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INTRODUCCIÓN
La hidrogenación es el método más usado en la reducción de compuestos organicos para la obtención de diversos productos utilizados en varias industrias y procesos (Daly et al., 2014; Liu et al., 2013). Un ejemplo de esto es la hidrogenación selectiva de citral, el cual es la materia prima para la síntesis de iononas, vitaminas A y E. Los compuestos obtenidos de este proceso también son utlizados para la obtención de intermediarios en síntesis orgánica, en la industria química, en la producción de sabores, en la industria farmacéutica, de fragancias y perfumes (Lawrence, 2003; Rojas, Perea & Ortiz, 2009; Somolinos, 2009; Stolle, Gallert, Schmöger & Ondruschk, 2013). El citral, por ser un aldehído α, β-insaturado, presenta reacciones de hidrogenación con la formación de alcoholes insaturados como geraniol, nerol y citronelol (Figura 1). Para llevarlo a cabo, en la hidrogenación se han utilizado varios catalizadores con base en platino (Pt), iridio (Ir), oro (Au), entre otros (Bailón-García, Carrasco-Marín, Pérez-Cadenas, Maldonado-Hódar, 2014; Díaz et al., 2011; Liu et al., 2013; Rodríguez, De los Reyes, Viveros & Montoya, 2013; Rojas, Martínez, Mancípe, Borda & Reyes, 2012; Zhao, Xu, Li & Wang 2014), soportados en óxidos reducibles, como TiO2, CeO2 y Fe2O3 (Rojas, Borda & Valencia, 2005), que pueden proporcionar oxígeno en las reacciones de oxidación, óxidos mixtos, como Al2O3-SiO2 y CeO2-ZrO2 (Santiago-Pedro, Tamayo-Galván, Viveros-García, 2013; Rodríguez et al., 2013), además también se han buscado donadores de hidrogeno para llevar a cabo la reacción de hidrogenación (Liu et al., 2013).
Fuente: Anderson, Griffin, Johnston & Alsters (2003).
Figura 1 Esquema de reacción de hidrogenación de citral.
En estos sistemas se ha encontrado que la selectividad depende directamente del soporte utilizado, obteniéndose preferentemente citronelol en el caso de óxidos mixtos (Rodríguez et al., 2013) y la formación de alcoholes insaturados para los óxidos reducibles como TiO2, en ambos casos se obtuvo el 100% de hidrogenación de citral. La reducción catalizada con Au necesita formar una aleación con Pt e Ir para lograr la reducción total de citral (Díaz et al., 2011).
De igual forma, el citral ha sido utlizado inicialmente como sustrato y/o inhibidor en diferentes reacciones enzimáticas. Las enzimas obtenidas de aldehído dehidrogenasa (EC 1.2.1.3) se han usado para la síntesis irreversible por hidrólisis de ésteres y deshidrogenación de aldehídos, tales como la síntesis de ácido retinoico (Kikonyogo, Abriola, Dryjanski & Pietruszko, 1999). Demyttenaere, Herrera & De Kimpe (2000) estudiaron la biotransformación de nerol y geraniol junto con la de citral usando Aspergillus niger y Penicillium sp en diferentes medios, demostrando que el geraniol presenta los mejores resultados como inhibidor y sustrato. Linalool fue obtenido por biotransformación de citral con los dos hongos, mientras que α-terpineol y limoneno fueron obtenidos por la acción de A. niger. En cambio, el uso de enoato reductasa guío la formación de citronelol, citronelal y geraniol/nerol, teniendo mayor rendimiento los dos primeros (Hall, Hauer, Stuermer, Kroutila & Fabera, 2006; Stolle et al., 2013). Tambien es posible conseguir citronelal a partir de la biotransformación de citral usando Zymomonas mobilis y Citribacter freundii en presencia de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (NADPH) y tolueno. Además, se ha estudiado el efecto que tiene la combinación de agua con diferentes solventes, observándose que con Z. mobilis se tiene una enantioselectividad (e.e.) del 99%, dado que la producción de alcoholes fue suprimida en presencia de solventes organicos, mientras que con C. freundii se obtuvo una e.e. del 75% en la formación de citronelal (Müller, Hauer & Rosche, 2006; Stolle et al., 2013). En otro estudio se identificó una de las enzimas que está implicada en la hidrogenación de citral que es la “vieja enzima amarrilla” (OYE), de Gluconobacter oxydans, reductasa dependiente del mononucleótido de flavina, capaz de reducir esteroselectivamente el doble encale C = C α-β de citral (Yin, Yang, Wei, Ma & Wei, 2008), con la que se obtuvieron buenos rendimeintos de geraniol y citronelal. También se ha empleado la β-D-glucosidasa (Gamero, Manzanares, Querol & Bellosch, 2011) para la síntesis de monoterpenos desde la hidrogenación de citral y la biotransformación de sus derivados, consiguiendo buenos rendimientos. La cloroperoxidasa obtenida de Caldariomyces fumago es capaz de biotransformar terpenos, teniendo gran actividad y selectividad con limoneno como sustrato (Arias, Stashenko & Torre, 2007;Ladero, Santos, García-Ochoa, 2000). Esta enzima reúne las características deseadas para ser el biocatalizador de la reducción del citral, sin embargo, debido a su difícil obtención de fuentes naturales se ha intentado utilizar otras enzimas que no presenten este inconveniente, entre las cuales están la xilanasa (Bailey, Bieley & Poutanen, 1992; Polizeli, Rizzatti, Monti, Terenzi, Jorge & Amorim, 2005). Asimismo, se han logrado altos rendimientos de formación de citronelal usando células libres e inmovilizadas de S. cerevisiae (Esmaeili, Rohany & Safaiyan, 2012), encontrando mejores rendimientos con células inmovilizadas a pH de 5.5 ºC y 27 °C. Endo- β -1,4-xilanasas (EC 3.2.1.8) provenientes de Trichoderma reesei son utilizadas en la hidrolisis de xilano y compuestos aromáticos (Hung, Peng, Tzen, Chen & Liu, 2008; Knob, Terrasan & Carmona, 2010; Nagar, Gupta, Kumar, Kumar & Kuhad, 2010), presentando buena estabilidad al ser inmovilizadas en perlas de alginato de sodio y Al2O3 (Nagar et al., 2010).
Debido a la forma de hidrogenar el sustrato, en este trabajo se pretende estudiar la actividad de la xilanasa inmovilizada en perlas de alginato de sodio en la hidrogenación de citral en fase líquida, además de conocer el efecto que tiene el pH y la concentración de H2O2 en su actividad biocatalítica. En tanto el H2O2 es la fuente de hidrógeno de la enzima para llevar a cabo la reducción de citral, la importancia de su cuantificación radica en conocer cuánto se está consumiendo en la reacción, ya que al mismo tiempo se llevan a cabo reacciones paralelas como la oxidación de alcoholes (nerol y geraniol).
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Endo-1, 4 β-xilanasa (Trichoderma longibrachiatum, EC 3.2.1.8, 650 mUI/mL), citral, nerol, geraniol, citronelal y citronelol y todos los demás compuestos fueron obtenidos de Sigma-Aldrich Co.
Preparación y activación de perlas de alginato de sodio
La formación de las perlas de alginato de sodio con un diámetro de 3 mm se llevó a cabo mediante la metodología propuesta por Pal & Khanum (2011), disolviendo 2 g de alginato de sodio en 100 mL de agua desionizada caliente hasta su completa solubilización; posteriormente se dejó caer muy lento gota a gota la solución de alginato en CaCl2 0.2 M a 4 °C. A continuación, las perlas fueron almacenadas por 24 h en CaCl2 0.02 M a 4 °C para provocar su endurecimiento; después, las perlas fueron filtradas para retirar el CaCl2, y adicionalmente se realizaron lavados con agua desionizada 10 veces el volumen de CaCl2 utilizado. En seguida, para lograr que las perlas fueran activadas, éstas fueron añadidas a una solución de glutaraldehído 9% (p/v) y buffer citrato a pH de 5 (0.05 M), manteniendo en agitación por 90 min. Finalmente, las perlas fueron almacenadas en el glutaraldehído con buffer citrato a 4 °C por 24 h.
Inmovilización de xilanasa
Las perlas almacenadas en glutaraldehído con buffer citrato a 4 °C se filtraron y lavaron con agua desionizada, inmediatamente después fueron colocadas en una solución de xilanasa con concentración de 650 mUI/mL, y se mantuvieron con agitación vigorosa por 1.5 h a temperatura ambiente. Finalmente, las perlas de alginato con la enzima inmovilizada se almacenaron a 4 °C, hasta su uso.
Actividad biocatalítica de la enzima y cuantificación de citral consumido
Las perlas de alginato de sodio con la xilanasa inmolvilizada se colocaron en buffer fosfato (0.1 M) al pH deseado (5.8 - 8.5), después se añadió solución de citral (2.2 mM) y se adicionarón 300 μL de H2O2 a diferentes concentraciones cada 1.5 h, dando inicio a la reacción enzimática a 25 °C y 150 rpm, para lo cual se utilizó un shaker (ZHCHENE, modelo ZHWY-200D). La reacción fue monitoreada por 24 h, tomando muestras cada 1.5 h. Para la cuantificación del consumo de citral durante el tiempo de reacción se construyó una curva de calibración, a 265 nm, máxima banda de absorción de citral (Ospina, Adames & Mendoza, 1983), la cual se ajustó al modelo de Lambert-Beer, usando un factor de dilución de 0.11. Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro de UV-Vis (Jenway, modelo 6715); adicionalmente a cada una de las muestras se les determinó la absorbancia a longitudes de onda de 205 nm, 220 nm, 280 nm y 295 nm reportadas por Ospina et al. (1983) para monitorear de forma cualitativa la formación de productos de hidrogenación de citral. La constante de Michaelis-Menten (Km) y la velocidad máxima (Vmax) de la enzima inmovilizada fueron calculadas usando la linealización propuesta por Lineweaver & Burke (1934) para los diferentes pH.
Cuantificación del consumo de H2O2
Se preparó una solución de 0.1 M de Permanganato de potasio (KMnO4) y se calentó hasta ebullición. De soluciones problema de agua oxigenada en concentraciones 1 mM y 2 mM, se tomaron alícuotas de 0.25 mL, y se transfirieron a matraz volumétrico de 5 mL, diluyendo con agua desionizada hasta el aforo. Posteriormente, de cada muestra se transfieron 1.25 mL hacia un vaso de precipitado de 10 mL, a continuación se agregó 0.15 mL de H2SO4 6 M y 1.25 mL de agua desionizada. La solución se calentó a 60 °C y se valoró. La titulación volumétrica de la muestra de H2O2 con la solución estándar de permanganato duró hasta la aparición de un color rosado permanente (Sant, 1956).
Cromatografía de capa fina
La separación preparativa de los productos de reacción utilizando cromatografía de capa fina (Thin Layer Chromatography [TLC, por sus siglas en inglés]), se realizó en placas con fase estacionaria de gel de sílice con indicador de fluorescencia UV254 de 0.25 mm de espesor (Merck AG, Darmstadt, Alemania), con dimensiones de 5 cm × 10 cm, previamente activadas a 40 °C durante 1 h. La fase móvil utilizada fue agua:acetonitrilo (50/50, v/v). Todos los reactivos usados fueron grado HPLC. Alicuotas de 50 μL de muestras y estándares fueron aplicados en diferentes carriles de la placa. Previamente a la elución de las placas, la cámara se saturó durante 15 min con la fase móvil. Una vez eluidas las muestras, las placas fueron expuestas a temperatura ambiente hasta la completa evaporación del solvente; posteriormente fueron expuestas y observadas bajo luz ultravioleta, detectando el recorrido de las muestras mediantes fluorescencia azul; el factor de retención (Rf) se calculó con la relación:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La hidrogenación de citral por acción catalítica de la enzima se determinó para los tres valores de pH y las cuatro concentraciones de H2O2, mediante el uso de curvas de calibración de citral (Figura 2) y sus derivados. En la Figura 3 se puede observar que a pH de 5.88 (Figura 3a) se tiene prácticamente el 100% de conversión de citral a 15 h de reacción. De forma similar a pH de 6.65 (Figura 3b) se observa que la reducción del citral es mayor al 90% a las 6 h de reacción, no obstante, a las 13 h de reacción se aprecia un aumento en la concentración de citral, esto puede deberse a que los productos obtenidos reaccionan con el H2O2 presente en la solución, provocando que la hidrogenación de citral sea reversible bajo estas condiciones.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 3 Efecto de pH en la hidrogenación de citral. a) 5.88, b) 6.65 y c) 8.46.
Por otro lado, a pH de 8.46 (Figura 3c) se advierte que la máxima transformación que se obtiene del citral es del 76%. Ello implica que en estas condiciones la actividad catalítica de la enzima no sea buena, en contraste con los rendimientos obtenidos a pH bajos. Con base en estos resultados, se infiere que las mejores condiciones de operación son a pH 5.88, 25 °C, agitación de 150 rpm. La reducción de citral se lleva a cabo a partir del hidrógeno que la xilanasa obtiene del medio, ya que la enzima une su sitio activo con el citral para llevar a cabo el rompimiento del doble enlace C = C y así formar nerol y geraniol. Por otro lado, se observa que la concentración de H2O2 no afecta significativamente la actividad enzimática de la xilanasa en la hidrogenación de citral sin importar el pH de la solución (Figura 4), pues se advierte el mismo patrón de hidrogenación del citral en las reacciones con concentración de H2O2 1 mM y 2 mM, lo que concuerda con los resultados logrados por Esmaeili et al. (2012), quienes utilizando S. ceriveseae bajo condiciones similares en la biotransformación de citral obtuvieron el mismo porcentaje de conversión. La temperatura de operación de este sistema es benéfica, en comparación con la utilizada para la hidrogenación selectiva de citral en fase líquida sobre catalizadores Ir-Fe/TiO2 reducidos a alta temperatura (Rojas et al., 2005), donde es necesario llevar dicho parámetro a 500 °C, lo que genera un mayor consumo de energía incrementando los costos de operación. Además, con el uso de catalizadores con base de Pt (Rodríguez et al., 2013) se obtiene una actividad catalítica similar en un mayor tiempo, pero en condiciones de reacción muestran que el uso de enzimas proveerían un mejor sistema catalítico, al no tener que usar altas temperaruras y presión de H2 en el sistema.
a) [H2O2] = 1 mM y b) [H2O2] = 2 mM.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 4 Efecto del pH en la hidrogenación de citral usando xilanasa inmovilizada,
La cuantificación de los derivados de la hidrogenación de citral durante el tiempo de reacción demostró que nerol disminuye conforme transcurre la reacción, lo que sugiere que a pH 5.88 y pH 6.65, este compuesto sigue siendo hidrogenado, de tal manera que se pueden forman otros compuestos como citronelal o citronelol, debido a que la enzima reacciona con el H2O2. Por otra parte, a pH de 8.46 se percibió que la transformación de citral en nerol presenta una disminución en la velocidad de reacción a estas condiciones de reacción. En el caso de geraniol en los diferentes valores de pH manejados, se puede observar un comportamiento análogo al nerol, presentando a pH 5.88 y pH 6.65 consumo de dicho compuesto de 50% y 37%, respectivamente, mientras que a pH de 8.46 se tuvo una conversión del 70%. Como se mencionó anteriormente, la concentración de H2O2 no fue significativa para la hidrogenación de citral al igual que para la conversión de nerol y geraniol. Con el uso de catalizadores de Ir-Fe2/TiO2 (Rojas et al., 2005), en la hidrogenación de citral, sólo se observaron geraniol y nerol como productos de reacción, lo que corresponde a la hidrogenación selectiva del grupo carbonilo con altos rendimientos. En contraste con la biotransformación de citral con S. cerevisiae (Esmeaili et al., 2012), los productos conseguidos fueron limoneno, geraniol y citronelol, 4-hidroxi-4-metil-2-pentanona y citronelol. Por otro lado, los rendimientos que se observan con el uso de la xilanasa inmovilizada son comparables con los obtenidos en la biotransformación con S. cerevisiae.
En cuanto a la estabilidad de las perlas de alginato con xilanasa inmovilizada, se observa que a pH de 8.46 las perlas pierden su estabilidad a las 5 h de la reacción, mientras que a pH de 6.66, con el paso del tiempo las perlas se hidrataron, y aproximadamente después de 6 h perdieron su estructura. Por su parte, las perlas mantenidas a pH de 5.88 mantuvieron su estructura y forma inicial, aun después de las 24 h de la reacción.
Para la determinación del consumo de H2O2 se utilizó la técnica de permanganometría; los resultados se concentran en la Tabla 1, donde se muestra que el consumo de peróxido fue superior al 99% en todos los experimentos. En promedio, el consumo de H2O2 fue de 99.63% para 1 mM y 99.64% para 2 mM. Con base en los parámetros cinéticos obtenidos para la enzima inmovilizada para las diferentes condiciones de reacción (Figura 5), se puede inferir que a pH de 5.88 la velocidad máxima de reacción es mayor comparada con las velocidades alcanzadas en los otros valores de pH; no obstante, a pH de 6.65 el sustrato es más afín a la enzima. En el caso de pH de 8.46, no se pudieron determinar los parámetros debido a que las perlas de alginato se disolvieron y los datos no puedieron ser tratados con ningún método de linealización. Los valores de Vmax y KM se concentran en la Tabla 2. El modelo utilizado para encontrar los parámetros de la reacción enzimática se basa en la ecuación de Michaellis-Menten. Vmax es la velocidad máxima de reacción en condiciones de saturacion y KM indica la afinidad que tiene la xilanasa por el sustrato (citral). Si el coeficiente de determinación (r2) es muy cercano a 1 (alrededor del 0.99), se puede asumir que los datos experimentales de la curva de calibración se ajustan al modelo de la línea recta.
Fuente: Elaboración propia.
Figura 5 Determinación de parámetros cinéticos xilanasa en la hidrogenación de citral. a) pH = 5.88 y b) pH = 6.65.
Tabla 2 Parámetros cinéticos de xilanasa inmovilizada en la hidrogenación de citral.
Fuente: Elaboración propia.
En el análisis estadístico por bloques, las variables utilizadas fueron pH y concentración de peróxido de hidrógeno, teniendo un modelo con un 96.28% de confianza. El valor negativo del coeficiente del pH indica que sea cual sea el valor de pH, se espera que disminuya en 0.0389 el valor de la concentración consumida de citral durante la hidrogenación.
Modelo matemático:
En cuanto a la actividad catalítica, se demostró que la concentración de peróxido de hidrógeno no tiene relevancia en el experimento; caso contrario del pH, el cual a menor pH mayor es su actividad catalítica, y con el análisis estadístico realizado se comprueba que el pH es la variable que tiene mayor relevancia en la hidrogenación de citral.
CONCLUSIÓN
El estudio realizado para la hidrogenación de citral, utilizando xilanasa de T. longibrachiatum inmovilizada en perlas de alginato, arroja buenos resultados, ya que durante la experimentación se lograron establecer las mejores condiciones de reacción a pH de 5.88 para la biotransformación de 98% de citral; el valor obtenido es cercano al establecido para catalizadores heterogéneos y S. cerevisae. En cuanto al consumo de dicho compuesto, la influencia que se tiene con respecto a la concentración de H2O2 no es significativa; por otro lado, al aumentar el pH la actividad catalítica de la enzima disminuye significativamente, aunque a pH mayor a 7.0 se evidenció la degradación de las perlas de alginato. Por medio de la permanganometría se obtuvo que independientemente de la concentración de H2O2, el consumo de este agente hidrogenante es de más del 99%, lo que indica que nerol y geraniol se siguen transformando en los productos secundarios de la hidrogenación de citral como nerol y geraniol.
