leibovitz para el manto de la almeja japonesa Patinopecten yessoensis (Jay) (^{Endoh y Hasegawa, 2006}); el L15 y M199 para las células del manto del abulón Haliotis varia (Linnaeus) (^{Suja et al., 2007}) y el Pf-CM2.5 (mezcla 1:1 de 2´ Leibovitz y M199) con la ostra perlera japonesa P. fucata (^{Gong et al., 2008}).

El uso de sustratos celulares y factores de crecimiento también se mantiene como un aspecto controversial en el desarrollo de tecnología para el cultivo in vitro de células somáticas en moluscos. Existen reportes de una mejora en la adhesión de diferentes células del mejillón Mytilus sp. con el uso de poli-L-lisina y fibronectina (^{Odintsova et al., 1994}), así como de un mejor anclaje de las células de larvas trocóforas del abulón rojo H. rufescens (Linnaeus) con poli-D-lisina y fibronectina (^{Naganuma et al., 1994}). Sin embargo, también se ha señalado la inexistencia de efectos claros de estas mismas moléculas en las propiedades de adhesión de las células de glándula digestiva del mejillón M. galloprovincialis (Lamarck) (^{Robledo & Cajaraville, 1997}). Algunos autores han sugerido incluso que las diferencias en las propiedades de adhesión, regeneración y estructura celular se deben al efecto de otros factores reguladores, como la temperatura de incubación (^{Awaji y Machii, 2011}), la salinidad (^{Kim et al., 2014}) y molaridad del medio de cultivo (^{Perez-Camps & García-Ximénez, 2008}). Estos resultados hacen necesario investigar más sobre el efecto de estos factores reguladores en la estabilidad e integridad de los cultivos de manto en P. mazatlanica y otras especies de moluscos productores de perlas, tanto para confirmar como para mejorar los resultados obtenidos en este estudio.

Todas las células de manto obtenidas mediante disgregación enzimática se adhirieron con éxito al sustrato, y después de iniciar un proceso de proliferación en monocapa, cambiaron de la forma redonda a la típica forma de fibroblasto después del tercer día de cultivo. Sin embargo, la gran variabilidad en la concentración de células libres que se obtuvieron (0-100%) sugiere que las enzimas evaluadas fueron inespecíficas para cultivar células del manto y/o que actuaron sobre sustratos análogos. Bajo estas condiciones, la colagenasa I (ampliada de 5 a 414 U/mg) fue la enzima que claramente incrementó más la viabilidad y rendimiento celular a todas las temperaturas de cultivo, alcanzando una densidad máxima de 120 ×10³ cel/mL a 37 °C. Se sabe que la mayoría de las colagenasas degradan hebras helicoidales de colágeno que son abundantes en el tejido conectivo de muchos invertebrados (^{Engel, 1997}; ^{Rinkevich et al., 2005}) y ^{García-Gasca et al. (1994)} confirmaron su presencia en el manto de la madreperla P. mazatlanica. Si bien la proteinasa K, proteasa y tripsina hicieron posible la liberación de poblaciones de células viables a todas las temperaturas durante las primeras etapas de la digestión, fueron agresivas en etapas posteriores y las dañaron parcial o totalmente, por lo que su rendimiento final fue pobre. Igualmente, la enzima proteolítica de T. herzianum demostró ser ineficiente para liberar células del manto y mantener su viabilidad, probablemente por no existir en este tejido un sustrato específico para la enzima. Se sugiere evaluar con más precisión la temporalidad de la acción benéfica y el posible efecto nocivo de estas enzimas para avanzar en la optimización de una técnica para cultivo in vitro de células y explantes de manto de P. mazatlanica.

La técnica de rojo de Alizarina fue poco sensible a la detección de calcio tisular, no obstante su abatimiento en un 55% a 0.6 M (que es la molaridad más alta y similar a la del agua de mar a 35 g/L), fue confirmada por espectrofotometría de absorción atómica. Este resultado sugiere una posible biodisponibilidad de CaCO₃ en el medio de cultivo para la proliferación de células y explantes, lo cual a su vez podría favorecer la síntesis de nácar como cimiento de la perla. Al respecto, algunos autores señalan que la síntesis de CaCO₃ y nácar por parte del manto durante la biomineralización y formación de una perla puede estar regulada por “moléculas relacionadas con la síntesis del péptido calcitonina” (CGRP)” y “proteínas de unión al calcio” en el abulón H. tuberculata (Linnaeus) (^{Auzoux-Bordenave et al., 2007}), así como por la proteína “nacarina” y el péptido “p10” en la ostra perlera P. fucata (^{Gong et al., 2008}; Zhang et al., 2010). Estudios dirigidos a la identificación de algunas de estas moléculas se están realizando en P. mazatlanica y P. sterna en este momento, como una estrategia para implementar gradualmente una tecnología que permita la formación segura in vitro del saco perlero, que es la primera capa basal de células de nácar secretada por el manto en 15-21 días para cubrir el núcleo esférico que se coloca durante la cirugía de injerto. El desarrollo de una tecnología de este tipo tiene aplicación directa en las actividades comerciales de producción de perlas, ya que el saco perlero formado in vitro podría colocarse en ostras receptoras para ayudar a reducir las altas tasas de rechazo post-injerto que se registran en todo el mundo.

En su conjunto, los resultados de este estudio cumplieron con el objetivo de definir las condiciones básicas para el cultivo primario de células del manto de P. mazatlanica; marcan también con claridad las futuras investigaciones por realizarse en torno a la reformulación de nuevos medios de cultivo, evaluación de factores de crecimiento y análisis del valor del cultivo celular 3D para maximizar la viabilidad y regeneración celular, así como la síntesis de CaCO₃ y cristales de aragonita y calcita. Finalmente, es recomendable cuantificar la expresión de enzimas y genes relacionados con todos estos procesos, lo que en un futuro cercano podría ayudar a definir una línea de cultivo celular de manto, con potencial aplicación en la producción in vitro del saco perlero (inicialmente) y de perlas (posteriormente).