Introducción

Las algas marinas se han convertido en centro de atención debido a que son una fuente de compuestos naturales con efectos benéficos para la salud humana (^{Marfaing & Lerat, 2007}). En varios países asiáticos, las algas son usadas como medicina alternativa para el control de la diabetes mellitus y en la prevención de complicaciones vasculares, padecimientos con los mayores índices de prevalencia y mortalidad a nivel mundial, incluido México (^{Aguilar-Salinas et al., 2001}; ^{ADA, 2006}; ^{Bakri, 2007}; ^{Hu et al., 2004}; ^{King et al., 1998}; ^{Lerman & Rull-Rodrigo, 2001}). Por ejemplo el rizoide del alga marina Laminaria japonica Areschoug, conocida de forma coloquial como Kelp japonés, se usa de manera tradicional en el tratamiento de la diabetes mellitus. En los últimos años también se ha demostrado que esta alga posee varias actividades biológicas: es hipotensora (^{Chiu & Fung, 1997}), antimutagénica (^{Okai & Nakamura, 1993}) y antioxidante (^{Lee et al., 1999}). Otras investigaciones, además han reportado que las algas pueden influir en el control de la glucemia, ser eficaces en la reducción de lípidos sanguíneos y mejorar la actividad de enzimas antioxidantes (^{Ara et al., 2002}; ^{Lamela et al., 1989}; ^{Kim et al., 2009}; ^{Kiriyama et al., 1968}; ^{Nishide & Uchida, 2003}).

Desde el punto de vista químico de los productos naturales, se sabe que las algas marinas contienen metabolitos secundarios de diversa índole, principalmente ácidos grasos poliinsaturados, polisacáridos (agar, carragenanos, ácido algínico y fucanos) y esteroles (fucosterol, desmosterol, sargasterol, estigmasterol y beta sitosterol), los cuales se han asociado con diversas actividades biológicas (antibacteriana, antimicótica, antioxidante, anticoagulante y antineoplásica, entre otras) (^{Rodríguez et al., 1995}; ^{Nishide & Uchida, 2003}; ^{Yuan et al., 2005}).

Algunas algas comestibles también pueden contener cantidades apreciables de polifenoles, los cuales se caracterizan por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (^{Rodríguez-Bernaldo de Quiroz et al., 2010}), incluso son capaces de inhibir diferentes tipos de enzimas glicolíticas, como la α-amilasa y la α-glucosidasa (^{Nwosu et al., 2011}; ^{Kim et al., 2009}), con lo que de esta manera se previene el desarrollo de las complicaciones diabéticas (^{Lee et al., 2010}, 2008; ^{Zhang et al., 2007}; ^{Iwai, 2008}; ^{Apostolidis & Lee, 2010}).

Las algas marinas son un recurso abundante en los mares mexicanos: sin embargo, hasta ahora no se ha prestado suficiente atención a su papel como fuente potencial para el desarrollo de fármacos y, aunque en México se han evaluado farmacológicamente algunas especies de macroalgas marinas (^{De Lara-Isassi,1986}, ¹⁹⁹¹, ¹⁹⁹⁵; ^{De Lara-Isassi & Lozano 1992}; ^{De Lara-Isassi & Álvarez-Hernández, 1994}, ¹⁹⁹⁵, ¹⁹⁹⁸; ^{De Lara-Isassi et al., 1989}, ¹⁹⁹³, ¹⁹⁹⁶, ¹⁹⁹⁹), aún no se han llevado a cabo estudios relacionados con la diabetes mellitus.

El objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto hipoglucémico e hipolipidémico de los extractos de Caulerpa sertularioides (Gmelin) M. A. Howe (Chlorophyta) UAMIZ 444 y Spyridia filamentosa (Wulfen) Harvey (Rhodophyta) UAMIZ s/n, con base en un estudio subcrónico en un modelo murino de diabetes experimental.

Materiales y métodos

Material biológico y obtención de extractos. La recolección del material ficológico se realizó en el estado de Campeche en las localidades de Isla Blanquilla y del Ranchito, en época de secas. Se hizo de forma manual. Las muestras se lavaron con agua de mar y posteriormente se colocaron en bolsas Ziploc con poca agua y sin sedimentos, asignándoles el número de colecta correspondiente a la estación donde fueron recolectadas, se preservaron dentro de una hielera a 4°C. En el laboratorio todas las muestras colectadas se conservaron a una temperatura de -20°C hasta el día de su procesamiento.

Cuando se procesaron, se descongelaron de forma paulatina, a temperatura ambiente, dentro de cristalizadores con un volumen de 1 L. Ya descongeladas se lavaron con agua del grifo para desechar en su totalidad los sedimentos acumulados en los talos; con ayuda de unas pinzas de disección, se revisó talo por talo y se removieron toda clase de impurezas y organismos epífitos. Terminando este proceso, se extendió cada muestra sobre láminas de unicel forradas de plástico; con ayuda de toallas absorbentes se eliminó el exceso de humedad para después secarlas en una campana de extracción protegida de la luz y del polvo, con aireación constante y a temperatura ambiente durante una semana, de acuerdo con la metodología convencional previamente reportada para el secado de plantas medicinales (^{Díaz-Flores et al., 2002}; ^{Román-Ramos et al., 2012}; ^{Bonilla et al., 2015}). Las algas se molieron en un molino comercial para café de acero inoxidable; el material así obtenido se pesó y guardó en sobres de papel aluminio, dentro de bolsas de plástico (marca Ziploc), etiquetadas con el número de muestra, localidad y peso final. Estas se pusieron dentro de bolsas de papel para resguardarlas de la luz, la humedad y el calor. Posteriormente se pesaron 40 g del material molido de cada especie y se colocaron dentro de un matraz con 500 ml con agua destilada; se agitó la solución durante 15 minutos y se colocó durante 10 minutos a 80°C. El extracto se incubó a 4 °C durante 24 h en un matraz cubierto con papel aluminio para evitar la oxidación. Después del periodo de incubación las muestras se filtraron. Cada uno de los extractos se colocó en un refractario de cristal, cubierto de plástico auto-adherible con perforaciones en su superficie, dentro de la campana de extracción, para facilitar la evaporación. Al término de este proceso cada muestra se recuperó con la ayuda de una espátula de metal. El polvo resultante se pesó y se guardó dentro de frascos de plástico color ámbar, previamente etiquetados, conservándolos a una temperatura de 4°C. Los rendimientos de los extracto de C. sertularioides y de S. filamentosa fueron de 13.8% y 12.5%, respectivamente.

Estudio subcrónico en animales de experimentación. El manejo zoosanitario, cuidado y estudio se realizó bajo la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) “Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio”; y se respetó en todo momento la bioética para la realización de esta serie de experimentos. El bioensayo se realizó de acuerdo con la metodología modificada de Díaz-Flores et al. (2012). Ratones machos (Mus musculus Linnaeus, 1758), cepa CD-1 de 8 semanas de nacidos, con peso de 30 a 40 g, recibieron por vía intraperitoneal estreptozotocina (175 mg/kg). Después de una semana, con estos animales se formaron cuatro grupos de ocho individuos cada uno. Los grupos 1 y 2 se usaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Al grupo 1 se le suministró solución salina isotónica (0.9% a razón de 4 ml/kg/día); al grupo 2 glibenclamida (5 mg/kg/día); al grupo 3, el extracto de Caulerpa sertularioides (50 mg/kg/día) y al grupo 4, el extracto de Spyridia filamentosa (50 mg/kg/día). Todos los tratamientos fueron administrados diariamente por vía intragástrica durante 30 días, a la misma hora. Posteriormente se elaboró un perfil bioquímico, para determinar niveles de glucosa, colesterol, triglicéridos y las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST o GOT) y alanina aminotransferasa (ALT o GPT), éstas últimas con la finalidad de detectar algún grado de toxicidad.

La cuantificación de glucosa se basó en la medición de corriente eléctrica (Amperes), generada por la conversión de glucosa en gluconolactona por la enzima glucosa deshidrogenasa (Accu-Check Sensor Comfort). Por su parte, los niveles de colesterol total, triglicérido, GOT y GPT, de las muestras sanguíneas obtenidas por punción del seno orbital del ojo del ratón, se cuantificaron mediante el sistema Reflotron Plus (Roche Diagnostics).

Análisis estadístico. Los resultados se reportan como media ± el error estándar de la media (n=8). Para evaluar la significancia estadística de los datos se realizó un análisis de varianza, con una prueba post hoc de Tukey-Kramer con un nivel mínimo de significancia del 95% y se usó el paquete estadístico IBM-SPSS/22.

Resultados

Los resultados obtenidos con respecto a la glucemia muestran que los extractos de ambas especies algales causan reducciones significativas (p <0.05) tanto en relación a su glucemia inicial como con respecto a los controles (positivo y negativo) después de 30 días de tratamiento, mostrando actividad hipoglucemiante evidente (Fig. 1).

Figura 1: Niveles de Glucosa en ratones diabéticos al inicio (0) y a un mes de tratamiento (30 días) con extractos de Caulerpa sertularioides y Spiridia filamentosa (50 mg/kg/día). #=diferencia significativa respecto a SSI. *=diferencia significativa respecto al tratamiento con C. sertularioides. &=diferencia significativa respecto al tratamiento con S. filamentosa. Control positivo=SSI solución salina isotónica (0.9%). Control negativo=Gb gliblenclamida (5 mg/Kg). Cs=C. sertularioides. Sf=S. filamentosa. 

Las Figuras 2 y 3 muestran el efecto de los extractos algales sobre los nivles de colesterol y triglicéridos, respectivamente. Se observaron aumentos significativos (p < 0.05) tanto en los niveles de colesterol durante el tratamiento con Spirydia filamentosa, y en los niveles de los triglicéridos con el extracto de Caulerpa sertularioides, en ambos casos con respecto al control positivo que recibió solución salina isotónica (SSI).

Figura 2: Niveles de colesterol alcanzados con los extractos de Caulerpa sertularioides (50 mg/kg/día) y Spiridia filamentosa (50 mg/kg/día) en ratones diabéticos. Control positivo=SSI solución salina isotónica (0.9%). Control negativo=Gb gliblenclamida (5 mg/Kg). Cs=C. sertularioides. Sf=S. filamentosa. 

Figura 3: Niveles de triglicéridos con extractos de Caulerpa sertularioides (50 mg/kg/día) y Spiridia filamentosa (50 mg/Kg) en ratones diabéticos. Control positivo=SSI solución salina isotónica (0.9%). Control negativo=Gb gliblenclamida (5 mg/kg/día). Cs=C. sertularioides. Sf=S. filamentosa. 

En relación con las enzimas transaminasas (aspartato aminotransferasa o GOT y alanina aminotransferasa o GPT), éstas no fueron estadísticamente modificadas por los tratamientos, con respecto al control positivo (Figs. 4-5, respectivamente).

Figura 4: Niveles de GOT con extractos de Caulerpa sertularioides (50 mg/kg/día) y Spiridia filamentosa (50 mg/kg) en ratones diabéticos. Control positivo=SSI solu ción salina isotónica (0.9%). Control negativo=Gb gliblenclamida (5 mg/kg/día). Cs=C. sertularioides. Sf=S. filamentosa. 

Figura 5: Niveles de GPT con extractos de Caulerpa sertularioides (50 mg/kg/día) y Spiridia filamentosa (50 mg/kg/día) en ratones diabéticos. Control positivo=SSI solución salina isotónica (0.9%). Control negativo=Gb gliblenclamida (5 mg/Kg) , Cs=C. sertularioides. Sf=S. filamentosa. 

Discusión

Desde el siglo pasado las macroalgas marinas se reconocieron como una de las fuentes más ricas en compuestos bioactivos, gracias a una considerable serie de análisis e investigaciones en donde fueron descubiertas las múltiples actividades biológicas de sus compuestos (^{Blunt et al., 2006}).

Los resultados obtenidos en esta investigación muestran cierta similitud con estudios previos realizados por diferentes grupos de trabajo en relación con el potencial farmacológico de estos recursos, ya que fue posible detectar el efecto hipoglucémico significante con ambas especies algales, efecto que resultó ser mayor que el producido por la glibenclamida, hipoglucemiante oral tipo sulfonilurea más empleado en la clínica para el tratamiento de la diabetes mellitus.

Como se mencionó, la información disponible reporta que las macroalgas marinas pueden contener compuestos polifenólicos con actividad inhibitoria de glucosidasas, enzimas encargadas de metabolizar carbohidratos a nivel intestinal (^{Kurihara et al., 1999}). La inhibición de estas enzimas reduce la absorción de carbohidratos, decreciendo el incremento postprandial de glucosa en sangre (^{Rajeswari et al., 1991}), con beneficios importantes para los pacientes con diabetes.

Por otro lado, también se ha reportado que los polifenoles de macroalgas marinas podrían estimular la captación de glucosa a nivel periférico (^{Iwai, 2008}; ^{Zhang et al., 2007}). Aunque el contenido de polifenoles totales no fue determinado en esta investigación, estudios preliminares aún no publicados de un grupo de investigación cercano, lograron determinar con el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu, que Caulerpa sertularioides y Spyridia filamentosa contienen 38 y 71 µg de polifenoles totales/ml de extracto, respectivamente. Sin embargo, con los datos obtenidos hasta ahora aún no es posible afirmar que la actividad hipoglucemiante producida por las dos especies algales usadas en la presente investigación se deba a su contenido de este tipo de compuestos. ^{Burritt et al. (2002)} sugieren que la ausencia de daño oxidativo en los componentes estructurales de las macroalgas marinas y su estabilidad frente a condiciones adversas, como el entorno marino, se pueden deber a la presencia de polifenoles presentes en dichas algas.

Cabe señalar que en los trabajos consultados no se encontraron resultados semejantes a los obtenidos en esta investigación respecto a las dos especies estudiadas, ya que las algas que más se han investigado para conocer su efecto hipoglucémico son las Phaeophyceae, por la gran cantidad de polifenoles que contienen (^{Iwai, 2008}, ^{Lee et al., 2008}, ²⁰¹⁰; ^{Kim et al., 2014}).

En los análisis de los niveles de lípidos en sangre se encontró un aumento del colesterol durante el tratamiento con S. filamentosa y un aumento de triglicéridos en el tratamiento con C. sertularioides. Aunque estos resultados son contradictorios a los reportados con Caulerpa lentillifera J.Agardh y C. racemosa (Forsskål) J. Agardh especies que reducen los niveles de colesterol, triglicéridos y lipoproteínas de baja densidad en un modelo murino de hiperlipidemia (^{Matanjun et al., 2010}), es probable que estas diferencias en el efecto sobre los lípidos sanguíneos sean debido a que se usaron modelos diferentes; en esta investigación se trabajó con un modelo murino con diabetes experimental, el cual no desarrolló hipercolesterolemia ni hipertrigliceridemia. Esto es importante porque en muchas ocasiones es necesario que en los modelos experimentales esté bien establecida la patología para que las sustancias activas potenciales puedan ejercer su acción y puedan ser observables sus efectos farmacológicos.

Los extractos de C. sertularioides y S. filamentosa no mostraron ser tóxicos al evaluar los niveles de ambas transaminasas durante el periodo que duró el bioensayo, ya que no fueron modificadas significativamente. Lo anterior, tomando en cuenta que un incremento en los niveles de GOT y GPT es indicativo de hepatotoxicidad (^{McAnuff et al., 2003}). Cabe recordar que, de acuerdo con ^{Danneman et al. (2012)}, el intervalo normal de aspartato aminotransferasa es 69-191 UI/l, mientras el de alanina aminotransferasa es 26-120 UI/l en el modelo murino. Los valores encontrados con los tratamientos algales en estos parámetros cayeron dentro de estos rangos, sin detectarse signos de toxicidad. Además, aunque no fue posible observar de manera macroscópica aparatos y sistemas en los grupos experimentales durante el estudio, tampoco se observaron cambios conductuales ni algún otro síntoma que pudiera ser indicativo de intoxicación por la administración de los tratamientos, siempre se comportaron dentro de los parámetros normales. De cualquier manera, un análisis histológico para confirmar estas observaciones, es obligatorio en futuros estudios con estos extractos.

Los tratamientos con las macroalgas evidenciaron niveles bajos de GPT, quizá debido a la presencia de estructuras fenólicas con efectos hepatoprotectores, una actividad biológica reportada en modelos experimentales tras la administración oral de extractos de macroalgas de la División Heterokontophyta (Sargassum polycystum C. Agardh, S. henslowianum C. Agardh y S. siliquastrum (Mertens ex Turner) C. Agardh). Por lo tanto, existe la posibilidad de que los extractos acuosos de las especies usadas en este estudio tengan un efecto hepatoprotector similar al reportado para otras especies (^{Wong et al., 2004}).

La actividad hipoglucemiante y la nula toxicidad observadas con estas especies les confiere un uso potencial como fuente de fármacos para el control de la diabetes mellitus, aunque antes deben de ser sometidas a estudios químicos y farmacológicos más específicos, con la finalidad de identificar las moléculas responsables de los efectos benéficos encontrados en esta investigación y elucidar sus mecanismos de acción.