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INTRODUCCIÓN
Actualmente hay una necesidad inaplazable de desarrollar estrategias para mitigar las emisiones de metano entérico emitidas por rumiantes. En este contexto, a nivel mundial los gases de efecto invernadero (GEI) derivados de la producción ganadera representan ~14.5 % del total de emisiones antropogénicas (Gerber et al. 2013). El metano es uno de los GEI con mayor impacto ambiental de este sector (Grossi et al. 2019, Saunois et al. 2020). En México, de acuerdo con el Inventario Nacional de Emisiones de Gases y Compuestos de Efecto Invernadero (INECC 2018), las emisiones de CH4 por fermentación entérica de bovinos, ovinos y caprinos fueron de 81 330.93 Gg de CO2e. Esto representa el 80 % del metano total generado en la categoría agricultura, silvicultura y otros usos de la tierra de este inventario.
Consecuentemente, se han evaluado algunos compuestos e inhibidores enzimáticos de la metanogénesis ruminal, entre los que destacan: i) análogos de la coenzima M: ácido bromoetano sulfónico (BES), 2-cloroetanosulfonato y 3-bromopropanosulfonato (Liu et al. 2011); ii) inhibidores de la hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa: lovastatina (LOV) y mevastatina (Miller y Wollin 2001); iii) inhibidores de bacterias productoras de hidrógeno: ionóforos y bacteriocinas (Patra et al. 2017).
Se ha reportado que el BES es un potente inhibidor de arqueas metanogénicas. No obstante, algunos metanógenos en cultivo puro (M. mazei y M. mobile) pueden resistir diferentes dosis de BES (Ungerfeld et al. 2004). La monensina (MON) es uno de los ionóforos más comunes en la producción de bovinos; entre sus ventajas se encuentra generalmente un aumento en la proporción molar de propionato relacionado con la mitigación de metano ruminal (Bagheri et al. 2018). Sin embargo, los riesgos por resistencia cruzada de este tipo de ionóforos no se han determinado por completo (Wong 2019).
Por otra parte, se ha demostrado que la LOV tiene efecto antimetanogénico específico sobre cultivos puros de metanógenos del rumen y del sistema digestivo de seres humanos (Miller y Wollin 2001, Demonfort-Nkamga et al. 2017). Sin embargo, los resultados de fermentaciones in vitro con LOV pura, fluido ruminal (consorcios microbianos) y dietas para rumiantes (sustratos complejos) son escasos; además, no existe un criterio general sobre la mitigación de metano asociada a este inhibidor (Busquet et al. 2005, Soliva et al. 2011, O’Brien et al. 2013).
Una limitante de la LOV en la alimentación de rumiantes es su costo: 7.5 USD/g grado industrial (Sigma-Aldrich, Toluca, México) (Mulder et al. 2015). Se han evaluado alternativas económicas para producir LOV; al respecto, la fermentación en estado sólido (FES) con hongos filamentosos es uno de los bioprocesos más promisorios. Una ventaja de este proceso aplicado a la nutrición animal radica en los sustratos (esquilmos agrícolas) de la FES, los cuales una vez fermentados pueden utilizarse como portadores de LOV y posteriormente incorporarse a las raciones para rumiantes como suplementos antimetanogénicos (Jahromi et al. 2013, Morgavi et al. 2013, Ábrego-García et al. 2021a). El enfoque de los residuos agrícolas postfermentados como portadores de LOV puede reducir considerablemente los costos de insumos externos en los sistemas de producción pecuaria, especialmente los asociados a la LOV de grado industrial. Otra ventaja de este enfoque se relaciona con el ahorro del proceso de extracción y purificación ulterior de la LOV (Chen et al. 2014). Asimismo, desde el punto de vista ambiental, se evitan emisiones de solventes al ambiente (Clarke et al. 2018).
No obstante, debe considerarse que estos rastrojos fermentados portadores de LOV contienen además una gran diversidad de metabolitos secundarios sintetizados por los hongos durante la FES (Rustamova et al. 2020). Por lo tanto, se debe comprobar que el efecto antimetanogénico de los residuos agrícolas postfermentados corresponda de forma predominante a la LOV y no exprese sinergias con otros metabolitos de la FES (Ábrego-García et al. 2021b).
El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la LOV sobre la mitigación de metano y otras variables de fermentación ruminal in vitro de una dieta alta en grano, característica de un sistema de bovinos productores de carne. A su vez, se comparó el efecto de la LOV frente a inhibidores metanogénicos como la MON y el BES.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
Se realizó una prueba de fermentación ruminal in vitro en lote. Se utilizó una dieta alta en grano, fluido ruminal de bovinos y tres compuestos antimetanogénicos. Se empleó un diseño completamente al azar con tres tratamientos (mg/L): LOV (300); MON (20); BES (6), y un (T). Cada tratamiento se realizó por triplicado. Las variables de respuesta (producción de gas total y CH4) se muestrearon a las 12, 24, 36 y 48 h. La concentración de ácidos grasos volátiles (AGV) se muestreó a las 48 h.
Hidrólisis y determinación de la estructura β-hidroxiácido de la lovastatina
La LOV se adquirió en forma de lactona inactiva (LA) de Fermic (Ciudad de México). Se hidrolizó a su forma β-hidroxiácido activa (HI) en una solución de NaOH-EtOH (15 % [v/v] etanol; 0.25 % [p/v] NaOH); después se incubó a 55 ºC por 1 h, se ajustó el pH a 7.2 con HCL 0.1 N (Lorenz y Parks 1990) y se filtró con acrodiscos de 0.45 μm (Millipore, MA, EUA).
Posteriormente se determinó la concentración de LOV en forma HI por HPLC-UV (Varian Analytical Instruments, Modelo 9010, CA, EUA) de acuerdo con Yang y Hwang (2006)). Se utilizó una columna Gemini 5U C18 (Phenomenex, CA, EUA) y como fase móvil acetonitrilo: H2O (70:30 v/v) acidificada con H3PO4 al 0.1 % (flujo de 0.5 mL/min). La longitud de onda fue de 235 nm y el volumen de inyección de 50 μL. El estándar LOV-LA se obtuvo de Sigma-Aldrich (Toluca, México). La forma LOV-HI se obtuvo de la hidrólisis de la LOV-LA (Lorenz y Parks 1990, Patil et al. 2015).
Producción de gas in vitro
El experimento se realizó en el Laboratorio 33 del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV-IPN (Ciudad de México) en julio de 2018. Se usaron frascos serológicos de 120 mL como digestores. Se les adicionaron 0.5 g de una dieta para bovinos (tamaño de partícula, 1 mm), la cual contenía respecto a materia seca: maíz molido, 56.6 %; soya, 12 %; urea, 1 %; mezcla mineral, 2 %; y rastrojo de avena, 28.4 %. Después se les añadieron 30 mL de una solución amortiguadora mineral (Menke et al. 1979), se ajustó el pH del medio a 6.8 y fueron esterilizados en autoclave durante 15 min a 121 ºC y 15 psi. Posteriormente se agregaron los siguientes tratamientos: T (sin inhibidor metanogénico); LOV, 300 mg/L (0.74 mmol/L); BES, 20 mg/L (0.105 mmol/L); y MON, 6 mg/L (0.0089 mmol/L). El BES y la MON (pureza 99.0 %+) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Toluca, México) y se diluyeron en agua destilada estéril. Todos los tratamientos se aplicaron en un volumen de 1 % (v/v) del medio de cultivo. Finalmente, las botellas fueron purgadas con CO2 y conservadas a -4 ºC.
El inóculo de fluido ruminal se obtuvo de tres novillos fistulados y canulados del rumen (Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México) bajo la norma de cuidado animal NOM-062-ZOO (SAGARPA 2001). Los novillos fueron alimentados con una dieta que contenía 40 % de concentrado y 60 % de forraje. El fluido ruminal se extrajo 2 h después de alimentar a los animales y se transportó inmediatamente al laboratorio en termos (2 L) precalentados a 39 ºC.
Finalmente, se inocularon 15 mL del fluido ruminal filtrado con cuatro capas de manta de cielo en las botellas serológicas previamente cargadas con la dieta, solución amortiguadora mineral e inhibidores metanogénicos, las cuales fueron incubadas a 39 ºC con agitación de 90 rpm por 48 h. Se usó un blanco por triplicado para ajustar la producción total de gas, el cual contenía 30 mL de la solución amortiguadora mineral + 15 mL del fluido ruminal.
Cuantificación de gas total y metano
Para estimar la producción de gas total, cada botella serológica fue conectada con manguera tygon a un medidor de gas por desplazamiento de salmuera (Muñoz-Páez et al. 2014). La producción de gas total del blanco fue usada para calcular el rendimiento de gas en cada tratamiento (producción de gas = acumulación de gas en cada tiempo de muestreo - promedio del blanco).
El volumen de gas se calculó con la ley de los gases ideales (Castellan 1987) a partir de los datos de presión y temperatura de las muestras. Los volúmenes de gas total y metano se normalizaron (SmL) a presión y temperatura de 101.32 kPa y 298 K, respectivamente (Ábrego-García et al. 2021a).
La producción de metano se cuantificó antes de medir la producción de gas total; se muestreó 1 mL del espacio gaseoso de cada digestor con una jeringa de muestras gaseosas y se inyectó en un cromatógrafo (Gow-Mac, Model 350, PA, EUA) equipado con un detector de conductividad térmica. Se utilizó una columna empacada de gel de sílice de 60/80 de diámetro. La temperatura del inyector, columna y detector fueron 37, 70 y 100 ºC, respectivamente. Se usó argón como gas acarreador. El estándar de CH4 y el Ar fueron de grado cromatográfico (> 99.9 %, INFRA, Ciudad de México).
Determinación de ácidos grasos volátiles
Las muestras se prepararon de acuerdo a Cottyn y Boucque (1968). Brevemente, en un tubo Eppendorf (1.5 mL) se depositaron 250 µL de ácido metafosfórico (25 % p/v) y 750 µL del fluido de las botellas serológicas. Después, los tubos fueron centrifugados a 6000 × g durante 15 min. Se recuperaron 600 µL de sobrenadante en viales para cromatografía de 1 mL (Perkin Elmer, EUA). Se utilizó un cromatógrafo de gases modelo Auto System (Perkin Elmer, EUA) equipado con detector de ionización de flama (FID) y una columna capilar (ZB-FFAP, Phenomenex, EUA). La temperatura del detector fue de 250 ºC y la del inyector de 230 ºC. Se utilizó N2 como gas acarreador a un flujo de 9 psi. La temperatura del horno se programó a 70 ºC/2 min, con un incrementó de 140 ºC y una rampa de 5 ºC/min. Posteriormente, la temperatura se mantuvo constante a 200 ºC/6 min (Muñoz-Páez et al. 2014). Las concentraciones de AGV en las muestras se compararon con la curva de calibración de los estándares del ácido acético, propiónico y butírico (Sigma-Aldrich, Toluca, México).
Análisis estadístico
Las variables de respuesta producción de gas total, metano y AGV fueron analizadas mediante análisis de varianza. Para ello se usó un diseño completamente al azar con el siguiente modelo:
donde Y ij es la variable de respuesta en la j-ésima repetición (botella serológica) del i-ésimo tratamiento; μ es la media general de todos los datos del experimento; T i es el efecto del tratamiento i; y ε ij es el error experimental asociado al sujeto j bajo el tratamiento i.
Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS Studio v. 3.8 (SAS 2018). Las medias se compararon con la prueba de la mínima diferencia significativa (Steel et al. 1997).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El análisis de cromatografía liquida (HPLC) permitió determinar que la LOV inicialmente contenía 96.0 % en forma de LA (Fig. 1a) y después de su hidrólisis alcalina (Fig. 1b) se generó un 58.8 % de forma HI. Con base en lo anterior, el tratamiento con LOV 300 mg/L equivaldría a 176.5 mg/L en forma HI. Así, este trabajo reporta por primera vez la hidrólisis y cuantificación de la forma β-hidroxiácido de LOV pura como tratamiento antimetanógenico in vitro. Los resultados anteriores son congruentes con los de Beltrán et al. (2019), quienes hidrolizaron LOV pura en NaOH (0.1 M), pH 12.5 a 37 ºC, obteniendo una conversión a la forma HI de aproximadamente 50 % antes de las 12 h.
Fig. 1 Análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por su sigla en inglés) de la lovastatina (LOV) (a) sin hidrolizar y (b) hidrolizada. Los picos representan: L: LOV-LA (lactona inactiva); H: LOV-HI (β-hidroxiácido activa).
La figura 2 muestra la producción de gas total con los tratamientos LOV, BES, MON y T a las 12, 24, 36 y 48 h de incubación. Al tiempo 12 h, los tratamientos LOV y CON tuvieron un comportamiento similar, pero a partir de las 24 h, el primero presentó una disminución sobre la producción de gas que mantuvo hasta el término del muestreo. Los tratamientos MON y BES presentaron una disminución sobre la producción de gas a partir de las 12 h, tendencia que se mantuvo hasta las 48 h de incubación.
Fig. 2 Producción total de gas in vitro de una dieta alta en grano para bovinos de carne. □ testigo; Δ ácido bromoetano sulfónico (20 mg/L); ○ monensina (6 mg/L); ◊ lovastatina (300 mg/L).
Como se observa en la figura 3, los tres tratamientos tuvieron efectos antimetanogénicos a partir de las 12 h de incubación. El BES y el MON alcanzaron la mayor inhibición de metano entre las 24 y 36 h de incubación mientras que el LOV la obtuvo a las 12 h.
Fig. 3 Producción de metano ruminal in vitro de una dieta alta en grano para bovinos de carne. □ testigo; Δ ácido bromoetano sulfónico (20 mg/L); ○ monensina (6 mg/L); ◊ lovastatina (300 mg/L).
Ésta es la primera vez que se reporta la cinética de producción de gas total y metano in vitro asociada al efecto antimetanogénico de la LOV pura. En este sentido, únicamente se había reportado la producción in vitro de gas total o metano acumulado al tiempo final de incubación (Busquet et al. 2005, Soliva et al. 2011, O’Brien et al. 2013).
Los variables de fermentación in vitro evaluadas al tiempo final de muestreo (48 h) se presentan en el cuadro I. La producción de gas total fue significativamente menor en todos los tratamientos con relación al testigo. La inhibición de metano con LOV y MON fue de 43.56 y 53.54 %, respectivamente (p < 0.05). El BES demostró el mejor efecto antimetanogénico con aproximadamente 61.66 %.
Al respecto, Busquet et al. (2005)) y O’Brien et al. (2013)) evaluaron LOV pura con dosis de 5 y 3 mg/L. Ambos ensayos se realizaron con una dieta relación forraje a concentrado (f:c) de 50:50 y fluido ruminal de bovinos como inóculo. Los resultados de estos trabajos no mostraron efectos significativos sobre la mitigación de metano, lo cual probablemente se deba a que las dosis de LOV evaluadas (basadas en el trabajo pionero de Miller y Wollin [2001]) fueron muy bajas (< 5 mg/L). Sin embargo, dicho trabajo se realizó con cepas puras de metanógenos en medio líquido, lo que sugiere inicialmente efectos de la concentración de sólidos (dieta experimental y fluido ruminal) en el medio de cultivo asociados a las dosis de LOV. Lo anterior coincide con el trabajo de Soliva et al. (2011), quienes reportaron una disminución de metano ruminal de ~40 % con una dosis de LOV 30 veces mayor a los trabajos anteriores (150 mg/L). Estos investigadores utilizaron la técnica de simulación de rumen (rumen simulation technique, RUSITEC), fluido ruminal de bovinos y una dieta con relación f:c de 50:50.
Otro factor importante en la mitigación de metano en fermentaciones ruminales in vitro con LOV se relaciona con la forma química de este inhibidor. Normalmente, la LOV se comercializa en su forma estable y no activa (LA), es decir, no tiene la estructura conformacional necesaria para ser el inhibidor competitivo de la enzima HMG-CoA reductasa (Hubert et al. 2018).
Existen algunas técnicas para hidrolizar la LOV a su forma activa (HI) (Klingelhöfer y Morlock 2019); sin embargo, los experimentos a corto plazo no reportan la estimación de la dosis antimetanogénica en su forma HI (Busquet et al. 2005, Soliva et al. 2011, O’Brien et al. 2013). Además de la hidrólisis química, la microbiota presente en el intestino de seres humanos puede catalizar la conversión de LOV-LA a su forma HI (Demonfort-Nkamga et al. 2017). Del mismo modo, este proceso puede ocurrir en agua después de dos días de incubación a pH 7 y 37 ºC (Beltrán et al. 2019). Lo anterior puede ser clave para establecer los efectos de la LOV sobre fermentaciones in vitro a corto plazo.
De esta manera, los resultados satisfactorios de Soliva et al. (2011)) obtenidos en experimentos de inhibición de la metanogénesis ruminal con LOV pudieran estar influidos por la hidrólisis de este compuesto, dado que su incubación fue a largo plazo (10 días), lo cual es congruente con la hidrólisis microbiana o química descrita anteriormente.
Los resultados de los tratamientos MON y BES en el presente estudio se comparan favorablemente con investigaciones previas. Primero, Capelari y Powers (2017) evaluaron el efecto de la MON (6 mg/L) sobre la fermentación in vitro, una dieta con relación f:c de 10:90 y fluido ruminal de bovinos. Los resultados demostraron que la producción de gas disminuyó a las 24 y 48 h de muestreo mientras que la producción de metano disminuyó significativamente en todos los tiempos de muestreo (4, 8, 12, 24 y 48 h). Asimismo, Lee et al. (2009) evaluaron el efecto del BES (10.5 mg/L) sobre la fermentación in vitro de una dieta con relación f:c de 60:40 y fluido ruminal de bovinos, lo cual disminuyó significativamente la producción de gas. Resulta interesante destacar que la mitigación de metano asociado al BES fue mayor a 95 % en todos los tiempos de muestreo (24, 48 y 72 h).
El 3-nitrooxipropanol es un compuesto relativamente nuevo que ha tenido buena aceptación en materia de mitigación de metano ruminal (Jayanegara et al. 2018, Zhang et al. 2018). Se ha reportado que este compuesto a dosis de 200 y 160 mg/kg (materia seca) inhibió en 78 y 40 % la producción de metano ruminal de dietas altas en grano usando el sistema RUSITEC (Romero-Pérez et al. 2017, Schilde et al. 2021). Esto sugiere que la LOV puede mantener un nivel cercano a inhibidores de la metanogénesis introducidos más recientemente, como es el caso del 3-nitrooxipropanol.
La producción de AGV del tratamiento LOV no mostró diferencias significativas en comparación con el testigo (Cuadro I), de manera similar a las proporciones molares de acetato, propionato y butirato. Estos resultados coinciden con los reportados por Soliva et al. (2011), quienes demostraron que cuando la LOV inhibió (p < 0.05) la producción de metano in vitro, la concentración total de AGV disminuyó ligeramente y no se afectaron las proporciones de acetato y butirato, aunque se observó una disminución de propionato.
CUADRO I EFECTO DE LA LOVASTATINA, LA MONENSINA SÓDICA Y EL ÁCIDO BROMOETANO SULFÓNICO SOBRE LA FERMENTACIÓN RUMINAL IN VITRO.
| Variable | Tratamiento | EEM | Valor P | |||
| T | LOV | MON | BES | |||
| Gas total (SmL) | 116.50a | 99.57b | 87.28bc | 80.54c | 7.1 | 0.0012 |
| CH4 (SmL) | 47.53a | 26.74b | 21.91bc | 18.03c | 3.3 | <.0001 |
| J (%) | 0.00 | 43.56a | 53.54b | 61.66b | 4.8 | 0.0104 |
| pH | 6.1 | 6.2 | 6.1 | 5.9 | 0.2 | 0.5597 |
| AGV (mM) | 83.50a | 78.00a | 60.50c | 92.01b | 5.5 | 0.0006 |
| AGV (mol/100 mol) | ||||||
| Acetato | 59.49a | 60.66a | 46.56b | 57.2a | 2.7 | 0.0007 |
| Propionato | 26.86a | 28.37a | 37.01b | 27.50a | 2.1 | 0.0009 |
| Butirato | 12.10a | 10.60a | 15.26b | 14.83b | 1.6 | 0.0223 |
| A/P | 2.27a | 2.14a | 1.32b | 2.08a | 0.3 | 0.0030 |
a,b,cMedias con distinta letra en una fila son significativamente diferentes (p < 0.05).
T: testigo; LOV: lovastatina (300 mg/L); MON: monensina (6 mg/L); BES: ácido bromoetano sulfónico (20 mg/L); EEM: error estándar de la media; SmL: volumen de gas normalizado; J: inhibición de la metanogénesis respecto al testigo; AGV: ácidos grasos volátiles; A/P: relación acetato/propionato.
Generalmente la mitigación de metano ruminal está asociada con el aumento de propionato como una ruta aceptora de electrones durante la fermentación ruminal. A pesar de ello, existen rutas alternas, e.g., fumarato a succinato, piruvato a lactato, síntesis de biomasa y biohidrogenación (Ungerfeld 2020). Estas rutas alternas podrían utilizarse cuando la LOV inhibe la metanogénesis ruminal, dado que en el presente trabajo no se observaron cambios en la concentración total ni el perfil de AGV.
Una ventaja de los inhibidores de la HMG-CoA reductasa (LOV y simvastatina) como aditivo antimetanogénico a nivel ruminal es su especificidad sobre arqueas metanogénicas (Gottlieb et al. 2016). Se ha comprobado que la LOV no afecta en cultivo puro algunas de las bacterias (R. albus, R. flavefaciens, B. fibrisolvens, F. succinogenes y S. ruminantium) celulolíticas y fibrinolíticas del rumen (Miller y Wollin 2001).
En el caso del tratamiento con MON, el total de AGV y la concentración de acetato disminuyeron (p < 0.05), pero aumentó la proporción tanto de propionato como de butirato, de manera que la relación acetato/propionato disminuyó (p < 0.05). Los efectos de la MON sobre la fermentación ruminal han sido evaluados más ampliamente (Appuhamy et al. 2013). Normalmente, la MON afecta a las bacterias productoras de hidrógeno (Russell 1987), ya que este metabolito es el principal sustrato para la metanogénesis ruminal. Además, la MON está relacionada con cambios establecidos sobre el perfil metabólico a nivel ruminal, entre los cuales destaca un aumento de propionato (Bagheri et al. 2018); no obstante, se ha indicado que en dietas altas en almidón, determinados microorganismos (e.g., P. bryantii) implicados en la generación de H2 no son sensibles a la MON (Weimer et al. 2008). Además, este ionóforo puede afectar a las bacterias M. elsdenii y B. fibrisolvens, involucradas en la biohidrogenación de lípidos (Weimer et al. 2008).
El tratamiento con BES produjo una disminución significativa del total de AGV y solamente promovió un aumento significativo de la concentración de butirato (Cuadro I). Resultados similares fueron reportados por Lee et al. (2009), quienes en experimentos de fermentación in vitro con BES (10.5 mg/L) indicaron que este compuesto no tiene efecto sobre el total de AGV, pero disminuye la proporción molar del acetato, presenta ligeros cambios sobre el propionato y aumenta la proporción de butirato (p < 0.05).
En contraste con los compuestos antimetanogénicos, una estrategia sostenible para mitigar los GEI es la adaptación de la ganadería a sistemas silvopastoriles (Murgueitio et al. 2014). En este sentido, Jiménez-Santiago et al. (2019) evaluaron la fermentación ruminal in vitro de forrajes de un sistema silvopastoril en Chiapas, México. Reportaron que el volumen de gas producido de L. leucocephala fue significativamente menor con relación a otros forrajes (e.g., P. maximum y G. sepium). Asimismo, cuando se mezclaron G. sepium y L. leucocephala con el pasto P. maximum y recursos locales para alimentación de ganado (maíz, melaza y banano) la reducción de metano in vitro fue significativa. Desde esta perspectiva, resultaría interesante evaluar los efectos de la LOV sobre la fermentación ruminal de forrajes disponibles en sistemas silvopastoriles.
CONCLUSIÓN
La LOV mostró efectos alentadores para la mitigación de metano (43.56 %) en la fermentación in vitro de una dieta alta en grano, característica de un sistema de bovinos productores de carne, sin afectar la producción total ni el perfil de AGV. No obstante, la dosis para obtener este resultado fue muy alta en comparación con las de otros tratamientos. En cuanto al BES y la MON, esta última fue la más efectiva (53.54 %) considerando la relación concentración/inhibición de metano ruminal. El BES tuvo la inhibición más alta de metano (61.66 %) sin muchos cambios en los metabolitos de fermentación.
Debido a la forma común de la LOV-LA inactiva, se sugieren experimentos futuros para establecer la función de la microbiota ruminal en la conversión de LOV-LA a su forma β-hidroxiácido, de su biodegradación y estabilidad en cultivos anaerobios ruminales a largo plazo.
