INTRODUCCIÓN

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ambientales ubicuos en el aire, compuestos por dos o más anillos de benceno fusionados, derivados de la combustión incompleta de materia orgánica. Los HAP son térmicamente estables, con puntos de ebullición altos y presiones de vapor bajas, lo que favorece su asociación con las partículas atmosféricas y por lo tanto su permanencia en la atmósfera (^{Masih et al. 2012}).

Estudios previos han demostrado que muchos HAP son mutagénicos y carcinogénicos (^{Kim et al. 2013}) y que su capacidad mutagénica es mayor cuando están asociados a las partículas que cuando están en fase gaseosa (^{Tsai et al. 1995}). En este sentido, los HAP asociados a partículas pequeñas resultan más peligrosos para la salud humana que los adsorbidos en partículas grandes, porque las primeras pueden penetrar más profundamente en el tracto respiratorio y desde allí llegar a otros órganos (^{USEPA 2003}).

En ambientes urbanos, la combustión incompleta de combustibles fósiles en los vehículos es la principal fuente de HAP (^{WHO 2003}). En las últimas décadas, el monitoreo de HAP en la atmósfera se ha convertido en una prioridad en los ambientes urbanos debido a la gran cantidad de individuos expuestos. Más aún, ante la gran cantidad de HAP presentes en atmósferas urbanas, la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) ha establecido que 16 de estos compuestos son prioritarios para monitoreo debido a su toxicidad (^{USEPA 2003}).

Actualmente existen algunos métodos validados por agencias internacionales para la detección y cuantificación de HAP adsorbidos a partículas, como por ejemplo el establecido por la USEPA para la determinación de estos compuestos en aire utilizando cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) (^{USEPA 1996}). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas tienen protocolos muy extensos, complicados metodológicamente y que resultan costosos por la gran cantidad de disolvente que emplean.

En el presente trabajo se evalúan modificaciones de una metodología estándar para la extracción, detección y cuantificación de HAP adsorbidos a partículas que permite acortar significativamente los costos y tiempos de procesamiento de muestras, conservando la sensibilidad y precisión del método.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de estudio

La ciudad de Córdoba está localizada en el centro de Argentina (31º 25′ 00″ S; 64º 11′ 00″ W) y es la segunda ciudad más poblada del país (1.4 millones de habitantes). Tiene una topografía en forma de embudo con una pendiente positiva creciente desde el centro hacia las áreas circundantes. Esta formación un tanto cóncava reduce la circulación de aire y provoca frecuentes inversiones térmicas durante las temporadas de otoño e invierno. El clima es subhúmedo, con una precipitación media anual de 790 mm, concentrada principalmente en verano. La temperatura media anual es de 17.4 ºC y los vientos predominantes provienen del Noreste, Sur y Sureste (^{Stein y Toselli 1996}).

Las principales fuentes de contaminantes atmosféricos están relacionadas con el tráfico y la resuspensión de polvo ambiental (^{López et al. 2011}, ^{Carreras et al. 2013}). La ciudad también cuenta con importantes fuentes estacionarias, tales como industrias metalúrgicas y metalmecánicas, localizadas en áreas periféricas al casco urbano (Fig. 1) (^{Mateos et al. 2018}).

Fig. 1 Ubicación de las principales fuentes de emisión de contaminantes atmosféricos en la ciudad de Córdoba. A = agricultura, CP = planta de cemento, MI = industria metalúrgica, MMI = industria metalmecánica, FT = tráfico fluido en avenidas, ST = tráfico lento en el centro (^{Mateos et al. 2018}). El cuadrado indica el punto de muestreo en este trabajo 

RESULTADOS

Los valores de emisión y absorción óptimos teóricos para cada HAP, así como los eluyentes empleados se seleccionaron considerando reportes anteriores (^{Peltonen et al. 1995}, ^{Schauer et al. 2003}, ^{Dionex 2009}, ^{Szulejko et al. 2014}). Luego estos valores se comprobaron experimentalmente empleando 25 µL de estándar de HAP. Además, se determinaron experimentalmente el flujo óptimo de los eluyentes seleccionados (ACN grado HPLC y agua MilliQ) y el programa de la curva no isocrática. Con esta información se armó el programa final, que tiene una duración total de 25 minutos, temperatura de columna de 35 ºC y postcolumna de 30 ºC, flujo de trabajo de 0.8 mL/min y lectura UV constante a 254 nm.

Cada muestra fue medida siete veces, de esta manera se pudo calcular un coeficiente de variación (CV) para cada compuesto.

Para determinar los tiempos de cambios de absorción y emisión de FL, se realizaron 45 corridas cromatográficas, primero, manteniendo constante el valor de absorción y variando el de emisión, y luego se realizó el proceso inverso. Los valores de absorción probados fueron: 230, 250, 270, 290 y 310 nm, en tanto que los de emisión: 320, 350, 380, 395, 410, 425, 440, 470 y 500 nm. Con los datos de cuentas, se determinó la absorción/emisión máxima para cada compuesto, por ejemplo, para fenantreno (Fig. 2). Cada valor fue cotejado luego con los de los compuestos cuyas eluciones fueran próximas entre sí en el tiempo y se seleccionó una longitud de absorción y emisión óptimas para ese grupo de sustancias.

Fig. 2 Curva de emisión/absorción de fenantreno, utilizada para determinar los valores óptimos del compuesto para el armado del programa final 

Los valores óptimos de emisión y absorción de cada compuesto, así como los límites de detección y cuantificación y los porcentajes de recuperación, pueden observarse en el cuadro I. Los cambios de eluyentes y tiempos de absorción/emisión finalmente empleados se presentan en la figura 3. Por otro lado, en el cuadro II se presentan resultados de algunas muestras medidas con el programa resultante. Es importante destacar que cuando las concentraciones de los compuestos medidos mostraban valores que se encontraban por sobre la curva de calibración, se realizaron diluciones seriadas 1:2 hasta obtener mediciones acordes a dicha curva.

Fig. 3 Programa de corrida final utilizado para la detección y cuantificación de hidrocarburos aromáticos policíclicos mediante cromatografía líquida de alta eficiencia 

En la figura 4 se observan dos corridas cromatográficas resultantes de la metodología propuesta.

Fig. 4 Cromatogramas de un estándar de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), 10 ppb (a) y de una muestra de partículas extraída con la metodología propuesta (b) 

DISCUSIÓN

En el cuadro III se comparan las características del método evaluado en este trabajo y el TO-13, que es el método de referencia recomendado por USEPA.

En el método desarrollado por USEPA, la extracción de los compuestos se realiza con Soxhlet, utilizando para ello 700 mL de disolvente (dietiléter:hexano 10:90 V/V) por cada muestra. Mientras que en la metodología propuesta sólo se utilizan 7 ± 1 mL de DCM por muestra, con lo cual se reduce casi 100 veces la cantidad de disolvente utilizado para la extracción.

En cuanto a las características de los disolventes utilizados para la extracción, el método TO-13 propone extracciones con mezclas de dietiléter y hexano. El primero es un líquido inflamable y presenta un grave peligro de incendio. En exposiciones de corta duración irrita los ojos y el tracto respiratorio. La ingestión del líquido puede originar aspiración dentro de los pulmones con riesgo de neumonitis química. También puede causar efectos en el sistema nervioso central, dando lugar a narcosis (^{IPCS 2008}). El hexano también es un disolvente altamente inflamable que irrita la piel en exposiciones de corta duración. Además, la ingestión del líquido puede originar aspiración dentro de los pulmones con riesgo de neumonitis química. La exposición a altas concentraciones podría causar disminución del estado de alerta (^{IPCS 2006}). En este caso, al emplear dos sustancias altamente inflamables, hay que tener especial cuidado con la temperatura de trabajo por el riesgo de incendio. Esto es particularmente importante, considerando las altas cantidades de disolvente utilizado con este método, por lo que las probabilidades de accidentes aumentan proporcionalmente. Con la nueva metodología propuesta, se emplea DCM que es un depresor del sistema nervioso central y un posible carcinógeno para el humano según el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (^{IARC 1999}). En exposiciones de corta duración, la sustancia irrita los ojos, la piel y el tracto respiratorio, y también podría causar disminución del estado de alerta (^{IPCS 2000}). Si bien este disolvente también presenta efectos adversos, las bajas cantidades que se emplean minimizan los riesgos de exposición, más aún si se trabaja con un recuperador de disolvente bajo campana.

En el método planteado por USEPA, el tiempo de extracción Soxhlet es de 18 h por extracción. En cambio, el método planteado requiere de 6 a 8 h totales por cada 10 muestras. Si bien el trabajo es más manual que en el método TO-13, los tiempos requeridos para extraer los compuestos son visiblemente menores. A esto se suma que el tiempo de corrida de cada muestra es la mitad que aquel detallado en el método de USEPA. Como resultado se reducen también los costos de mano de obra requerida.

Otra diferencia importante entre los métodos mencionados está relacionada con el procedimiento de cuantificación de los HAP. Se utiliza cromatografía líquida y no gaseosa. Hace un par de décadas, se discutía la utilización de HPLC como técnica para la detección de HAP debido a la baja resolución que poseían los equipos. Sin embargo, con los aparatos modernos se ha mejorado visiblemente su resolución, empleando detectores de FL, que son más sensibles que los que se empleaban anteriormente en los equipos de HPLC (luz UV) (por ejemplo: ^{Dong et al. 1976}, ^{Krstulovic et al. 1976}). De hecho, los nuevos equipos de cromatografía líquida superan en sensibilidad a los aparatos GC, aunque esto depende fuertemente de las características del equipo empleado y de la columna utilizada (^{Gratz et al. 2000}, ^{Liaud et al. 2015}). Otras ventajas adicionales del uso de HPLC en vez de GC es que se pueden emplear acarreadores más económicos y de fácil manipulación, temperaturas de trabajo más bajas y columnas de separación más versátiles.

Estudios previos de intercalibración entre GC y HPLC, encontraron mayores tiempos de análisis, menor resolución, menor límite de detección (LOD) e incluso algunos picos de compuestos solapados en las muestras corridas en cromatografía de gases (^{Chiu et al. 1997}).

Los métodos GC/MS capilares se limitan al análisis de aquellos HAP que son volátiles y térmicamente estables, mientras que un sistema de detección de FL supera el problema de la resolución en HPLC por el hecho de que dos longitudes de onda, excitación y emisión, están disponibles para la medición. Por lo tanto, aunque dos o más compuestos en una mezcla de HAP multicomponente pueden tener la misma longitud de onda de excitación para emitir fluorescencia, es poco probable que también emitan a la misma longitud de onda. Además, un HAP individual puede tener más de una longitud de onda fluorescente en la que puede excitarse. Por lo tanto, mediante la selección cuidadosa de las longitudes de onda de excitación y emisión, se puede obtener un alto grado de especificidad y selectividad en la detección de fluorescencia (Das y Thomas 1978).

CONCLUSIONES

Las modificaciones introducidas en la metodología generaron reducciones tanto en los tiempos, como en los costos de procesamiento, detección y cuantificación de HAP adsorbidos a partículas en suspensión.

Esto implica una mejora sustancial en el tiempo de procesamiento de cada muestra, sin reducir la sensibilidad para la detección de compuestos. Por otro lado, hay una disminución considerable en la cantidad de disolvente utilizado, con lo cual resulta en una metodología menos costosa y más amigable con el ambiente.