Introducción

Dentro de las infecciones de la cavidad bucal, las de mayor prevalencia son las de origen odontogénico (^{De la Teja-Ángeles, Cadena-Galdós, Téllez-Rodríguez & Durán-Gutiérrez, 2007}). La caries es la patología bacteriana crónica más común en el mundo y está presente en un 60%-90% de los niños en edad escolar. El seguimiento de los procesos cariogénicos en la edad pediátrica se ha convertido en un asunto de salud pública, puesto que la presencia o ausencia de caries en este periodo de la vida es predictivo de la salud bucal que el individuo presentará en su vida adulta. Existen varios factores etiológicos que participan en el desarrollo de caries y cada uno contribuye en diferente grado para su aparición (^{Matsui & Cvitkovitch, 2010}; ^{Subramaniam, Babu Ki & Nagarathna, 2012}; ^{Wang et al., 2012}). Estos factores etiológicos se encuentran agrupados en tres hipótesis principales: la hipótesis de la placa específica, la hipótesis de la placa no específica, y la hipótesis de la placa ecológica (^{Aas et al., 2008}).

En la actualidad se plantea que la etiopatogenia de esta enfermedad es multifactorial, en la que existe interacción de tres factores principales: el huésped (higiene bucal, la saliva y los dientes), la microbiota (infecciones bacterianas) y el sustrato (dieta cariogénica) (^{González-Rodríguez, Pedroso-Ramos, Rivero-Villalón & Reyes-Suárez, 2015}). Para que se forme una caries es necesario que las condiciones de cada factor sean favorables, es decir, un huésped susceptible, un microbiota oral cariogénica y un sustrato apropiado que deberá estar presente durante un período determinado (^{Fortich-Mesa, 2018}; ^{Molina-Frechero, Durán-Merino, Castañeda-Castaneira & Juárez-López, 2015}).

Los microorganismos implicados son complejos y variables y no se conocen en su totalidad, pero ya se han reconocido los microorganismos asociados al progreso de la caries (^{Badet & Thebaud, 2008}). Los agentes causales reconocidos de esta enfermedad son Streptoccocus ssp, principalmente S. mutans y S. sobrinus; y Lactobacillus ssp; aunque la literatura reporta otras bacterias asociadas a procesos cariogénicos en dentición infantil, que incluyen Veillonella spp, Actinomyces spp, Bifidobacterium spp y Lactobacillus fermentum (^{Aas et al., 2008}; ^{Kanasi et al., 2010}). Estas bacterias son acidogénicas y acidúricas e interaccionan en la biopelícula formada sobre la superficie dental (^{Ramalingam, Amaechi, Ralph & Lee, 2012}). Las biopelículas son comunidades microscópicas que consisten primariamente de bacterias (^{Maddi & Scannapieco, 2013}) y representan un problema para la salud pública por su fácil formación en válvulas cardiacas, catéteres venosos, dispositivos intrauterinos y superficies dentales. Para lograr la prevención de la caries, se han realizado numerosos estudios epidemiológicos enfocados a comprender los agentes etiológicos, su comportamiento dentro de la biopelícula y los mecanismos de patogenicidad, así como conocer su interacción con los factores ambientales y genéticos (^{Subramaniam, Babu ki & Nagarathna, 2012}).

Estos estudios han determinado que el procedimiento más eficaz en la prevención de la caries es la eliminación mecánica de la placa dental a través del cepillado; lamentablemente es escaso el número de personas que realiza este procedimiento eficazmente. Es por esto que los estudios actuales se han enfocado en la búsqueda de compuestos anticariogénicos que puedan incluirse en productos dentales para reducir la formación de biopelícula y, con ello, disminuir la incidencia de caries. Se ha reportado la eficacia de antibióticos y otros agentes antimicrobianos como la ampicilina, la clorhexidina, el metronidazol y desinfectantes, como aquellos de sales de amonio cuaternario en la prevención de la caries dental, pero estos presentan efectos adversos tales como la tinción de los dientes, aumento de la formación de cálculo dental, así como desajustes de la microbiota oral e intestinal (^{Porto et al., 2009}). Se ha destacado la importancia de otras alternativas de prevención y tratamiento mediante el uso de los productos naturales, como son el uso de extractos de plantas (Extracto de la Viguiera arenaria) y sales metálicas (como el Cu₂SO₄) como agentes antibacterianos naturales en productos de cuidado oral (^{Porto et al., 2009}).

La actividad antimicrobiana del Cu²⁺ ha motivado el desarrollo de estudios tendientes a conocer los beneficios de aplicaciones de este metal y sus derivados en la terapéutica y control de enfermedades infecciosas, locual, proyectado a la odontología, podría tener un uso clínico positivo en la prevención de la caries. El Cu₂SO₄ al 0.5% o al 2%, por ejemplo, es recomendado como un astringente en casos de gingivitis crónica, sobre todo de tipo edematosa (^{Lima-Álvarez, Reigada-Martínez & Vara-Delgado, 2000}). La Asociación Internacional de Cobre (ICA, por sus siglas en inglés), que se dedica a la investigación del cobre para su aplicación en las distintas ramas de la medicina, recomienda el uso del Cu²⁺ en forma de Cu₂SO₄ para evitar contaminación cruzada e infecciones intrahospitalarias (^{Espírito-Santo, Vasconcelos-Morais & Grass, 2010}) y para hacer curación de heridas o desinfectar el agua de consumo humano (^{Ren et al., 2009}). Entre sus propuestas a futuro se encuentran el uso de óxido de cobre en ropa, cepillos dentales y pañales, entre otras (^{Grass, Rensing & Solioz, 2011}).

En la actualidad existe una tendencia en la búsqueda de compuestos naturales con propiedades medicinales. Los terpenos son compuestos hidrofóbicos, principalmente de origen vegetal, que participan en casi todas las interacciones biológicas: plantas y microorganismos o entre las mismas plantas, actuando como fitoalexinas, antialimentarios de insectos o agentes de defensa (^{Wagner & Elmadfa, 2003}). Los terpenos tienen amplia actividad antibacteriana, antifúngica y antiprotozoaria (^{Knezevic et al., 2016}; ^{Trombetta et al., 2005}). Estos compuestos son los responsables de dar el aroma característico de las plantas; el geraniol, por ejemplo, se encuentra en la mayoría de los cítricos, al igual que el limoneno (^{Da Silva, 2015}). Ambos corresponden a los aromas característicos de naranja y limón respectivamente. El mentol es el responsable de darle el aroma característico a las plantas del género Mentha (^{Vacca-Molina, 2015}).

El presente artículo tiene como objetivo evaluar y comparar la actividad antimicrobiana del sulfato de cobre (Cu₂SO₄) sobre Streptoccocus mutans y Lactobacillus acidophilus, solo y en asociación con compuestos terpénicos, así como evaluar su capacidad de inhibir la formación de biopelículas.

Materiales y Métodos

Se realizó un estudio experimental para evaluar la propiedad antimicrobiana del sulfato de cobre (Cu₂SO₄) sobre cepas de Lactobacillus acidophilus y Streptococcus mutans, tanto en estado planctónico como en biopelícula. Además, se evaluaron las propiedades antimicrobianas del Cu₂SO₄ en sinergia con las moléculas terpénicas geraniol, limoneno y mentol (Sigma-Aldrich; St. Louis, MI, USA).

Resultados

Los resultados demuestran que el Cu₂SO₄ posee actividad antimicrobiana relevante, específicamente en un rango de 50 μg/mL a 100 μg/mL para el L. acidophilus (Tabla 1). Esto equivale a soluciones al 0.005% a 0.010%, perfectamente compatibles con el ser humano si se toma en cuenta que la dosis de ingesta diaria recomendada para un lactante es el equivale a 0.02% (^{Cruz et al., 2017}; ^{Espírito-Santo et al., 2010}). S. mutans resultó ser más resistente, con valores de CMI y CMB de 100 μg/mL y 250 μg/mL, respectivamente.

El presente trabajo, además de evaluar la actividad antimicrobiana del Cu²⁺ en forma de Cu₂SO_4, tiene como objetivo encontrar efectos antimicrobianos en asociación con productos naturales. Para tal efecto también fue evaluada la actividad antimicrobiana del geraniol, limoneno y mentol, tres monoterpenos encontrados en diversos aceites esenciales (Figura 1).

Fuente: Elaboración propia.

Figura 1 Estructura química de los monoterpenos evaluados. a) Geraniol, b) Limoneno, c) Mentol. 

Los valores de CMI y CMB de estos compuestos se encuentran en la Tabla 1. Los resultados demuestran la actividad bacteriostática y bactericida de estos compuestos, siendo el geraniol el de mayor actividad contra todas las cepas de L. acidophilus y S. mutans.

El análisis de varianzas demostró que existen diferencias significativas entre los tratamientos. Para el caso de L. acidophilus, el Cu₂SO₄ es el de mayor actividad con una media de CMI de 55 μg/mL, mientras que el mentol tuvo menor actividad con una media de CMI de 205.55 μg/mL. El análisis agrupó a la CMB en dos, uno con semejanzas entre las actividades del limoneno y el mentol y otro grupo con el geraniol y el Cu₂SO₄ (Figura 2). El estudio reveló también que la cepa L13 presenta diferencia significativa respecto a todas las demás con una media de CMI de 139.58 μg/mL, por lo que esta cepa es la más resistente a los tratamientos. Las cepas de S. mutans no presentaron diferencias significativas entre ellas, mientras que los tratamientos se agruparon en dos grupos, siendo nuevamente el mentol el de menor actividad y el Cu₂SO₄ el de mayor actividad (Figura 3).

Fuente: Elaboración propia.

Figura 2 Diferencias entre los tratamientos de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) entre los tratamientos evaluados contra L. acidophilus. Los superíndices corresponden a agrupaciones por similitud realizadas por un análisis de medias de Tukey (p < 0.05). 

Fuente: Elaboración propia.

Figura 3 Diferencias entre los tratamientos de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) entre los tratamientos evaluados contra S. mutans. Los superíndices corresponden a agrupaciones por similitud realizadas por un análisis de medias de Tukey (p < 0.05). 

La asociación de agentes antimicrobianos es ampliamente utilizada en la farmacéutica, con la finalidad de encontrar terapias que en sinergismo favorezcan y promuevan una mayor actividad bacteriostática-bactericida con una menor dosis. En el presente estudio se utilizó la técnica de tablero de ajedrez y el indicador de resazurina para determinar los efectos en la asociación del Cu₂SO₄ con las moléculas terpénicas. En este estudio se utilizaron las cepas L13 de L. acidophilus y la cepa S2 S. mutans, por presentar mayor resistencia a los compuestos antimicrobianos analizados. Los resultados demuestran que el Cu₂SO₄ a concentraciones de 100 μg/mL, 75 μg/mL, 50 μg/mL y 25 μg/mL tiene efectos sinérgicos en asociación con el geraniol a concentraciones de 50 μg/mL y 25 μg/mL contra ambas cepas (Tabla 2). Esta asociación (Cu₂SO₄/Geraniol) logra inhibir a L. acidophilus a una concentración de 18.36 μg/mL y a S. mutans a 48.33 μg/mL, concentraciones muy por debajo de la CMI de los compuestos por separado. La asociación del Cu₂SO₄ con los otros dos terpenos no presentó efectos sinérgicos.

Una vez demostrada la actividad antimicrobiana del Cu₂SO₄ y de los compuestos terpénicos se procedió a determinar las propiedades de inhibición de la formación de biopelícula sobre órganos dentales, evaluando la reducción del número de células viables (UFC). Este estudio se realizó únicamente sobre la cepa L13 de L. acidophilus, debido a que las cepas de S. mutans no fueron capaces de formar biopelícula. Debido a su baja actividad antimicrobiana, el mentol fue excluido del experimento. Se utilizó clorhexidina como control.

Las propiedades antibiopelícula del Cu₂SO₄, el geraniol y el limoneno, así como su asociación, fueron demostradas en el presente trabajo, teniendo reducción significativa en el número del conteo microbiano (Figura 4). El control (solución fisiológica) presentó 7.39 logUFC/mL; en comparación, el Cu₂SO₄ individualmente logró reducir un ciclo logarítmico y medio de crecimiento, presentando 5.88 logUFC/mL. El Cu₂SO₄ en asociación con geraniol presentó mayor actividad, reduciendo más de dos ciclos logarítmicos de crecimiento bacteriano, una reducción mayor que el geraniol por sí solo, demostrándose los efectos sinérgicos entre estos dos compuestos. El tratamiento control elegido fue la clorhexidina, siendo esta la de mayor actividad (4.55 logUFC/mL).

Fuente: Elaboración propia.

Figura 4 Diferencias entre los tratamientos sobre el conteo logarítmico de Unidades Formadoras de Colonias de L. acidophilus. Los superíndices corresponden a agrupaciones por similitud realizadas por un análisis de medias de Tukey (p < 0.05). 

Discusión

La caries dental es el resultado de un proceso infeccioso generalmente lento, iniciado por la concentración de agentes bacterianos (principalmente Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophilus) que se adhieren al diente gracias a una matriz constituida por proteínas salivares (placa bacteriana) (^{Hillson, 2001}; ^{Menéndez & Zela, 2017}). La caries dental es la enfermedad que padece aproximadamente 90% de la población en América Latina, siendo el principal problema de salud pública, respecto a enfermedades bucodentales (^{Flores-Tenechahua, Villavicencio-Caparó & Corral-Peñafiel, 2017}). Debido a su alta incidencia, la implementación de nuevos métodos para disminuir la prevalencia e incidencia de esta enfermedad son necesarios. Por otro lado, el uso indiscriminado de antibióticos ha generado alta resistencia bacteriana a los antibacterianos, por lo que es preciso tener alternativas preventivas y terapéuticas (^{Salazar, Medina, Donoso, Barrientos & Sanhuesa, 2009}).

En los últimos años se han realizado investigaciones científicas que han permitido documentar las propiedades antimicrobianas del cobre y fomentar su uso en la práctica médica (^{Prado, Vidal & Durán, 2012}).

Experimentos con cepas de Pseudomonas aeruginosa han mostrado un efecto sinérgico entre cationes de cobre (Cu²⁺) y desinfectantes de amonio cuaternario, para ejercer acción bactericida sobre este patógeno, que tiene especial habilidad para sobrevivir en ambientes con baja concentración de nutrientes y un mínimo de humedad, por lo cual coloniza con frecuencia a catéteres y diversos equipos médicos (^{Harrison et al., 2008}). Otros estudios han demostrado, utilizando los criterios exigidos por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés), que superficies de cobre o sus aleaciones son capaces de eliminar en horas 99.9% de bacterias patógenas (^{Faúndez, Troncoso, Navarrete & FIgueroa, 2004}; ^{Grass et al., 2011}). El cobre en forma de Cu₂SO₄ ha sido utilizado para evitar contaminación cruzada e infecciones intrahospitalarias (^{Espírito-Santo et al., 2010})

El presente estudio confirma que el cobre es un agente antimicrobiano eficaz y que es posible utilizarlo en forma de Cu₂SO₄ para el control y la eliminación de los microorganismos causantes de la caries, tal y como lo reporta ^{Foley & Blackwell (2003}). El intervalo encontrado en este estudio, entre la dosis bacteriostática y dosis bactericida, del Cu₂SO₄ es de 50 μg/mL a 500 μg/mL, respectivamente, y concuerda con lo reportado por ^{Afseth et al. (1984)}, quienes utilizaron 65 μg/mL de Cu en el agua potable y con ello redujo el desarrollo de caries en ratas.

La ingesta dietética de referencia 2001 para Cu para adultos de 19 años en adelante es de 0.9 mg/día (Trumpo et al., 2001). La ^{Organización Mundial de la Salud (1993)} ha establecido requisitos mínimos estimados para el Cu a 0.6 mg/día para las mujeres y 0.7 mg/día para los hombres. La dosis letal estimada de Cu en un adulto es de aproximadamente 10/20 g (^{Gaetke & Chow, 2003}). Debido a que la mayoría de los seres humanos y animales pueden controlar las cantidades excesivas de Cu en el cuerpo, ya sea por disminución de la absorción o aumento de la excreción, la toxicidad de Cu aguda y crónica es relativamente rara (^{Gaetke & Chow, 2003}).

Existen varios estudios que han demostrado los mecanismos de acción que puede ejercer el cobre sobre distintos microorganismos; en resumen, los cuatro mecanismos asociados al cobre son: (1) daño de la membrana bacteriana; (2) daño oxidativo por las especies reactivas de oxígeno (ROS); (3) inhibición de enzimas esenciales; y (4) degradación del ácido desoxirribonucleico (ADN) (^{Hans, Mathews, Mücklich & Solioz, 2016}).

Además de evaluar la actividad antimicrobiana del Cu₂SO₄ sobre cepas de Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophilus, el presente trabajo también evaluó la actividad de tres monoterpenos contra estos microorganismos. El geraniol, el limoneno y el mentol presentan diversas actividades antimicrobianas (^{Aperce et al., 2016}; ^{Martinelli et al., 2017}; ^{Umagiliyage, Becerra-Mora, Kohli, Fisher & Choudhary, 2017}) y sus características fisicoquímicas, específicamente las asociadas con su olor y sabor, son predilectas para su uso en asociación con agentes antimicrobianos como el Cu₂SO₄.

El mecanismo de acción de los compuestos terpénicos no se encuentra del todo descrito, y lo más probable es que su actividad antimicrobiana no sea debido a un modo de acción específico (^{Knezevic et al., 2016}). Los efectos tóxicos sobre la estructura y función de las membranas y paredes celulares generalmente se han usado para explicar la acción antimicrobiana de este tipo de compuestos. Algunos estudios han demostrado que los monoterpenos son capaces de interactuar con las membranas fosfolipídicas, de manera que los monoterpenos actúan como impurezas intersticiales en la estructura ordenada de la bicapa lipídica (^{Sharifi-Rad et al., 2017}; ^{Trombetta et al., 2005}), lo anterior como resultado de su carácter lipofílico, resultando preferencialmente atraídos a las estructuras de la membrana (^{Idris et al., 2017}; ^{Sikkema, De Bont & Poolman, 1994}; ¹⁹⁹⁵).

El atractivo principal de los aceites esenciales y de sus componentes para ser empleados como potenciales agentes farmacéuticos es la baja toxicidad hacia mamíferos. Algunos de los compuestos puros de aceites presentan una muy baja o nula toxicidad, con valores de toxicidad aguda oral en ratas de LD₅₀ de 2 g/kg -5 g/kg (anís, eucalipto, clavo, canela, etc.). Este último valor es el límite superior de toxicidad aguda requerido por la EPA (^{Isman, 2006}). Un estudio evaluó el potencial citotóxico y genotóxico de los monoterpenoides citral y geraniol sobre linfocitos humanos. Los resultados demostraron que estos compuestos inducen citotoxicidad y genotoxicidad a concentraciones mayores de 1000 µg/mL (^{Sinha et al., 2011}). Por otro lado, ^{Da Silva, Figueiredo & Yano (2007)} evaluaron la actividad citotóxica de los compuestos terpénicos mirceno, pineno y linalol. Sus resultados demostraron que los compuestos tienen actividad citotóxica a 600 µg/mL sobre macrófagos de ratón y células Vero.

Los resultados demuestran que el Cu₂SO₄ presenta mayor actividad bacteriostática y bactericida contra Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophilus que los terpenos evaluados (geraniol, limoneno, mentol) (Tabla 1). Sin embargo, en asociación, el Cu₂SO₄ presenta efectos sinérgicos con el geraniol, obteniendo concentraciones bacteriostáticas por debajo de las CMI de los compuestos puros.

Respecto a la actividad antiadherente, pueden observarse algunos datos interesantes. A pesar de que la actividad bacteriostática y bactericida del Cu₂SO₄ supera a la de los compuestos terpénicos, son estos últimos quienes poseen mayor actividad antiadherente (Figura 4). Los efectos sinérgicos en asociación Cu₂SO₄/Geraniol siguen observándose al evaluar las propiedades antiadherentes, este mismo efecto se observa en la actividad antiadherente en la asociación Cu₂SO₄/Limoneno, un efecto no detectado en los estudios in vitro por medio de la técnica de ajedrez.

Los efectos antibacteriano y antibiopelícula del geraniol han sido evaluados contra otros microorganismos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus o Candida albicans (^{Kannappan et al., 2018}; ^{Millezi, Piccoli, Oliveira & Pereira, 2016}; ^{Mirza, Hasan, Seidel & Yu, 2018}; ^{Singh, Fatima & Hameed, 2016}). Los efectos sinérgicos en la asociación entre el Cu₂SO₄ y los compuestos terpénicos puede deberse a la propiedad de los terpenos para acceder a espacios lipofílicos de la matriz de la biopelícula, efecto que posteriormente podría permitir el acceso del Cu₂SO₄ y ejercer su actividad antimicrobiana. Esta hipótesis podría dar respuesta a la baja actividad antibiopelícula del Cu₂SO₄ a pesar de su alta actividad antimicrobiana; sin embargo, deben realizarse estudios posteriores para demostrarlo.

Conclusiones

El sulfato de cobre presenta actividades antimicrobianas relevantes sobre microorganismos que han sido reconocidos como responsables del progreso de la caries. Así mismo, el presente estudio demuestra que su asociación con compuestos terpénicos representa una alternativa muy eficaz para el control de estos agentes etiológicos. Sin embargo, otros estudios deben ser realizados con la finalidad de determinar su absoluta biocompatibilidad en su uso como coadyuvantes en la higiene oral.