Introducción

Los procesos de conservación en espermatozoides de peces han sido ampliamente estudiados, lo que ha permitido avances importantes en el manejo y control de gametos. No obstante, los protocolos de preservación que se reportan difieren en cuanto a la composición de los diluyentes o extensores, que son formulados para simular la composición y osmolaridad del plasma seminal, con el objetivo de no activar la movilidad. Esta variable es utilizada ampliamente para estimar la calidad espermática, ya que le permite al espermatozoide llegar y entrar al micrópilo para su fecundación (Fauvel et al., 2010; Hajirezaee et al., 2010). La función principal de estos extensores es mantener la viabilidad celular y la inmovilidad espermática el mayor tiempo posible, así como permitir la activación de las células cuando sea necesario para la optimización del semen en los procesos de conservación y fecundación (^{Medina-Robles et al., 2005}; ^{Valdebenito et al., 2009}). Los factores que activan el movimiento de los espermatozoides, como composición iónica, osmolaridad y pH han sido objeto de diversos estudios (^{Alavi & Cosson, 2005}; ^{Alavi & Cosson, 2006}; ^{Garzon et al., 2008}; ^{Takei et al., 2012}); éstos determinan que el movimiento se genera principalmente por el intercambio iónico de K⁺, Na⁺ y Ca²⁺ (^{Dziewulska & Domagala, 2013}; ^{Rosengrave et al., 2008}; ^{Tabares et al., 2005}; ^{Takei et al., 2012}; ^{Valdebenito et al., 2009}), y por la osmolaridad de la solución (^{Dzyuba et al., 2013}; ^{Hu et al., 2009}; ^{Morisawa et al., 1983}; ^{Tabares et al., 2005}), de manera que dejan en segundo término el efecto del pH.

Estudios más recientes demuestran que los espermatozoides de peces se activan en soluciones extensoras con pH desde 5.5 hasta 10.5 (^{Cosson 2004}; ^{Ciereszko et al., 2010}; ^{Dziewulska & Domagala, 2013}), y el valor óptimo para la fertilización es entre 8.5 y 10 (Le et al., 2010; Le et al., 2016; Magnotti et al., 2018). ^{Sanches et al. (2015)} observaron que el pH no sólo puede afectar la movilidad de los espermatozoides, sino también la tasa de fertilización, la tasa de eclosión y el desarrollo larval. ^{Woolsey e Ingermann (2003)} observaron que, los espermatozoides de salmónidos preincubados con valores de pH extracelular menores a 7.4 no tienen movimiento tras la activación con agua, mientras que los espermatozoides mantenidos por encima de pH 8.0 muestran actividad alta. Para la trucha arcoíris, ^{Cosson (2004)} menciona que un pH alcalino mejora la movilidad.

^{Aguilar-Juárez (2010)} evaluó el efecto del pH (5 a 10) en la activación de espermatozoides de la trucha de San Pedro Mártir, Oncorhynchus mykiss nelsoni (Everman, 1908), utilizando HCl o NaOH para pH ácido o alcalino, respectivamente, y amortiguó con Tris-HEPES como par ácido-base en los pH medios. Encontró que el pH óptimo para inactivar los espermatozoides fue de 7, ajustado con Tris-HEPES, ya que fue donde se presentó la mayor movilidad al ser reactivados con agua. Debido a que no ha quedado clara la influencia del pH sobre la activación espermática en peces, en el presente estudio se evaluó el efecto del pH de cinco soluciones extensoras sobre la movilidad espermática en semen de trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) y el efecto de la activación con tres soluciones activadoras.

Métodos

Recolección de muestras de semen. Las muestras fueron recolectadas en dos granjas acuícolas: Tatakany, ubicada en el municipio de Santa Ana Jilotzingo, y La Cañada, en el municipio de Huixquilucan, ambas en el Estado de México, México. Se revisaron machos de trucha arcoíris (n = 94) sexualmente maduros con peso promedio de 1806 ± 43.2 g y longitud 51.4 ± 5.5 cm para la granja Tatakany y de 1221.76 ± 328.18 g y 47.6 ± 5.9 cm para la granja La Cañada. Las muestras fueron obtenidas por masaje abdominal sin anestesia; antes de recolectar la muestra se retiró la orina por masaje abdominal y el exceso de agua del poro genital para evitar la contaminación y activación. Las muestras se colocaron en recipientes de plástico con tapa, se transportaron al laboratorio en hieleras con temperatura de 4 ^oC y fueron almacenadas en refrigeración a 5 ^oC por 24 h hasta su revisión. Para el estudio se utilizaron 43 muestras que cumplieron con los criterios de inclusión: presentar movilidad y viabilidad superior al 90%, y tiempo superior a los 30 segundos.

Evaluación del semen. Para evaluar la movilidad de espermatozoides en semen fresco se colocaron 10 µL de solución activadora (Tabla 1) sobre un portaobjetos, seguido de 1.0 µL de concentrado de semen (3.02 x10⁹ ± 2.94 x10⁹ cels/mL) y se observó al microscopio a 100 y 400 aumentos. La viabilidad fue determinada por medio de un frotis con tinción de eosina-nigrosina, de acuerdo con lo que refieren ^{Peralta-Martínez et al. (2018)}.

Concentración espermática. La concentración de esperma se cuantificó utilizando una cámara Neubauer con doble conteo a una dilución de (1:1000 μL) semen y diluyente, respectivamente, para cada una de las muestras (^{Aguilar-Juárez, 2010}). El número total de células presentes en un mL se calculó de acuerdo con ^{Peralta-Martínez et al. (2018)}.

Volumen de muestra. Para el seguimiento del efecto de pH, se realizó un pool para obtener un volumen de 6 mL de semen por tratamiento (pH) y solución extensora.

Capacidad amortiguadora en soluciones extensoras. Para asegurar que no se presentaran variaciones de pH durante del estudio y previo a la incubación del semen, se evaluó la capacidad amortiguadora de las cinco soluciones extensoras (Tabla 1) por un periodo de ocho días en soluciones esterilizadas y no estériles, y se monitoreó el pH diariamente del primero al octavo día de almacenamiento. Durante este periodo todos los extensores se guardaron en refrigeración a 5 ^oC y replicados dos veces.

Soluciones extensoras y de activación. Se prepararon 100 mL de cada solución extensora (Tabla 1): tres de composición sencilla (306, 512 y ^{Mounib 1978}) y dos de composición compleja (^{Erdahl & Graham 1980}, y Hanks 1975), se ajustaron a pH de 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 y 8.2 con NaOH o HCl, y sólo para la solución de Hanks se ajustó con NaHCO₃ de acuerdo con lo expuesto por Hanks (1975), estos intervalos se basaron en lo reportado como óptimo para la inactivación del esperma por varios autores (^{Alavi & Cosson, 2005}; ^{Ingermann et al., 2008}; ^{Ciereszko et al., 2010}; ^{Nynca et al., 2012}; ^{Dziewulska & Domagala, 2013}; ^{Ogretmen et al., 2014}; ^{Inan & Ogretmen, 2015}). Para la activación de espermatozoides después de ser diluidos en las cinco soluciones extensoras y a pH diferente, se prepararon 200 mL de solución DIA 532 y 200 mL de suero salino fisiológico (SSF) y se recolectaron 500 mL agua de estanque (Tabla 2).

Efecto del pH de soluciones extensoras en esperma. Para evaluar el efecto del pH de la solución extensora sobre la movilidad, se tomaron 10 µL de semen concentrado y se mezclaron con 30 µL de solución extensora; posteriormente se colocaron 10 µL de esta dilución sobre un portaobjetos y se le agregaron 20 µL de solución activadora. Se observó la movilidad en objetivo de 10 aumentos y objetivo ocular de 10 aumentos para un total de magnificación de 100 aumentos. Todas las muestras y experimentos se manejaron en un cuarto frío a temperatura de 14 ^oC.

Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (^{Ciereszko et al., 2015}) con las variables independientes extensor con pH diferente (Tabla 2) y soluciones activadoras (Tabla 1). Antes de realizar el análisis, los datos fueron transformados a la raíz cuadrada de arcoseno (Babiak et al., 2001; ^{Aguilar-Juárez, 2010}). Para establecer las diferencias estadísticas entre los diferentes pH, se realizó una prueba de Tukey con α = 0.05 (Aguilar-Juárez 2006). Además se realizó un análisis de correlación lineal entre el pH y el porcentaje de movilidad para establecer si hay dependencia.

Resultados

Evaluación del semen. La evaluación de la calidad espermática en los 94 machos de trucha presentó una movilidad promedio del 78.93 ± 26.28%, un tiempo promedio de movilidad del 36.36 ± 5.71 segundos, viabilidad del 79.23 ± 13.31%, concentración de 3.02 x 10⁹ ± 2.94 x 10⁹ cel/mL con volumen promedio del 4.19 ± 3.8 mL.

Capacidad amortiguadora en soluciones extensoras. No se encontraron diferencias significativas (p ˂0.05) entre las variaciones de pH en la evaluación de la capacidad amortiguadora de las cinco soluciones extensoras (Fig. 1a). No obstante, cuando las soluciones de composición compleja (Erdahl & Graham y Hanks) no son esterilizadas, presentan una disminución significativa de pH (7.99 a 3.98, y 7.66 a 5.82 respectivamente) desde el día 1 y hasta el día 8 (p ˂0.05) (Fig. 1b).

Figuras 1a-b Capacidad amortiguadora en las cinco soluciones extensoras esterilizadas (a) y no esterilizadas (b), almacenadas a 5 ^oC por un periodo de ocho días. 

Soluciones de activación. Las soluciones de activación (DIA 532, SSF y agua de estanque) activaron al 100% la movilidad en espermatozoides frescos. No obstante, al diluir el semen en las soluciones extensoras, la solución DIA 532 alcanzó un máximo de 52.6% de movilidad, mientras que el agua de estanque presentó el menor porcentaje de activación con un máximo de 10% (Figs. 2a-c).

Figuras 2a-c Movilidad de espermatozoides de Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) en extensor 306 (a), 512 (b) y Hanks (c), con pH variables y activación de movilidad con tres soluciones activadoras, DIA 532, SSF y agua de estanque. Superíndices diferentes indican diferencias significativas (p <0.05). 

Efecto en el esperma del pH de soluciones extensoras. En la evaluación del efecto del pH de la solución 306 sobre el movimiento de células espermáticas, se observó movilidad con todos los pH. La activación comenzó con un mínimo de 33% de movilidad a pH 7 e incrementó al 96% a pH 8.2. Se encontraron diferencias significativas entre los diferentes pH (p ˂0.05) y una correlación positiva entre el pH y el porcentaje de movilidad (R² = 0.85) (Fig. 3). La solución que presentó los mejores porcentajes de activación fue DIA 532, con el 48% a pH 7.2 (Fig. 2a).

Figuras 3a-b Movilidad de espermatozoides de Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) en extensor Erdahl & Graham (a) y Mounib (b), con pH variables y activación de movilidad con tres soluciones activadoras, DIA 532, SSF y agua de estanque. Superíndices diferentes indican diferencias significativas (p ˂0.05). 

En la solución 512 no se observó movimiento de espermatozoides a pH 7 y 7.2. A partir de pH 7.4, y hasta pH 8.2, los espermatozoides presentaron movilidad al diluirse en la solución 512 con diferencias estadísticas significativas (p ˂0.05) (Fig. 4). Se encontró una correlación positiva entre el pH y el porcentaje de movilidad (R² = 0.93). La solución DIA 532 activó el mayor porcentaje de células, con valores de 54, 53 y 51% con pH 7, 7.2 y 7.4, respectivamente, con diferencias estadísticas significativas (p ˂0.05) (Fig. 2b).

La solución de Hanks activó el movimiento de espermatozoides en todos los pH, con porcentajes que van desde el 42 hasta el 70% con pH de 7 y 7.8, respectivamente, pero no se encontraron diferencias estadísticas (p ˂0.05). Se encontró una correlación positiva media entre el pH y el porcentaje de movilidad (R² = 0.64). La solución de activación DIA 532 es la que presentó los mayores porcentajes de activación: 44, 51 y 51.5% con pH 7, 7.2 y 7.4, respectivamente, (Fig. 2c).

La solución de Erdahl y Graham no permitió el movimiento de los espermatozoides con ningún pH y el SSF fue el medio que mejor activó la movilidad espermática, con el 47% con pH 8 (Fig. 3a).

La solución de Mounib no activó la movilidad con ningún pH y el mayor porcentaje de activación se obtuvo con el SSF 18% (Fig. 3b).

Discusión

La capacidad amortiguadora de las soluciones extensoras no presentó diferencias significativas durante los ocho días de observación; no obstante, si las soluciones extensoras de Erdahl & Graham y Hanks no se esterilizan previo a su uso, pueden acidificarse debido a la proliferación de bacterias que son enriquecidas por la glucosa, y esa acidificación no permitirá la activación espermática, además de que causará daños en la célula. La forma disociada y altamente polar de los ácidos hace que atraviesen fácilmente la membrana plasmática de las células animales; una vez dentro de la célula, el ácido se disocia combinando el pH intracelular e interviene en el transporte de aminoácidos, así como en la carga eléctrica de la célula, lo que produce un aumento en los niveles de sodio y potasio. Este proceso aumenta la presión osmótica, eventualmente la membrana se rompe y la célula estalla (^{Alberts & Bray, 2006}; ^{Jiménez & Merchant, 2003}).

^{Liu et al. (2016)} reportan que la acidificación de la solución extensora disminuye gradualmente la movilidad y el pH durante el almacenamiento a largo plazo en semen de cabra (Capra aegagrus s.e. hircus Linnaeus, 1758) ^{Chantzaropoulos et al. (2015)}, señalan que la exposición de los espermatozoides a condiciones ácidas antes de su almacenamiento afecta la viabilidad y la movilidad durante la refrigeración. El uso de glucosa en extensores es común en técnicas de criopreservación como un protector externo que nutre la membrana celular; sin embargo, en procesos de conservación a corto y mediano plazo, se debe tener precaución al utilizarlo, ya que, como lo mencionan Jian-Hua et al. (2016), hay poca información sobre el impacto de los sustratos energéticos en los espermatozoides durante el almacenamiento del semen. De las tres soluciones activadoras que se probaron, DIA 532 es la que presentó un mayor porcentaje de activación (50%). Esto se debe principalmente a su pH alcalino, que modifica la capacidad amortiguadora del semen. De acuerdo con ^{Ingermann et al. (2002)}, el semen de salmónidos posee una capacidad amortiguadora baja a pH altos y una capacidad amortiguadora alta a pH bajos. En este caso, al diluir el semen en el extensor, se vio afectado su pH externo, y por consecuencia, su capacidad amortiguadora, por lo que fue más sensible al pH 9 de la solución DIA 532 y menos sensible a los pH del SSF (6) y del agua de estanque (7.6). Por otro lado, la correlación negativa que se observó en la activación de la movilidad con DIA 532 estuvo asociada al efecto de activación inducida por la solución extensora; es decir, las células que fueron activadas por la solución extensora no pudieron activarse nuevamente con la solución DIA 532. Cuando los mecanismos de señalización intracelular en la fosforilación del brazo externo de la dineína ATPasa se activan, no es posible volverlos a activar, ya que los elementos involucrados se utilizaron en esta acción (^{Gregorio & Pardo, 2010}).

La correlación positiva encontrada entre el porcentaje de movimiento de células espermáticas y el pH de las soluciones 306, 512 y Hanks, mostró un efecto del pH en la activación de la movilidad. Woolsey e Ingerman (2004), mencionan que la dependencia entre movilidad y pH está relacionada con la sensibilidad de la dineína ATPasa al pH, ya que la actividad de esta enzima fue 3.5 veces mayor a pH 7.6 en comparación con pH 7. Esta correlación positiva entre la motilidad de los espermatozoides y el valor de pH del semen durante el almacenamiento también fue reportada por ^{Liu et al. (2016)}.

Con la solución de Erdahl y Graham no se observó el efecto del pH, mientras que la mayor activación de la movilidad se obtuvo con el SSF (47%). De acuerdo con ^{Aguilar-Juárez (2010)}, esta solución fue la más adecuada para la inactivación de espermatozoides de trucha Oncorhynchus mykiss nelsoni en procesos de preservación a mediano plazo, y el mayor porcentaje de movilidad espermática lo obtuvo con DIA 532 (80%). De igual forma, en este estudio dicha solución mantuvo inactivos los espermatozoides, pero el porcentaje de activación estuvo por debajo de lo encontrado por ^{Aguilar-Juárez (2010)}. En este trabajo, el porcentaje de activación bajo pudo deberse a la esterilización de la solución, en donde el ácido cítrico, al igual que otros ácidos carboxílicos, cuando se calienta a más de 175 °C, se descompone y produce CO₂ y H₂O, lo que elimina su acción sobre la fijación de calcio en la membrana de los espermatozoides que, junto con los iones de Na⁺ y K⁺, mantienen el equilibrio osmótico al favorecer la movilidad de los espermatozoides (^{Cabrera et al., 2011}).

Por otro lado, la solución de Mounib ha sido utilizada por varios autores para la criopreservación espermática en peces (^{Agarwal, 2011}; ^{Legendre & Billard, 1980}; ^{Pullin, 1972}). En este estudio esta solución no activó la movilidad a ningún pH y la activación con SSF alcanzó sólo un 19%, lo cual puede atribuirse a la alta concentración de bicarbonato de potasio (KHCO₃) que contiene la solución (100 mM KHCO₃). ^{Dziewulska & Domagala (2013)} mencionan que a concentraciones de 8 mM de KCl hay nula movilidad; adicionalmente, encontraron una correlación negativa entre concentraciones del ion K⁺ y la movilidad. Por otro lado, aun cuando esta solución presenta una osmolaridad baja (200 mOsmol/kg), necesaria para la activación de esperma, esto no fue suficiente para permitir la movilidad de las células. De acuerdo con ^{Bondarenko (2014)}, la concentración de algunos iones, así como el pH, son críticos en cualquier condición osmótica, por lo tanto, es importante realizar más estudios que correlacionen la concentración iónica de los principales cationes que componen el fluido seminal con el pH de la solución.

Por lo anterior, la elaboración y uso de soluciones extensoras en almacenamiento de esperma a corto, mediano o largo plazo deben presentar un equilibrio de concentración de iones y pH. En las células animales el pH interno se encuentra en un rango de 6.8 a 7.2; cuando el semen se diluye en una solución dentro de este rango, no hay hiperpolarización de la membrana celular, debido a que hay un equilibrio en la concentración de iones H⁺. Si el semen se diluye en soluciones ligeramente por encima o por debajo del pH interno, la capacidad amortiguadora de la célula aporta o libera iones H⁺ para reducir o aumentar el pH hasta llegar al equilibrio. Cuando esta capacidad amortiguadora es rebasada por el incremento o disminución de los iones H⁺, pueden ocurrir dos cosas: una concentración alta de iones H⁺ no permite la entrada de Na⁺, Ca²⁺ o Mg⁺², por lo tanto, no hay un intercambio iónico y consecuentemente no se da la hiperpolarización de la membrana. Una baja concentración de iones H⁺ acelera la liberación de éstos desde el interior de la célula y, por consecuencia, la introducción de Na⁺, Ca²⁺ o Mg⁺², con lo que ocurre el intercambio iónico que genera la hiperpolarización de la membrana y consecuentemente la creación de energía para la activación de los mecanismos que generan la movilidad del espermatozoide (^{Jiménez & Merchant, 2003}; ^{Lodish et al., 2006}; ^{Alberts et al., 2006}; ^{López & Segura, 2008}).

Adicionalmente, es importante considerar las características individuales de cada especie, ya que la composición del fluido seminal puede diferir en la concentración de sus componentes (^{Dziewulska et al., 2008}), de manera que el efecto de la solución extensora o de almacenamiento puede tener resultados variables.

De los resultados obtenidos en este trabajo se puede concluir que con las soluciones 306, 512 y Hanks hay una relación positiva entre el pH y el porcentaje de movilidad en los espermatozoides de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), ya que al incrementarse el pH se incrementó la movilidad. En el caso de las soluciones de activación, se encontró una correlación negativa en la activación con DIA 532 con respecto al pH de la solución de almacenamiento. En las soluciones 306, 512 y Hanks, a menor pH, mayor porcentaje de activación.