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Introducción
El propóleo es un material resinoso que elaboran las abejas Apis mellifera a partir de resinas de distintas especies botánicas y que son modificadas con sus secreciones salivales para transportarlas al interior de la colmena con el fin de utilizarlo como material de construcción, bloqueo de agujeros y grietas, como defensa química contra los microorganismos y como embalsamador de intrusos que han muerto en la colmena y que son demasiado grandes para ser eliminados por ellas (Bankova, 2005; Bankova et al., 2016; Silva-Carvalho, Baltazar & Almeida-Aguiar, 2015)).
La actividad biológica de los propóleos se debe a su composición química, la cual depende de la vegetación de donde las abejas recolectan la resina, la ubicación geográfica del apiario, el clima y la época de recolección. Diferentes estudios demuestran que contienen en promedio 55% de resinas y bálsamos, de 30% a 40% de cera de abeja, de 5% a 10% de aceites esenciales o volátiles, 5% de polen y de otros materiales orgánicos y minerales (Peña, 2008; Sforcin & Bankova, 2011).
Los propóleos colectados en Europa, Norte de América y Norte de Asia tienen su origen en los álamos y abedules, encontrando flavonoides como pinocembrina, pinobanksina, crisina, galangina, acacetina y apigenina como su principal componente. En Inglaterra, Irlanda y China se muestra una composición muy similar a la observada en el continente europeo, con la diferencia de la presencia del éster fenetílico del ácido caféico (CAPE, por sus siglas en inglés), flavonoides (3-O-[(S)-2-metilbutiroil]) pinobanksina y 6-cinamilcrisina (Bankova, de Castro & Marcucci, 2000). Las zonas tropicales, como Brasil, Venezuela, Uruguay, México y Cuba, se caracterizan por poseer una alta biodiversidad botánica, pero no presentan álamos y abedules, ya que estos árboles no son especies nativas de estos países y, por tanto, las abejas tienen que buscar otras fuentes de exudados y resinas para la elaboración de propóleos.
La fracción resinosa del propóleo está integrada por compuestos fenólicos y flavonoides que son muy importantes a nivel terapéutico (Sosa-López, Cabrera & Álvarez, 2016) y que presentan un efecto sinérgico que es esencial para las actividades biológicas benéficas tanto en humanos como en animales: antibacteriana, antifúngica, antiviral, antioxidante, inmunomoduladora, entre otras (Fischer et al., 2007; Graça, Nunes, Dandle, Cavaco & Antunes, 2014; Soto-Vásquez, 2015).
Los flavonoides son compuestos conformados por dos anillos fenilo, A y B, unidos a través de un anillo C de pirano con grupos funcionales adicionales, lo que genera diferentes tipos de flavonoides, como las chalconas, flavanonas, flavonas, flavonoles, proantocianidinas, antocianidinas, flavandioles, isoflavonas y auronas, compuestos que le dan las características antioxidantes, antimicrobianas, cicatrizantes, antiinflamatorias (Cheng, Han, Wu & Lou, 2014; Falcone, Ruis & Casati,2012; Limón et al., 2010; Panché, Diwan & Chandra, 2016), antiparasitarias, citotóxicas (Peñarrieta, Tejeda, Mollinedo, Vila & Bravo, 2014) o insecticidas (Morgado et al., 2014).
Por otro lado, se estima que existen más de 300 compuestos químicos que se han detectado en los propóleos de diversos orígenes de la República Mexicana y que el contenido de fenoles y flavonoides es un parámetro importante que determina la calidad de su actividad biológica; por ello, las normas de calidad nacionales e internacionales establecen valores mínimos de aceptación, cuanto mayor sea el porcentaje de estos compuestos, mejor será la calidad del producto (Hernández-Zarate et al., 2017; Lotti et al., 2010).
La evaluación de la actividad antioxidante de los propóleos es importante (Silva-Carvalho, Baltazar & Almeida-Aguiar, 2015) por ser de origen natural para la prevención y tratamiento de diversas enfermedades de origen oxidativo (Farré, Frasquet & Sánchez, 2004) como ateroesclerosis (Fang et al., 2013), cáncer (Hernández et al., 2007), diabetes mellitus (Rivera-Yáñez et al., 2017), hipertensión arterial y daño renal (Teles et al., 2015), enfermedades hepáticas (Elejalde, 2001), por su capacidad de inhibir radicales libres y por quelación de iones metálicos (Geckil, Ates, Durmaz, Erdogan & Yilmaz, 2005).
Zavaleta, Muñoz, Blanco, Alvarado-Ortiz & Loja (2005) reportan que la actividad antioxidante no siempre está en relación con la concentración de polifenoles, sino a la posición del(los) grupo(s) hidroxilo en los anillos A y B y las características estructurales son relevantes (Limón et al., 2010; Quiñones, Miguel & Aleixandre, 2012; Vargas-Sánchez et al., 2014 b) y, en menor medida, por los ácidos grasos insaturados provenientes de la abeja. Estudios realizados por Quiñones et al. (2012) y Vargas-Sánchez et al. (2014a) han demostrado que los flavonoides catequina o quercetina poseen una mayor capacidad para neutralizar radicales libres y evitan la formación de las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) por el grupo fenólico presente en su estructura.
La actividad antimicrobiana es una de las propiedades fundamentales de los propóleos, su acción bacteriostática y bactericida está basada en la inhibición de ácidos nucleicos y degradación de la membrana citoplasmática, y principalmente se le atribuye a flavonoides como pinocembrina, quercetina naringenina, acacetina, apigenina, crisina, galangina, kaempferol y pinobanskina (Vargas-Sánchez et al., 2014 b), así como alteración en los canales iónicos a consecuencia de reacciones de fosforilación y desfosforilación, disminuyendo la inhibición de la motilidad bacteriana, factor importante en la virulencia, y que ha sido demostrado por Farnesi, Aquino-Ferreira, De Jong, Bastos & Soares (2009).
En México se han realizado estudios del efecto antifúngico contra cepas de Candida albicans, indicando que el ácido cafeico, flavonoides y ésteres fenólicos son los principales responsables de esta actividad biológica, provocando cambios en la morfología del hongo (Londoño et al., 2010; Quintero-Mora et al., 2008).
Tolosa & Cañizares (2002) obtuvieron y caracterizaron extractos etanólicos de propóleos de diferentes localidades de Campeche, evaluando su acción antimicrobiana sobre S. aureus, S. typhi, P. aeruginosa y S. pyogenes. La especie bacteriana más sensible fue P. aeruginosa con una concentración mínima bactericida promedio de 3.33 mg/mL y para S. typhi de 9.82 mg/mL. Además, identificaron compuestos como fenoles, triterpenos, taninos, alcaloides, flavonoides, lactonas, saponinas y aminas.
En 1989, la Organización Mundial de la Salud (OMS) realizó un estudio a los productos naturales con alto contenido de fenoles y flavonoides, como los propóleos, porque contribuyen a reforzar la prevención y reducir el riesgo de padecer enfermedades metabólicas, cardiovasculares, entre otras (Bedascarrasbure, 2006; Farré et al., 2004).
En México, el apicultor recolecta propóleos y los oferta con fines antimicrobianos, por lo que es importante realizar el análisis de su composición química para determinar la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides, compuestos relacionados con la calidad y actividad biológica de esta resina, como lo establecen las normas de calidad. Si la actividad biológica es baja o nula, los propóleos serán de baja calidad, teniendo así un impacto económico para el apicultor. Actualmente, los propóleos son estudiados y utilizados en la industria farmacéutica, agrícola, cosmética y alimentaria, principalmente, ya que se buscan nuevas alternativas para desarrollar tratamientos contra enfermedades infecciosas provocadas por la multi-resistencia de los microorganismos frente a los antibióticos o antifúngicos convencionales y encontrar soluciones que ofrezcan alternativas terapéuticas a un bajo costo.
El objetivo del presente estudio fue analizar la composición química de ocho propóleos de cinco estados de la República Mexicana, para evaluar su actividad antioxidante y también su actividad antimicrobiana frente a cepas de referencia de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans, para fundamentar su utilización como una alternativa en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas y su posible uso en diferentes enfermedades metabólicas.
Materiales y Métodos
Recolección de propóleos
La recolección de los propóleos en greña se efectuó por los apicultores en apiarios de los municipios de Cuautitlán Izcalli, Estado de México (19° 41’ norte, 99° 11' oeste, 2260 m s.n.m.) (abril, 2013); El Oro, Estado de México (19° 43' norte, 99° 58' oeste, 3200 m s.n.m.) (septiembre, 2013); Villa del Carbón, Estado de México (19° 54' norte, 99° 39' oeste, 2600 m s.n.m.) (septiembre, 2012); Tlalpujahua, Michoacán (19° 18’ norte, 100° 08’ oeste, 2500 m s.n.m.) (mayo, 2013); San José Iturbide, Guanajuato (21° 07’ norte, 100° 32’ oeste, 2100 m s.n.m.) (abril, 2013); Tianguismanalco, Puebla (19° 04’ norte, 98° 35’ oeste, 2220 m s.n.m.) (noviembre, 2010 y noviembre, 2012); y Tlacotalpan, Veracruz (18° 36’ norte, 95° 39’ oeste, y 1000 m s.n.m.) (noviembre, 2012). Después de la recolección, se mantuvieron protegidos de la luz y en refrigeración (4 °C) hasta su utilización.
Caracterización del propóleo en greña
Las pruebas realizadas en el presente trabajo se realizaron con base a los parámetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana: Propóleos, producción y especificaciones para su procesamiento: NOM-003-SAG/GAN-2017 (Diario Oficial de la Federación [DOF], 2017); a excepción del estudio cromatográfico.
Existen otras normas de calidad a nivel mundial que evalúan parámetros de calidad, que pueden aplicarse a cualquier muestra de propóleo sin importar su origen vegetal y el contenido de metabolitos secundarios de las plantas; estos incluyen el contenido de ceras, contenido de agua, impurezas mecánicas, contenido de cenizas, punto de fusión o resinas solubles en etanol (Bankova et al., 2016; Rodríguez, 2015). El contenido de ceras se relaciona con la época de recolección, la manipulación del apicultor, la especie de abeja propolizadora o el método de obtención (Delgado, Andrade & Ramírez, 2015). La humedad excesiva puede favorecer el desarrollo de mohos y levaduras; las impurezas mecánicas pueden depreciar la calidad del producto; la cantidad de cenizas se relaciona con la presencia de contaminantes como metales (plomo, hierro, cobre) (Palomino, Martínez, García, Gil & Durango, 2010). En este trabajo no se evaluaron estos parámetros físicos y químicos debido a que los propóleos fueron obtenidos utilizando mallas plásticas como lo indica la normativa mexicana, por lo que presentan mejor calidad, con pocas impurezas y libres de contaminantes, pero se considera importante realizar estas evaluaciones para futuras investigaciones.
Especificaciones físicas
Previo a las pruebas organolépticas, las muestras se acondicionaron eliminando las impurezas visibles que acompañan al propóleo, tales como virutas de madera, restos de abejas, pinturas, vegetales, entre otros. La evaluación del color se realizó mediante la observación de la muestra empleando un microscopio estereoscópico y diferenciando las tonalidades predominantes presentes en esta. La descripción del aroma fue por la detección de dos tipos: olor a madera (resinoso) o a cera (balsámico). El sabor se identificó como dulce, amargo, picante o insípido. La consistencia se evaluó al tocar la muestra con los dedos, describiéndola como maleable o rígida. Estas pruebas fueron realizadas por el personal responsable de la evaluación de los propóleos del Laboratorio de Análisis de Propóleos de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), con base en la normatividad mexicana y que cuentan con la preparación suficiente para realizarlos.
Obtención del Rendimiento de los extractos secos
El rendimiento de los extractos se determinó por diferencia de peso con relación al peso seco inicial del propóleo (Gutiérrez, 2011). El cálculo del rendimiento de cada propóleo estudiado se realizó empleando la siguiente ecuación:
Especificaciones químicas
Preparación de los extractos etanólicos (EEP)
La preparación de los extractos etanólicos se realizó mediante el siguiente procedimiento: se pesaron 50 g de la muestra seca en una balanza analítica (marca AND, modelo HR200, Japón), enseguida se agregaron 150 mL de alcohol etílico al 70%, posteriormente, la mezcla se sometió a extracción en un ultrasonicador (Branson, CPX1800H, Danbury, Estados Unidos), el producto se filtró utilizando un sistema de filtración al vacío. Finalmente, el filtrado se concentró utilizando un rotovapor (Science MED, SM100-PRO, Finlandia) posteriormente se dejó la muestra a sequedad utilizando una bomba de vacío y el extracto seco se protegió de la luz y se refrigeró a 4 °C hasta su utilización (DOF, 2017; Trusheva, Trunkova & Bankova, 2007).
Contenido de compuestos fenólicos
La determinación de los compuestos fenólicos se realizó por el ensayo de Folin-Ciocalteu. Los reactivos y solventes utilizados fueron obtenidos de Sigma-Aldrich. Las muestras por evaluar se prepararon a una concentración de 0.05 mg/mL. Para la determinación se construyó una curva de calibración de 6.25 μg/mL a 200 μg/mL empleando al ácido gálico como estándar (Sigma-Aldrich). El procedimiento fue el siguiente: a 1 mL de extracto etanólico de propóleo (EEP) se adicionaron 6 mL de agua destilada, 500 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se dejó reaccionar durante 5 min; después, se añadieron 1.5 mL de Na2CO3 al 20% y se aforó con agua destilada a 10 mL. La mezcla se dejó reaccionar por 2 h; al terminar este tiempo, se midieron las absorbancias de las muestras a una longitud de onda de 760 nm en un espectrofotómetro de absorción UV-VIS (DLAB, SP-UV1000, China). El contenido de fenoles se expresó en porcentaje (%) (DOF, 2017).
Contenido de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinó por el método colorimétrico del cloruro de aluminio (AlCl3). Los reactivos y solventes utilizados fueron obtenidos de Sigma-Aldrich. Para llevar a cabo esta determinación, se realizó una curva de calibración de 1 µg/mL a 90 µg/mL utilizando quercetina como estándar de referencia. El procedimiento fue el siguiente: a 1 mL de la solución del EEP (0.05 mg/mL) se añadió 1 mL de metanol grado reactivo más 1 mL de AlCl3 al 2% y se dejó reaccionar por 10 min. Al terminar el tiempo de reacción, se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro de absorción UV-VIS (DLAB, SP-UV1000, China). Los resultados se expresaron en porcentaje (%) (DOF, 2017).
Propiedades antioxidantes
Índice de oxidación
El índice de oxidación se determinó de acuerdo con la NOM-003-SAG/GAN-2017 (DOF, 2017). El procedimiento fue el siguiente: a 20 mg de EEP se añadieron 5 mL de alcohol etílico al 70%, se dejó reaccionar por 1 h y a continuación se aforó a 100 mL con agua destilada, se agitó y filtró a gravedad utilizando papel Whatman No. 4. Se tomó una alícuota de 10 mL de la solución anterior y se aforó a 100 mL con agua destilada. Nuevamente, se tomó una alícuota de 2 mL de la solución anterior y se añadió 1 mL de H2SO4 al 20% y se agito por un minuto. Finalmente, se agregó una gota de KMnO4 0.1N, sin tocar las paredes, y se registró el tiempo (en segundos) que tardó en desaparecer el color violeta del KMnO4.
Capacidad antioxidante (CA50)
La evaluación de la capacidad antioxidante se determinó por la concentración requerida por la muestra para disminuir la absorbancia del DPPH• al 50% expresada en µg/mL, utilizando el método del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH•).
Las concentraciones por evaluar fueron de 1 µg/mL a 250 µg/mL a partir de una concentración inicial de 1 mg/mL. Como control negativo se utilizó metanol y como control positivo quercetina a las mismas condiciones que los EEP. El procedimiento fue el siguiente: se tomaron 250 µL del EEP y se añadió 750 µL de la solución de DPPH• (100 µM). Se protegió de la luz, dejando reaccionar la mezcla durante 30 min; al término de este tiempo, se determinó la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de absorción UV-VIS (DLAB, SP-UV1000, China). Se calculó el porcentaje de reducción mediante la siguiente fórmula:
La baja absorbancia de la mezcla de reacción indica alta actividad antioxidante (Barrón-Yánez, García-Mateos, Soto-Hernández, Colinas-León & Kite, 2011; DOF, 2017).
Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)
El análisis cromatográfico de los extractos etanólicos fue realizado en un cromatógrafo de gases (6850) acoplado a un espectrómetro de masas (modelo 5975C, Agilent Technologies®, Pennsylvania, USA). La columna capilar fue una HP-5MS (30 m × 0.25 mm) y grosor de película de 0.25 mm (J&C Scientific, Agilent Technologies®, Pennsylvania, USA). Como gas acarreador se utilizó Helio. El tipo de inyección fue en modo Split y el volumen de inyección de 1 µL. Las condiciones de separación utilizadas fueron al inicio una temperatura de 70 °C por 2 min con dos incrementos de rampa. El primero de 20 °C por minuto hasta alcanzar los 230 °C; el segundo fue de 8 °C por minuto hasta llegar a los 280 °C manteniéndose por 5 min. El tiempo total de análisis fue 21.25 min. El rango de masa detectado fue de 35 m/z a 750 m/z, la muestra fue ionizada por impacto electrónico a 70 eV y la temperatura alcanzada por la fuente de ionización fue de 230 °C. La identificación de los compuestos fue llevada a cabo por comparación con la biblioteca de la base de datos NIST versión 8.0 (Rivera-Yáñez et al., 2017).
Evaluación de la actividad antimicrobiana
La evaluación antimicrobiana se realizó empleando los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739 y Candida albicans ATCC 10231, proporcionados por el Laboratorio de Bioprospección Microbiológica de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM.
Preparación de la suspensión de microorganismos
La suspensión de los microorganismos se realizó de la siguiente manera. Se tomó una asada de las colonias a evaluar y se sumergió en caldo Mueller-Hinton (MH) (Bioxon, Ciudad de México, México) para las bacterias y caldo Sabouraud (Bioxon, Ciudad de México, México) para la levadura. Las muestras se incubaron a 37 °C por 24 h para las bacterias y a 37 °C por 48 h para la levadura. Se estandarizó al tubo 0.5 del nefelómetro de MacFarland: (1-2) x 108 UFC/mL utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (DLAB, SP-UV1000) a una longitud de onda de 625 nm con lecturas de absorbancia entre 0.08-0.12 (Barry et al., 2009,; Londoño et al., 2010; Rex et al., 2009).
Microdilución en caldo
La microdilución en caldo se realizó mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI), la concentración bactericida mínima (CBM) y la concentración fungicida mínima (CFM) utilizando la técnica de microdilución en caldo. Para lograr lo anterior, se realizaron diluciones seriadas del EEP de 0.012 mg/mL a 30 mg/mL en caldo MH (Bioxon, Ciudad de México, México). Como testigo positivo se empleó caldo MH con microorganismo y un testigo negativo con caldo MH sin el microorganismo. Para detectar la actividad respiratoria del microorganismo, se utilizó una solución al 0.08% de sal de tetrazolio oxidada (TTC) que genera un pigmento rojo (formazán) en presencia del microorganismo. Este procedimiento se realizó de la siguiente manera: 50 µL de TCC se añadieron a cada pozo inoculado, se mezcló utilizando un agitador de placas y se incubó a 37 °C por 30 min. Transcurrido este tiempo, se observó la formación de un precipitado insoluble de color rojo que representó la CMI. Donde no existió desarrollo, la solución permaneció de color claro, indicando la CBM o CFM. Para confirmar los resultados, se determinó si el efecto era bactericida o fungicida, al tomar una muestra del cultivo con un asa y sembrarla en una placa de agar MH que se mantuvo en incubación durante 37 °C por 24 h para las bacterias y por 48 h para el caso de la levadura. Se consideró que el crecimiento en la placa era indicativo de un efecto bacteriostático o fungistático, en tanto que la ausencia del mismo correspondía a un efecto bactericida o fungicida (Balouiri, Sadiki & Ibnsouda, 2016; Koneman, Allen, Dowell & Sommers, 2006; Quintero-Mora et al., 2008;).
Resultados
Especificaciones físicas
Las características físicas están relacionadas con la fuente vegetal, el método de recolección y el clima de la región donde es recolectado. La Tabla 1 muestra la vegetación más abundante en los sitios circundantes a las colmenas de cada localidad de donde se obtuvieron las muestras de propóleos analizadas en este estudio.
Tabla 1 Vegetación circundante a las colmenas donde se extrajeron las muestras de propóleos analizadas y las características físicas de cada muestra.
| Regiones de recolección |
Especies de plantas predominantes |
Nombre común |
Color | Aroma | Sabor | Consistencia |
| Cuautitlán Izcalli, Estado de México | Eucalyptus globulus Labill. | Eucalipto | Marrón verdoso, tintes amarillos | Resinoso | Amargo | Maleable |
| Ricinus communis L. | Higuerilla | |||||
| Callistemon citrinus (Curtis) Skeels | Cepillo o escobillón rojo | |||||
| El Oro y Villa del Carbón, Estado de México | Pinus sp | Pino | Marrón con tintes amarillos | Balsámico | Amargo | Maleable |
| Pinus teocote Schltdl. | Ocote | |||||
| Quercus rugosa Née | Encino | |||||
| Fraxinus excelsior L. | Fresno | |||||
| Eucalyptus globulus Labill. | Eucalipto | |||||
| Tlalpujahua-Senguio, Michoacán | Pinus pseudostrobus Lindl. | Pino | Marrón verdoso, tintes amarillos | Balsámico | Amargo | Maleable |
| Tianguismanalco, Puebla | Pinus sp | Pino | Marrón verdoso, tintes amarillos | Balsámico | Amargo | Rígida |
| Quercus rugosa Née | Encino | |||||
| San José Iturbide, Guanajuato | Opuntia ficus-indica L. | Nopal | Marrón verdoso, tintes amarillos | Resinoso | Amargo | Maleable |
| Acacia farnesiana (L.) Willd. | Huizache | |||||
| Prosopis glandulosa Torr. | Mezquite | |||||
| Schinus molle L. | Pirul | |||||
| Tlacotalpan, Veracruz | Quercus rugosa Née | Encino | Marrón verdoso, tintes amarillos | Resinoso | Amargo | Rígida |
| Fraxinus excelsior L. | Fresno | |||||
| Salix alba L. | Sauce | |||||
| Populus alba L. | Álamo | |||||
| Citrus sinensis (L.) Osbeck | Naranjo | |||||
| Citrus limonum Risso | Limón |
Fuente: Elaboración propia (INAFED, 2015; INEGI, 2009).
Las muestras recolectadas en los municipios de los estados de México, Guanajuato y Puebla presentaron un color marrón con tintes verdes y amarillos; las muestras de Michoacán y Veracruz presentaron un color marrón claro con tintes amarillos y verdosos. Las muestras de Estado de México presentaron un olor resinoso y el resto olor balsámico. El sabor de todas las muestras fue amargo. El 62.5% de las muestras presentó consistencia maleable y el resto rígidas (Tabla 1), observando que existen diferencias en las características de las muestras.
En la Figura 1 se muestran las tonalidades de los propóleos en greña a simple vista (1A a 8A) y las tonalidades más definidas de cada muestra, al utilizar un microscopio estereoscópico (1B a 8B). La extracción del propóleo en greña con etanol al 70% se realizó en las condiciones establecidas por la norma de calidad, para evitar alteraciones en los metabolitos secundarios (DOF, 2017). Las tonalidades de las muestras van del ámbar claro al café como se muestran en la Figura 1 (1C a 8C).
Fuente: Elaboración propia.
Figura 1 Aspecto de los propóleos obtenidos de las diferentes regiones de la República mexicana. A: Propóleo en greña; B: Vista microscópica (0.8X); C: Extracto etanólico. (1): Cuautitlán Izcalli, Estado de México; (2) Villa del Carbón, Estado de México; (3) El Oro, Estado de México; (4) Tlalpujahua-Senguio, Michoacán; (5) Tianguismanalco 2010, Puebla; (6) Tianguismanalco 2012, Puebla; (7) San José Iturbide, Guanajuato; (8) Tlacotalpan, Veracruz.
Especificaciones químicas
En la Tabla 2 se muestran los resultados del análisis químico de los ocho propóleos estudiados y el rendimiento de los extractos. Se pueden observar dos grupos, uno formado por las muestras del Estado de México (Cuautitlán Izcalli) y Michoacán, que presentaron niveles altos de fenoles y flavonoides, y el otro constituido por las muestras del Estado de México (Villa del Carbón y El Oro), Guanajuato, Veracruz y Puebla, con niveles más bajos.
Tabla 2 Especificaciones químicas de ocho propóleos de la República Mexicana aplicando la Norma Oficial Mexicana NOM-003-SAG/GAN-2017.
| Muestra | Rendimiento (%) |
Fenoles (%) |
Flavonoides (%) |
Índice de oxidación (s) |
Capacidad antioxidante (μg/mL) |
| Cuautitlán Izcalli, Estado de México |
50.9 | 19.1 ± 2.90a | 4.04 ± 2.7a | 168 ± 1.8a | 86.6 ± 0.003a |
| Villa del Carbón, Estado de México |
30.9 | 6.9 ± 0.001b | 0.67 ± 1.8b | 283 ± 0.0016b | 52.6 ± 0.01b |
| El Oro, Estado de México | 38.5 | 6.4 ± 0.003b | 1.94 ± 2.4c | 70 ± 0.0013c | 48.0 ± 0.015b |
| Tlalpujahua-Senguio, Michoacán | 43.2 | 18.3 ± 0.003a | 2.87 ± 2.6d | 377 ± 0.0029d | 26.0 ± 0.02c |
| Tianguismanalco 2010, Puebla | 39.4 | 5.0 ± 0.001c | 0.34 ± 0.5e | 2975 ± 2.4e | 189.3 ± 0.24d |
| Tianguismanalco 2012, Puebla | 34.2 | 4.0 ± 0.002c | 0.29 ± 0.4e | 3347 ± 1.4f | 277.9 ± 1.04e |
| San José Iturbide, Guanajuato | 25.5 | 5.2 ± 0.001c | 0.99 ± 0.7b | 1479 ± 0.0002g | 83.5 ± 0.03a |
| Tlacotalpan, Veracruz | 39.4 | 1.2 ± 0.0002d | 0.51 ± 0.5b | 2894 ± 1.24e | 950.4 ± 1.09f |
| Parámetro establecido en la NOM |
No establecido en la NOM |
Mínimo 5% |
Mínimo 0.5% |
Mínimo 22 s |
Hasta 100 μg/mL |
Fuente: Elaboración propia. * Cada valor es la media ± desviación estándar, n = 3.
Letras diferentes indican diferencias significativas (p < 0.05).
La cantidad de compuestos fenólicos de las muestras de Puebla, 2012, y Veracruz no cumplen las especificaciones de la norma de calidad. Respecto a la cantidad de flavonoides, las dos muestras de Puebla no presentan una cantidad superior a 0.5%, por lo que no cumplen con esta norma. Estos resultados difieren con lo reportado por Lozina, Peichoto, Acosta & Granero (2010), quienes mencionan que las tonalidades de los extractos etanólicos están relacionadas con el contenido de los compuestos fenólicos y flavonoides, porque las muestras de Puebla presentan un color ámbar y la muestra de Veracruz, un color amarillo.
Por otro lado, la cantidad de estos metabolitos y la capacidad antioxidante del propóleo están relacionadas. Una determinación rápida de esta actividad es el índice de oxidación para detectar la presencia de compuestos de naturaleza fenólica, o con grupos funcionales oxidables (Delgado et al., 2015) al utilizar permanganato de potasio (KMnO4) como agente oxidante de color violeta intenso, que se vuelve incoloro al reducirse el catión Mn7+ en una solución ácida (Graham, 2004; Palomino et al., 2010; Skoog, Holler & Crouch, 2005). Los resultados muestran que ninguna muestra cumple con lo establecido en la norma de calidad mexicana (mínimo 22 s), al obtener tiempos con rangos de 70 s a 1479 s, observando diferencias significativas entre los propóleos.
Para la capacidad antioxidante (CA50) se emplea el radical DPPH• monitoreando su reducción por un antioxidante con la disminución en la absorbancia y cambio de coloración de morado a amarillo. Los resultados de la capacidad antioxidante de los diferentes propóleos estudiados indican que las muestras del Estado de México, Michoacán y Guanajuato cumplen los requisitos de la norma de calidad con valores por debajo de los 100 μg/mL, lo que indica la presencia de compuestos antioxidantes.
Análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
Los resultados del análisis de cada muestra de propóleo mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) se muestran en las Tablas 3 a 9, donde se indican aquellos compuestos que tuvieron una identificación certera (> 90%) con relación a la base de datos del equipo. Se detectaron ácidos grasos, alcoholes, cetonas, flavonoides, terpenos e hidrocarburos en diferente abundancia porcentual. En las Figuras 2 a 8 se muestran los cromatogramas obtenidos para cada muestra analizada.
Tabla 3 Constituyentes del propóleo de Cuautitlán Izcalli, Estado de México caracterizado por CG-EM
| Pico | TR | % | Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química |
Actividad biológica | Referencia |
| (min) | Total | |||||
| 1 | 10.259 | 0.45 | Palmitato de etilo | Ácido graso | Fragancias en cosméticos, saborizante | NCBI (2018) |
| 2 | 11.025 | 0.47 | Éster etílico del ácido oleico | Ácido graso | Cebador de feromonas en las abejas | Leoncini et al., 2004 |
| 3 | 12.467 | 58.48 | Pinocembrina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiparasitaria. |
López, Ming & Neil, 2002; Rasul et al. 2013 |
| 4 | 13.162 | 9.55 | Tectocrisina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatoria | During & Larondelle, 2013 |
| 5 | 13.298 | 2.6 | 1-(3-aminopropil) azaciclotridecan-2-ona |
Cetona | Anticancerígena, analgésica, plaguicida |
García et al. 2007 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 4 Constituyentes del propóleo de Villa del Carbón, Estado de México, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR (min) |
% Total |
Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química | Actividad biológica | Referencia |
| 1 | 4.71 | 1.97 | Borneol | Terpeno | Antimicrobiana |
Jiang et al. 2011; Santoyo et al. 2005 |
| 2 | 10.948 | 0.84 | Ácido vaccénico | Ácido graso | Promotor del factor de crecimiento | Sanhueza, Nieto & Valenzuela, 2002 |
| 3 | 12.456 | 3.78 | Pinocembrina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiparasitaria |
López, Ming & Neil, 2002; Rasul et al. 2013 |
| 4 | 16.361 | 1.48 | Taraxasterol | Terpeno | Antiinflamatoria | Zhang, Xiong & Liu, 2012 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 5 Constituyentes del propóleo de El Oro, Estado de México, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR | % | Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química | Actividad biológica | Referencia |
| (min) | Total | |||||
| 1 | 4.265 | 3.18 | Alcohol feniletílico | Alcohol | Antimicrobiana | NCBI (2018) |
| 2 | 6.087 | 3 | 2-Metoxi-4-vinilfenol | Fenol | Antimicrobiana, antioxidante | López-Mejía, López-Malo & Palou, 2014 |
| 3 | 8.206 | 0.25 | Cadideno: 7-epi-α-cadineno | Terpeno | Antimicrobiano | NCBI (2018) |
| 4 | 8.449 | 0.36 | Cadideno: cadina-3,9-dieno | Terpeno | Antimicrobiano | NCBI (2018) |
| 5 | 8.592 | 1.07 | (1E) -1-Etiliden-7a-metilperhidroindeno | Hidrocarburo | Lipogénesis | NCBI (2018) |
| 6 | 10.159 | 1.89 | Ácido palmítico | Ácido graso | Lipogénesis | NCBI (2018) |
| 7 | 10.408 | 0.35 | Hexadecanal | Ácido graso | Producción de lípidos y ácidos grasos | NCBI (2018) |
| 8 | 10.954 | 0.58 | Ácido oleico | Ácido graso | Cardioprotector | NCBI (2018) |
| 9 | 10.978 | 0.48 | Metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico | Ácido graso | No referido | No referido |
| 10 | 11.031 | 0.52 | Ácido esteárico | Ácido graso | Tensoactivo | NCBI (2018) |
| 11 | 11.263 | 0.4 | 1,19-Eicosadieno | Hidrocarburo | Antibacteriano | NIST |
| 12 | 12.111 | 10.23 | Cardamonina | Chalcona | Antimicrobiana | Cho et al. 2009 |
| 13 | 12.283 | 0.7 | 3-Pentadecilfenol | Fenol | Inhibidor de la acetilcolinesterasa; tratamiento para el Alzheimer | Stasiuk, Bartosiewicz& Kozubek, 2008 |
| 14 | 12.45 | 22.67 | Pinocembrina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiparasitaria |
López, Ming & Neíl, 2002; Rasul et al. 2013 |
| 15 | 12.8 | 11.95 | Tectocrisina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatoria | During & Larondelle, 2013 |
| 16 | 13.37 | 2.23 | Sakuranetina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatoria | Shimizu et al. 2012 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 6 Constituyentes del propóleo de Tlalpujahua-Senguio, Michoacán, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR | % | Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química | Actividad biológica |
Referencia |
| (min) | Total | |||||
| 1 | 7.903 | 0.45 | Ácido dodecanóico (ácido laúrico) | Ácido graso | Antimicrobiana, antiviral |
Mora, 2003; Ruzin & Novick, 2000 |
| 2 | 8.586 | 0.47 | (1E) -1-Etiliden-7a-metiloctahidro-1H-indeno | Hidrocarburo | Lipogénesis | PubChem, 2018 |
| 3 | 10.265 | 1.68 | Palmitato de etilo | Ácido graso | Fragancias en cosméticos, saborizante | NIST, 2011 |
| 4 | 10.722 | 15.75 | Aromadendreno | Terpeno | Antimicrobiana | Mulyaningsih, Sporer, Zimmermann, Reichling & Wink, 2010 |
| 5 | 10.96 | 0.95 | Ácido oleico | Ácido graso | Antimicrobiana, modulador hormonal, antioxidante |
Barbosa & Mandarim de-Lacerda, 2010; Dilika, Bremner & Meyer, 2000; Naughton, Hanson, Mathai & McAinch, 2018 |
| 6 | 11.037 | 5.37 | Éster etílico del ácido oleico | Ácido graso | Cebador de feromonas en las abejas | Leoncini et al., 2004 |
| 7 | 11.957 | 27.06 | Esclareno | Terpeno | Antibacteriana | Gaviria, Quijano, Pino & Madriñán, 2011 |
| 8 | 12.117 | 10.53 | Cardamonina | Chalcona | Antimicrobiana | Cho et al. 2009 |
| 9 | 12.159 | 0.72 | 1,1,7-Trimetildecahidroespiro[ciclo-propa[e]azuleno-4,2'-oxirano] | Terpeno | Antagonista de calcio | NIST, 2011 |
| 10 | 12.45 | 7.61 | Pinocembrina | Flavonoide | Antimicrobiana, antioxidante, antiparasitaria |
López, Ming & Neil, 2002; Rasul et al. 2013 |
| 11 | 12.628 | 0.73 | Eicosano | Hidrocarburo | No referido | No referido |
| 12 | 14.847 | 0.36 | 3,5,7,4'-Tetrametoxiquercetina | Flavonoide | No referido | No referido |
| 13 | 16.023 | 4.15 | Lupenona | Terpeno | Antimicrobiana, antiinflamatoria, antioxidante, antipirética, antiparasitaria | Ahn & Oh, 2013 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 7 Constituyentes del propóleo de Tianguismanalco 2012, Puebla, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR (min) |
% Total |
Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química |
Actividad biológica |
Referencia |
| 1 | 7.915 | 1.25 | Ácido dodecanoico (ácido laúrico) | Ácido graso | Antimicrobiana, antiviral |
Mora, 2003; Ruzin & Novick, 2000 |
| 2 | 10.259 | 0.62 | Palmitato de etilo | Ácido graso | Fragancias en cosméticos, saborizante | NIST, 2011 |
| 3 | 10.687 | 0.93 | 11-Nonadecanol | Alcohol | Antimicrobiana; citotóxica | Kuppuswamy, Jonnalagadda & Arockiasamy, 2013 |
| 4 | 10.948 | 4.97 | Ácido vaccénico | Ácido graso | Promotor del factor de crecimiento | Sanhueza et al., 2002 |
| 5 | 11.025 | 1.40 | Ácido oleico | Ácido graso | Antimicrobiana, modulador de las respuestas hormonales, antioxidante |
Barbosa & Mandarim de-Lacerda, 2010; Dilika et al. 2000; Naughton et al. 2018 |
| 6 | 14.58 | 17.85 | Geranilgeraniol | Terpeno | Antibacteriana, antiinflamatoria, antiparasitaria. |
Giriwono et al. 2013; Inoue et al. 2005; Menna-Barreto et al. 2008 |
| 7 | 16.011 | 15.70 | Lupenona | Terpeno | Antimicrobiana, antiinflamatoria, antioxidante, antipirética, antiparasitaria |
Ahn & Oh, 2013; Polanco-Hernández et al. 2013; Talla et al. 2013 |
| 8 | 16.213 | 12.67 | α-Amirina | Terpeno | Antioxidante, analgésica, hiperglucemiante e hipolipemiante | Almeida et al. 2012 |
| 9 | 16.533 | 16.31 | Lupeol | Terpeno | Antimicrobiana, antiparasitaria, antiinflamatoria, antioxidante | Gallo & Sarachine, 2009; Santiago & Mayor, 2014 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 8 Constituyentes del propóleo de San José Iturbide, Guanajuato, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR (min) |
% Total |
Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química |
Actividad biológica |
Referencia |
| 1 | 7.897 | 4.4 | Ácido laúrico | Ácido graso | Antimicrobiana, antiviral |
Mora, 2003; Ruzin & Novick, 2000 |
| 2 | 10.147 | 1.15 | Ácido palmítico | Ácido graso | Lipogénesis | NCBI (2018) |
| 3 | 10.319 | 0.33 | Aromadendreno | Terpeno | Antimicrobiana | Mulyaningsih et al., 2010 |
| 4 | 12.432 | 5.02 | Selineno | Terpeno | Antimicrobiana |
Pino, Meléndez & Stashenko, 2009; Sitarek et al. 2017 |
Fuente: Elaboración propia.
Tabla 9 Constituyentes del propóleo de Tlacotalpan, Veracruz, caracterizado por CG-EM.
| Pico | TR (min) |
% Total |
Compuesto propuesto por la base de datos |
Clasificación química |
Actividad biológica |
Referencia |
| 1 | 5.132 | 0.21 | Verbenona | Terpeno | Antimicrobiana |
Santoyo et al. (2005); Jiang et al. (2011) |
| 2 | 11.809 | 0.46 | Ferruginol | Fenol y terpeno | Antitumoral, antibacteriana, gastroprotector |
Flores et al. (2001) |
| 3 | 13.293 | 1.42 | Escualeno | Terpeno | Antibacteriana | NIST, 2011 |
| 4 | 16.231 | 9.76 | 12-Oleaneno | Terpeno | Antibacteriana | Muhammad et al. (2000) |
| 5 | 16.385 | 5.19 | 4,8a-Dimetil-6- (1-metiletenil)- 3,5,6,7,8, 8a-hexahidro-2 (1H)-naftalenona |
Hidrocarburo | No referido | No referido |
| 6 | 16.504 | 5.98 | Cicloartenol | Terpeno | Biosíntesis de estanoles y esteroles, antiinflamatoria |
Machado et al. (2016) |
Fuente: Elaboración propia.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 2 Cromatograma de gases correspondiente al propóleo de Cuautitlán Izcalli, Estado de México.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 3 Cromatograma de gases correspondiente del propóleo de Villa del Carbón, Estado de México.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 4 Cromatograma correspondiente del propóleo de El Oro, Estado de México.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 5 Cromatograma de gases correspondiente al propóleo de Tlalpujahua-Senguio, Michoacán.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 6 Cromatograma de gases correspondiente al propóleo de Tianguismanalco 2012, Puebla.
Fuente: Rodríguez (2015).
Figura 7 Cromatograma de gases correspondiente al propóleo de San José Iturbide, Guanajuato.
Fuente: Rodríguez, 2015.
Figura 8 Cromatograma de gases correspondiente al propóleo de Tlacotalpan, Veracruz.
Evaluación de la actividad antimicrobiana
Los resultados de la evaluación de la actividad antimicrobiana se presentan en la Tabla 10. En la Figura 9 se ejemplifica la evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) para el caso de S. aureus frente al extracto de propóleo de Michoacán y de Cuautitlán Izcalli, Estado de México. En los pozos donde hay microorganismos, se observa disminución en el color y la formación de un botón rojo en el fondo de la concavidad representando la CMI y, donde no hay desarrollo, la solución permanece de color amarillo y representa la CMB. En la Figura 10 se muestra la confirmación del resultado bacteriostático y bactericida.
| Muestra |
S. aureus ATCC 6538 |
E. coli ATCC 8739 |
C. albicans ATCC 10231 |
|||
| CMI (mg/mL) |
CMB (mg/mL) |
CMI (mg/mL) |
CMB (mg/mL) |
CMI (mg/mL) |
CMF (mg/mL) |
|
| Cuautitlán Izcalli, Estado de México |
0.19 | 0.37 | 3.75 | 15.00 | 0.75 | 1.50 |
| Villa del Carbón, Estado de México |
0.46 | 0.93 | 7.50 | 30.00 | 24.00 | > 24.00 |
| El Oro, Estado de México |
0.93 | 1.87 | 7.50 | 30.00 | 1.80 | 7.50 |
| Tlalpujahua-Senguio, Michoacán |
0.37 | 0.75 | 7.50 | 30.00 | 0.75 | 3.00 |
| Tianguismanalco 2010, Puebla | 30.00 | > 30.00 | 15.00 | 30.00 | 7.50 | 30.00 |
| Tianguismanalco 2012, Puebla |
15.00 | 30.00 | 15.00 | >30.00 | 3.75 | 15.00 |
| San José Iturbide, Guanajuato |
0.46 | 0.93 | 3.75 | 15.00 | 12.00 | 24.00 |
| Tlacotalpan, Veracruz |
30.00 | > 30 | 15.00 | 30.00 | 15.00 | 30.00 |
Fuente: Elaboración propia.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 9 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (rojo) y Concentración Mínima Bactericida (negro) de Staphylococcus aureus ATCC 6538 frente al propóleo de Tlalpujahua-Senguio (Michoacán) y de Cuautitlán Izcalli, Estado de México, por microtécnica de dilución en caldo.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 10 Confirmación de la Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida de Staphylococcus aureus ATCC 6538 frente al propóleo de Tlalpujahua-Senguio (Michoacán) y de Cuautitlán Izcalli, Estado de México.
Se observó que todas las muestras presentan actividad antimicrobiana frente a los tres microorganismos evaluados. Las muestras de Puebla y Veracruz presentan una baja actividad antimicrobiana, al requerir concentraciones elevadas del extracto para actuar sobre los microorganismos.
Discusión
La gran diversidad vegetal y climática de México son factores que han propiciado la producción de propóleos con una gran variedad de colores, aromas y sabores, características que en conjunto se denominan propiedades organolépticas (Ramírez-Arriaga, Martínez-Bernal, Ramírez & Martínez-Hernández, 2016).
Estudios realizados en muestras de propóleos de los diferentes estados de la República Mexicana muestran una gran variación en colores, texturas, grados de humedad, dependientes del lugar de origen, la vegetación y el tipo de clima (Delgado et al., 2015; Hernández et al., 2016).
Los propóleos en greña estudiados presentaron tonalidades en marrón verdoso con tintes amarillos, parámetro que no puede estandarizarse por ser dependiente del origen vegetal. El aroma en su mayoría fue balsámico, que se relaciona con compuestos aromáticos y volátiles de mezclas complejas entre alcoholes, aldehídos, cetonas y ésteres o terpenos, estos últimos presentes en especies de la familia Pinaceae (Salamanca, Correa & Principal, 2007) localizados alrededor de los apiarios de El Oro y Villa del Carbón en el Estado de México, de Michoacán y de Puebla.
La principal fuente botánica de Cuautitlán Izcalli, Estado de México, es de árboles de eucalipto (Eucalyptus globulus L.), higuerilla (Ricinus communis L.) y cepillo (Callistemon citrinus), como lo reporta Londoño et al. (2010), y le proporcionan aroma resinoso al propóleo.
La variación en la vegetación presente en cada localidad hace que sea importante utilizar métodos palinológicos con el fin de determinar qué flora fue visitada por las abejas para recolectar la materia prima (resina, cera y polen) para formar los propóleos (Ramírez-Arriaga et al., 2016; Vargas-Sánchez, Peñalba-Garmendia, Sánchez-Escalante, Torrescano-Urrutia & Sánchez-Escalante, 2016).
Por otro lado, el índice de oxidación en los propóleos es influenciado por el contenido de compuestos fenólicos (Bedascarrasbure, 2006). Los resultados indican que ninguna muestra cumple con lo establecido en la norma de calidad mexicana (mínimo 22 s), considerando que es una prueba visual, la cual presenta inconvenientes básicos como la distinción de colores por el ojo humano y, como factor añadido, el subjetivismo. Es por ello que se realiza la determinación de la actividad antioxidante por técnicas espectrofotométricas (Skoog et al., 2015). Al comparar los resultados de la cantidad de flavonoides de este estudio (0.29% a 2.87%) con los reportados por Hernández-Zarate et al. (2017), en propóleos de Guanajuato (1.32% a 37%) existe diferencia en la cantidad de flavonoides que se atribuye al tipo de vegetación de la cual las abejas recolectan las resinas, principalmente. Kumazawa, Hamasaka & Nakamaya (2004) indican la diferencia observada en la composición química de propóleos de diferentes orígenes geográficos y lo difícil que resulta esto al evaluar la calidad de un propóleo.
Por otro lado, es de consideración la estructura química de los flavonoides para una mayor capacidad antioxidante, como son: la presencia en el anillo B de la estructura catecol u orto-dihidroxi; la presencia de un doble enlace en la posición 2 y 3 del anillo C, y la presencia de un grupo hidroxilo en las posiciones 3 y 5 del anillo A (Limón et al., 2010; Quiñones et al., 2012; Vargas-Sánchez et al., 2014b).
Los propóleos de Cuautitlán Izcalli, Estado de México y de Michoacán presentaron el mayor porcentaje de fenoles y flavonoides. En las tres muestras del Estado de México y de Michoacán se detectó la presencia de pinocembrina (5,7-dihidroxiflavanona), que es uno de los principales flavonoides aislados de plantas de zonas templadas como Pinus sp., Eucalyptus sp. (Rasul et al., 2013) y árboles de la especie de Populus (álamos) reportados por primera vez por Lugo-Sepúlveda, Martínez-Robinson, Morales, De la Rosa & Noriega (2009). Este flavonoide se caracteriza por presentar dos grupos hidroxilo libres en posiciones 5 y 7 (anillo A), confiriéndole la actividad antioxidante.
En este sentido, Lugo-Sepúlveda et al. (2009) indican que la Yerba blanca (Encelia farinosa) es la principal fuente botánica de los propóleos de Sonora, logrando identificar cuatro flavonoides principales: pinocembrina, xantomicrol, crisina y galangina en la planta y en los propóleos de Caborca, Sonora, con gran potencial antioxidante.
Los principales compuestos detectados en las muestras de Puebla fueron triterpenos pentacíclicos como el lupeol, la lupenona y la β-amirina, provenientes de las resinas del tronco de los pinos (Ormeño & Fernández, 2012) y que han sido identificados en propóleos de Brasil vinculados a actividades antiinflamatorias, anticancerígenas y antivirales (Bracho, Rodríguez & Llanes, 2009), pero que mostraron baja actividad antioxidante.
Otra propiedad de los propóleos es su actividad antimicrobiana (Vargas-Sánchez et al., 2014a). Los resultados de los propóleos del Estado de México indican mayor sensibilidad de S. aureus, debido a que las resinas colectadas por las abejas provienen de las especies del género Eucalyptus (Londoño et al., 2010), reconocido por su actividad antibacteriana (Yáñez & Cuadro, 2012)
Velázquez et al. (2007) evaluaron la actividad antimicrobiana de propóleos del desierto de Sonora. No se presentó efecto sobre E. coli y P. aeruginosa, únicamente sobre S. aureus, que se relaciona con la presencia de pinocembrina, acacetina, éster fenetílico del ácido cafeíco (caffeic acid phenethyl ester [CAPE]), crisina, galangina, pinobanksina y naringenina.
En otro estudio realizado por Vargas-Sánchez et al. (2014a) sobre la composición química de un extracto de propóleo comercial, detectaron compuestos como el ácido cinámico, crisina, quercetina, pinocembrina y kaempferol con potencial antimicrobiano y antioxidante para la aplicación del propóleo en la prevención del deterioro oxidativo de alimentos.
Los resultados del presente trabajo confirman la baja sensibilidad de las especies Gram negativas comparadas con las Gram positivas. La bacteria E. coli requiere concentraciones más elevadas de propóleo, como lo mencionan Probst, Sforcin, Rall, Fernandes & Fernandes (2011), ya que la estructura de la pared de las bacterias Gram negativas presenta una membrana externa compleja con dos bicapas lipídicas que actúan como barreras físicas entre los microorganismos y el medio ambiente, lo que evita las interacciones de la célula bacteriana con sustancias dañinas, razón por la que se requieren concentraciones mayores para su inhibición. Las bacterias Gram positivas presentan solo una membrana relativamente permeable, lo que las hace más susceptibles a las interacciones con el medio ambiente.
Los flavonoides detectados en los propóleos estudiados fueron la pinocembrina (flavanona) y la tectocrisina (flavona), y un precursor de flavonoide, la cardomonina (chalcona). Xie, Yang, Tang, Chen & Ren (2015) investigaron que las flavononas requieren la presencia de sustituyentes hidroxilo en la posición 2’,4’ o 2’,6’ en el anillo B, en la posición 5,7 del anillo A o un grupo alifático de cadena larga en la posición 6 u 8; las flavonas requieren de una cadena orto-alquilamino en C-7; las chalconas de sustituyentes hidroxilo en 2’ o 4’ del anillo A para ser lipofílico, para presentar actividad antioxidante.
Los mecanismos antimicrobianos de los flavonoides que han sido propuestos son inhibición de la motilidad, inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos, inhibición de las funciones de la membrana citoplasmática, inhibición del metabolismo energético, inhibición de la unión y formación de biopelículas, inhibición de las porinas y atenuación de la patogenecidad (Akca et al., 2016; Xie et al., 2015).
La actividad de los propóleos contra C. albicans mostraron un efecto fungistático a bajas concentraciones en el propóleo de Cuautitlán Izcalli, Estado de México (1.5 mg/mL), en comparación con Quintero et al. (2008) donde reportan la actividad antifúngica de ocho extractos etanólicos de propóleos provenientes de diferentes regiones de México frente a cepas de C. albicans, de referencia (ATCC 10231) y 36 cepas de origen clínico, determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) por el método de dilución en agar, realización de curvas de crecimiento en caldo glucosado de Sabouraud solo y con diferentes concentraciones de los extractos etanólicos de propóleos. Los resultados mostraron que los propóleos de Cuautitlán Izcalli y Amatepec (Estado de México) tuvieron mayor actividad biológica con acción fungicida de 0.6 mg/mL frente a la levadura, y concluyen que puede ser utilizado como tratamiento alternativo de candidiasis.
Por otro lado, Flores, Moreno, Londoño & Cruz (2016) reportan la eficacia del propóleo de Cuautitlán Izcalli, Estado de México, como tratamiento de las lesiones en piel en caballos producidas por C. albicans, debido a la capacidad de inducir la inhibición del tubo germinativo impidiendo la transición de levadura a micelio, cambios en la pared celular de las levaduras, con sitios de gemación irregulares y perturbación de la división, resultando en defectos en la textura de la pared de las células hijas (Londoño et al., 2010).
La presencia de compuestos con actividad antifúngica en los propóleos de Tlalpujahua-Senguio y El Oro, como la pinocembrina y el 2-metoxi-4-vinilfenol, provocan la sensibilidad de la levadura con una CMF de 3.0 mg/mL y 7.5 mg/mL, respectivamente, compuestos que se encuentran en especies de pinos alrededor de los apiarios, presentaron 5% o más de compuestos fenólicos y 0.5% o más de flavonoides, como lo establece la normativa mexicana. Los propóleos de Puebla y Veracruz tuvieron una disminuida actividad antimicrobiana debido a que presentan valores mínimos de estos compuestos bioactivos.
Con estos importantes datos, los resultados de este estudio muestran que los componentes químicos de los propóleos estudiados son compuestos con actividad antimicrobiana y antioxidante, y estas están relacionadas con la cantidad presente de cada compuesto en el propóleo, como lo han reportado diferentes estudios.
Varios investigadores han reportado que los mecanismos antioxidantes propuestos son mediante secuestro de radicales libres, o actuando como substrato para radicales, tales como superóxido e hidroxilo, y quelación de iones metálicos y que el mecanismo antimicrobiano involucra la inhibición de ácidos nucleicos y degradación de la membrana citoplasmática (Vargas-Sánchez et al., 2014b); sin embargo, no hay reportes relacionados con respecto al mecanismo de acción de los propóleos mexicanos, pero es evidente que los resultados anteriores sugieren que su actividad biológica se debe a la combinación y sinergia de los diferentes compuestos químicos que los integran (Lotti et al., 2010; Morgado et al., 2014), siendo necesario estudios en microscopía electrónica, genética y biología molecular, que nos permitan apreciar el daño estructural en los microorganismos evaluados para proponer un posible mecanismo de acción.
Conclusiones
Se realizó el estudio de la composición química de ocho propóleos de la República Mexicana, identificando la variedad de los compuestos más abundantes en cada uno. Las muestras con niveles elevados de flavonoides son las provenientes del Estado de México y Michoacán, presentando propiedades antioxidantes elevadas y actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans. Los propóleos de los municipios de Puebla, Guanajuato y Veracruz no contienen cantidades importantes de fenoles y flavonoides; en consecuencia, presentan una disminución en las propiedades evaluadas y no cumplen las especificaciones de la norma de calidad de México para ser ofertados como producto con actividad antimicrobiana.
Las propiedades biológicas de los propóleos están relacionadas con la variabilidad de los compuestos fenólicos y de flavonoides, lo que se puede relacionar con factores como la vegetación, el clima, el tipo de abeja, entre otras, por lo que se recomienda continuar con la investigación acerca del origen botánico de los propóleos de la República Mexicana. Es importante, en México, fomentar la producción y evaluación de propóleos que garantice sus propiedades, principalmente químicas y antimicrobianas, beneficiando así al sector apícola y al usuario de este producto.
