INTRODUCCIÓN

En los últimos años, los principales países productores de materias primas han incrementado la actividad agrícola a partir del empleo de insumos externos y tecnología, permitiendo su extensión a tierras que no habían sido cultivables hasta entonces (^{Viglizzo et al. 2011}).

El uso de las zonas no cultivables ha generado mayor vulnerabilidad en las zonas litorales de los cuerpos de agua adyacentes y en los organismos que allí habitan (^{Melzer 1999}), debido a que estos cuerpos son susceptibles a recibir y acumular contaminantes de origen agrícola (^{Jergentz et al. 2004}, ^{Wendt-Rasch et al. 2004}).

Los contaminantes presentes en la columna de agua pueden ser incorporados por plantas o animales y magnificarse en la cadena trófica, lo que constituye un riesgo potencial para la salud humana y ambiental (^{Lytle y Lytle 2001}).

El endosulfán (ES, C₉H₆Cl₆O₃S) es un plaguicida de amplio espectro, perteneciente al grupo de los organoclorados, que se utiliza para el control de numerosos insectos en cultivos (^{Sohn et al. 2004}, ^{Di Marzio et al. 2005}). Como consecuencia de su uso se ha detectado en atmósfera, cuerpos de agua, sedimentos y biota (^{Menone et al. 2001}, ^{Sethunathan et al. 2002}, ^{Jergentz et al. 2004}, ^{González et al. 2012}).

El ES tiene un tiempo de vida media en agua de aproximadamente un mes (20 ºC, pH: 7) (^{de Lorenzo et al. 2002}), siendo considerable su presencia en los cuerpos de agua dulce, ya que puede llegar allí por escorrentía de los suelos donde el compuesto fue aplicado. Se han encontrado concentraciones en este medio de hasta 100 µg/L (^{Mersie et al. 2003}).

Niveles del orden de magnitud mencionados previamente suponen un riesgo para la salud de los organismos acuáticos, ya que de acuerdo con la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA, por sus siglas en inglés), valores superiores a 0.22 y 0.056 µg/L generarían un impacto agudo y crónico, respectivamente (^{Mersie et al. 2003}).

La Convención de Estocolmo de 2012 prohibió el uso de ES junto con otros compuestos orgánicos persistentes; sin embargo, en algunos países como Argentina se han obtenido permisos para seguir aplicándolos por un tiempo adicional hasta acabar con los remanentes disponibles (^{Amaya 2011}).

Así, ^{Silva Barni (2017)} informa valores de ES de 0.004 a 0.017 µg/L en aguas del río Quequén Grande, Provincia de Buenos Aires, en el periodo de muestreo 2014-2015, a pesar de haber transcurrido varios años desde su prohibición.

Un biomarcador se define como el cambio en una respuesta biológica (desde molecular hasta comportamental, pasando por la celular y fisiológica) que se pueden relacionar con la exposición a los efectos tóxicos de químicos ambientales (^{Peakall 1994}).

Cuando las respuestas de los biomarcadores se desvían del rango normal -es decir, de una situación sin estrés-, superando determinado umbral de concentración de contaminante o tiempo de exposición, se genera una situación de efectos múltiples a niveles jerárquicos de organización biológica (^{ORNL 1991}, ^{Brain y Cedergreen 2008}, ^{Pagano et al. 2016}).

Entonces, la utilización de biomarcadores evidencia que el compuesto se ha incorporado en un organismo, se ha distribuido en sus tejidos y ha originado un efecto en determinados sitios blanco (^{Brain y Cedergreen 2008}).

Los biomarcadores deben cumplir con ciertos criterios para considerarse como tales: a) ser sensibles; b) responder al tóxico en forma dependiente de la dosis o el tiempo, lo que permite determinar la magnitud de la exposición o el efecto; c) ser relativamente fáciles de medir, y d) contemplar falsos negativos y falsos positivos (^{Huggett et al. 1992}, ^{van der Oost et al. 2003}).

Los falsos resultados pueden generarse por la presencia de factores no relacionados con la contaminación que interfieren en las respuestas esperadas. Estos “factores de confusión en la interpretación de la toxicidad” (^{Den Besten y Munawar 2005}) pueden ser fisiológicos y ambientales, tales como la edad, el sexo, la condición reproductiva, la temperatura, la disponibilidad del alimento, el pH y la salinidad, entre otros (^{Jiménez et al. 1990}, ^{Vidal et al. 2002}).

La presencia de factores de confusión debe tenerse en cuenta en los ensayos desarrollados en laboratorio para poder validarlos en campo, de modo que si se comparan las respuestas de organismos de diferentes sitios contaminados y de referencia, los organismos deben recolectarse de forma tal que tanto las condiciones fisiológicas como las variables ambientales sean similares en los diferentes sitios (^{ORNL 1991}).

En macrófitas se ha demostrado que, por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes y su limitación pueden modificar las tasas de crecimiento y en consecuencia la sensibilidad de las pruebas de toxicidad (^{Brooks et al. 2015}).

En las plantas, las especies reactivas del oxígeno (ERO) son producidas constantemente y se localizan en diferentes compartimentos celulares como producto de varias rutas metabólicas (^{Foyer y Mullineaux 1994}); en algunos casos cumplen con la función de ser moléculas de señalización, mediando la respuesta a diferentes estímulos (^{Neill et al. 2002}).

El mantenimiento de la homeostasis de las especies reactivas es esencial para la salud fisiológica de los organismos (^{Ames et al. 1975}). Cuando existe un desbalance entre la producción de especies moleculares oxidantes y antioxidantes, encontrándose en mayor proporción las primeras, la condición se denomina estrés oxidativo (^{Boelsterli 2007}, ^{Gill y Tuteja 2010}).

Existen muchos biomarcadores que se emplean para la evaluación del estrés oxidativo. Dentro de éstos se encuentran los de efecto (^{van der Oost et al. 2003}), que incluyen enzimas antioxidantes como la catalasa (CAT), las peroxidasas (PX) y la glutatión-S-transferasa (GST), así como compuestos no enzimáticos, como el glutatión o el ascorbato, y los que dañan la membrana lipídica, como el producto de peroxidación lipídica malondialdehí>do (MDA).

Las enzimas CAT y guayacol peroxidasa (POD) tienen como principal función detoxificar H₂O₂, mientras que la enzima GST posee dos roles principales: la catálisis de reacciones de conjugación con el tripéptido glutatión en fase II de metabolismo, tanto animal como vegetal, y la participación en la defensa contra el estrés oxidativo mediante la detoxificación directa de peróxidos lipídicos de membranas en vegetales (^{Marrs 1996}, ^{Cummins et al. 1999}).

Los organismos fotosintéticos poseen características ventajosas respecto del uso de animales, por lo que han sido ampliamente utilizados para el monitoreo de metales, herbicidas, surfactantes y compuestos clorados (^{Nimptsch et al. 2005}). El género Myriophyllum (familia Haloragaceae) (^{Darlington y Wylie 1961}), una hierba acuática flotante sumergida y arraigada por sus raíces al sedimento, común en orillas de lagos y ríos, es cosmopolita.

Este género ha sido ampliamente utilizado para evaluaciones de toxicidad de plaguicidas (^{Turgut et al. 2003}, ^{Nimptsch et al. 2005}, ^{Nimptsch y Pflugmacher 2004}, ^{Menone et al. 2008}) y está presente en ambos hemisferios, siendo Myriophyllum spicatum el preponderante en el hemisferio norte y Myriophyllum quitense (Kunth) en el hemisferio sur (^{Orchard 1981}).

En la literatura se encuentran disponibles referencias de exposición en animales a múltiples sustancias y en particular a ES. Sin embargo, este mismo tipo de resultados es escaso cuando se emplean plantas como organismos modelo.

^{Ramachandran et al. (1984)} evaluaron tasas fotosintéticas y respiratorias de seis macrófitas expuestas durante 6 h a ES; encontraron una disminución de la fotosíntesis en diferente medida, dependiendo de las especies evaluadas. Por otro lado, ^{de Lorenzo et al. (2002)} determinaron que la EC₅₀ de Pseudokirchneriella subcapitata, medida como la tasa de crecimiento, es de 427.80 µg/L.

Se han informado otros efectos, como daño en el material genético observado como fragmentación del ADN, mediante el ensayo cometa en Trifolium repens L. (^{Liu et al. 2009}), y como incremento en la frecuencia de aberraciones cromosómicas en anafase- telofase (ACAT) en Bidens laevis (^{Pérez et al. 2008}, ²⁰¹¹).

^{Pérez et al. (2014)} evaluaron el efecto de varias concentraciones de ES y distintos tiempos de exposición, y hallaron un aumento en la frecuencia de ACAT en plantas expuestas durante 48 h a 10 µg/L ES, así como aumento en la actividad de la enzima POD y disminución de la actividad de GST microsomal (GSTm).

En este contexto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar si diferentes temperaturas pueden modificar la actividad de enzimas antioxidantes en M. quitense expuesta a concentraciones de relevancia ambiental del plaguicida endosulfán.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis estadístico

Todos los datos presentaron normalidad (según la prueba de Shapiro-Wilk) y fueron analizados con la prueba de análisis de varianza (ANDEVA) de dos factores, para evaluar si existía interacción entre los factores “temperatura” y concentraciones de ES.

La interacción se visualiza en la figura 1 como la intersección de las líneas, lo cual significa que la variable dependiente (e.g., la actividad enzimática de POD) es influenciada por estos dos factores. Cuando no existe interacción se observan líneas paralelas que se interpretan como efectos sobre la variable dependiente de un factor o del otro.

Fig. 1 Análisis de interacción de la temperatura y la concentración de endosulfán sobre actividades enzimáticas de Myriophyllum quitense. (a) Catalasa (CAT), (b) guaiacol peroxidasa (POD), (c) glutatión-S-transferasa citosólico (GSTc), (d) glutatión-S-transferasa microsomal (GSTm). N =5 

Luego, los datos se analizaron mediante la comparación de las concentraciones de ES respecto del control negativo que fue expuesto a la misma temperatura empleando la prueba de ANDEVA de una vía para analizar diferencias entre las medias y una prueba de Tukey para establecer qué concentraciones de ES mostraban diferencias respecto al control negativo (^{Zar 1996}). En todos los casos el valor de significancia fue del 5 %.

RESULTADOS

Los valores basales (control negativo) de las enzimas GSTc, GSTm, CAT y POD resultaron similares a ambas temperaturas de exposición, 11 y 19 ºC (p > 0.05). Las pruebas de ANOVA de dos factores realizados para cada uno de los biomarcadores enzimáticos mostraron efecto de la interacción entre las variables “temperatura” y “ES” en las enzimas CAT y POD (p < 0.05; Fig. 1a, b).

En el caso de las enzimas GSTm y GSTc no hubo efecto de interacción de los tratamientos (p > 0.05; Fig. 1c, d). Sin embargo, las cuatro enzimas evaluadas mostraron el efecto del tratamiento ES cuando la temperatura de exposición fue de 11 ºC, mientras que a 19 ºC las plantas expuestas a ES no mostraron diferencias respecto de las plantas control.

A 11 ºC las actividades de CAT y POD disminuyeron en plantas expuestas a ambas concentraciones de ES (p < 0.05, Figs. 2 y 3, respectivamente), mientras que a 19 ºC no se observó diferencia significativa respecto de los controles (p > 0.05, Figs. 2 y 3).

Fig. 2 Actividad de catalasa (CAT) (nkat/mg proteína) en Myriophyllum quitense expuesta a distintas temperaturas. Cajas y bigotes: media ± error estándar de la media. 

*Indica diferencias significativas respecto del control (tratamiento correspondiente a 0 mg/L ES) (prueba de Tukey) (p < 0.05). N =5

Fig. 3 Actividad de guayacol peroxidasa (POD) (nkat/mg proteína) en Myriophyllum quitense expuesta a distintas temperaturas. Cajas y bigotes: media± error estándar de la media. *Indica diferencias significativas respecto del control (tratamiento correspondiente a 0 mg/L ES) (prueba de Tukey) (p < 0.05). N = 5 

En ambas fracciones, la actividad de la enzima GST no mostró diferencias significativas respecto al control cuando las plantas fueron expuestas a ES y la temperatura fue de 19 ºC (p > 0.05). Por otra parte, en plantas expuestas a 11 ºC se observó un incremento significativo de la actividad de GSTc a la concentración de 10 µg/L ES (p < 0.05, Fig. 4), y de GSTm a 5 µg/L ES (p < 0.05, Fig. 5).

Fig. 4 Actividad de glutation-S-transferasa citosólica (GSTc) (nkat/mg proteína) en Myriophyllum quitense expuesta a distintas temperaturas. Cajas y bigotes: media ± error estándar de la media. *Indica diferencias significativas respecto del control (tratamiento correspondiente a 0 mg/L ES) (prueba de Tukey) (p < 0.05). N = 5 

Fig. 5 Actividad de glutation-S-transferasa microsomal (GSTm) (nkat/mg proteína) en Myriophyllum quitense expuesta a distintas temperaturas. Cajas y bigotes: media ± error estándar de la media. *Indica diferencias significativas respecto del control (tratamiento correspondiente a 0 mg/L ES) (prueba de Tukey) (p < 0.05). N = 5 

DISCUSIÓN

En el presente trabajo, los cuatro biomarcadores bioquímicos evaluados en M. quitense presentaron cambios en sus respuestas a la exposición a ES dependientes de la temperatura, mostrando diferencias de actividad únicamente cuando la temperatura fue de 11 ºC.

Por ello es relevante tener en cuenta la temperatura en ensayos de laboratorio con M. quitense. Las enzimas evaluadas presentaron niveles de actividad semejantes en las plantas expuestas a control a diferentes temperaturas de exposición (11 y 19 ºC), lo cual indica que la temperatura por sí sola no modifica estos parámetros, siendo ventajoso respecto de otros parámetros como la tasa de crecimiento y la capacidad fotosintética, los cuales se ha demostrado que sí dependen de la temperatura (^{Tasmin et al. 2014a}), adjudicándose entonces una modificación en las actividades enzimáticas al xenobiótico.

Esta respuesta constante de los controles resulta significativa si se considera que en los criterios establecidos para el uso de biomarcadores en estudios de campo se incluye el conocimiento y comprensión de la variabilidad debida a factores ambientales (^{Huggett et al. 1992}).

^{Pflugmacher et al. (2000)} evaluaron la actividad basal de GST en ambas fracciones, con diferentes sustratos en 59 especies vegetales. Estos estudios mostraron que, en general, la actividad de GSTm fue menor que la actividad de GSTc para una misma especie, tal como se observa para M. quitense en los controles negativos del presente trabajo.

Sin embargo, la sensibilidad al ES fue mayor en la GSTm, debido a que mostró una actividad incrementada a 5 µg/L ES. Esta mayor sensibilidad podría explicarse por la especificidad de las múltiples isoformas de GST involucradas en la respuesta a xenobióticos, la cual se ha demostrado que es especie-específica y tiene como blanco un amplio espectro de compuestos electrofílicos (^{Coleman et al. 1997}, ^{Fujimiya et al. 2016}).

La actividad de la enzima GST en ambas fracciones aumentó cuando las plantas fueron expuestas a ES y la temperatura de exposición fue de 11 ºC, mostrando la participación de este sistema antioxidante en la respuesta al efecto de estrés oxidativo que se ha informado previamente para el ES en M. quitense (^{Menone et al. 2008}).

Estos autores, sin embargo, encontraron un aumento en la actividad de GSTc a 5 µg/L en M. quitense expuesta a ES en contradicción con los resultados de este trabajo, lo que podría deberse a condiciones de ensayo diferentes, ya que en dicho ensayo la temperatura de exposición fue de 20-22 ºC. Esta discrepancia apoya la hipótesis de que en M. quitense las enzimas tienen una actividad diferencial cuando están expuestas a un xenobiótico, dependiente de la temperatura del medio.

La enzima CAT es la principal enzima detoxificadora de H₂O₂, aunque también posee la capacidad de oxidar otros sustratos como metanol, etanol, formaldehído y ácido fórmico (^{van Breusegem et al. 2001}).

Por otra parte, las peroxidasas pertenecen a una familia enzimática ubicua que también cataliza la reducción de H₂O₂, y oxida numerosos sustratos y compuestos fenólicos (^{Mehlhorn et al. 1996}). La enzima POD sólo se encuentra presente en plantas (^{Asada 1992}); utiliza compuestos fenólicos como cosustratos y su actividad se relaciona con condiciones ambientales adversas, contribuyendo a la actividad antioxidante (^{Michałowicz et al. 2009}).

Ambas enzimas se han estudiado previamente en M. quitense. ^{Nimptsch et al. (2005)} encontraron que la actividad de POD aumentó en plantas expuestas a metales pesados. ^{Menone et al. (2008)} evaluaron la actividad de CAT expuesta a ES y hallaron incrementos significativos. Posteriormente, ^{Garanzini y Menone (2015)} encontraron una disminución en la actividad de ambas enzimas cuando las plantas fueron expuestas a 50 µg/L del fungicida azoxistrobina.

Los resultados obtenidos por ^{Menone et al. (2008)} indican un proceso de estrés oxidativo en presencia de ES, observado a través del incremento de la actividad de enzimas antioxidantes simultáneamente al incremento en el contenido de H₂O₂.

Sin embargo, los resultados aquí expuestos muestran una disminución en la actividad de estas enzimas en presencia de ES, que sería generada por una condición hiperoxidativa capaz de inactivar la actividad enzimática y, consecuentemente, conduciría a perder la capacidad antioxidante y en última instancia a la muerte celular (^{Connell 2005}).

El hecho de que no se observen cambios en las actividades de las enzimas evaluadas en plantas expuestas a endosulfán respecto a las no expuestas, cuando la temperatura fue de 19 ºC, podría deberse a un incremento en la tasa metabólica basal a esta temperatura.

Dicho incremento implicaría una mayor tasa de procesos anabólicos y catabólicos, incluyendo una mayor actividad enzimática basal, es decir, los organismos tendrían una mayor actividad per se debido al efecto de la temperatura. Esta explicación fue propuesta por otros autores respecto del incremento de procesos de detoxificación y excreción de xenobióticos en moluscos acuáticos (^{Greco et al. 2011}).

El hecho de que no se observen cambios significativos en las actividades enzimáticas en plantas expuestas a ES, con relación a las de control, a una temperatura de 19 ºC -como sí ocurre a los 11 ºC- pone de manifiesto que las plantas expuestas a mayor temperatura estarían en un estado fisiológico favorable, mientras que a temperaturas bajas se alejan de esta condición óptima y la presencia de ES genera estrés.

Si bien hay pocos trabajos que evalúan el efecto de factores de confusión en la toxicidad de plaguicidas en organismos fotosintéticos, en términos generales los resultados sugieren que los efectos adversos, y en algunos casos la toxicidad, se manifiestan a temperaturas bajas, mientras que son menores a temperaturas elevadas debido a una actividad enzimática basal mayor.

Los parámetros que se evalúan en los trabajos antes citados no suelen estar vinculados con sistemas de alarma temprana, como actividades de enzimas antioxidantes; sino a evaluaciones de punto final relacionadas con el crecimiento (e.g., crecimiento total, contenido de pigmentos y contenido de H₂O₂).

Así, ^{Tasmin et al. (2014a)} evaluaron en Pseudokirchenriella subcapitata el efecto de la temperatura y las concentraciones de nitratos y sulfatos en el porcentaje de inhibición de crecimiento combinado con el posible efecto del herbicida diurón. En dicho trabajo, los autores informaron una tasa mayor de crecimiento a mayores temperaturas, así como disminución de la toxicidad del herbicida debida a un aumento en la temperatura.

Por otra parte, ^{Tasmin et al. (2014b)} evaluaron también el efecto del herbicida diurón en el crecimiento total del organismo antes citado a diferentes temperaturas, así como el porcentaje de inhibición fotosintético y el contenido de H₂O₂ en P. subcapitata. En este estudio encontraron que organismos expuestos al herbicida a temperaturas más bajas presentaban mayor contenido de H₂O₂, mayor tasa de inhibición de eficiencia fotosintética y menor tasa de crecimiento.

Ambos trabajos se realizaron con tiempos de exposición menores a 144 h. Así, de manera similar a los resultados obtenidos en el presente trabajo, la temperatura puede modificar la toxicidad de un compuesto, y sus efectos dependerán tanto de la especie evaluada como de la sustancia a la que se la expone (^{Cairns et al. 1975}).

^{Hall et al.} (1997) evaluaron el efecto en macrófitas de la exposición subcrónica al herbicida atrazina en Potamogeton pectinatus, teniendo en cuenta distintos niveles de salinidad del agua y hallaron que este factor generó modificaciones en la toxicidad del herbicida evaluado.

Por ello la evaluación de biomarcadores debe tener en cuenta estos factores, sobre todo cuando son evaluados en campo, para evitar una mala interpretación de la toxicidad. Por ello

resulta de interés comprender la influencia de dichos factores de confusión sobre las respuestas a xenobióticos en organismos no blanco, como M. quitense. Esta especie ha mostrado que es sensible ante la exposición a ES, y dicha sensibilidad es diferente según la temperatura evaluada.

Considerando las fluctuaciones de temperatura en el ambiente de aplicación, éste debería ser un parámetro fundamental al realizar evaluaciones de riesgo ambiental (ERA), debido a que la simple evaluación de exposición a contaminantes podría arrojar resultados no representativos de su efecto en condiciones reales, subestimando el riesgo de exposición.

Finalmente, teniendo en cuenta que estudios previos realizados en organismos fotosintéticos han mostrado una sensibilidad diferencial a ciertos plaguicidas ante variaciones de temperatura, debe tenerse en mente que los organismos fotosintéticos comprenden la mayor parte de la biósfera (^{Maluszynska y Juchimiuk 2005}).

Por otra parte, los contaminantes presentes en la columna de agua pueden ser incorporados por plantas o animales y magnificarse en la cadena trófica, constituyendo un riesgo potencial para la salud humana y ambiental (^{Lytle y Lytle 2001}). Por ello

son necesarios más estudios con macrófitas como organismos biomonitores, considerando las variaciones en factores de confusión como temperatura, pH del agua, concentración de nutrientes, disponibilidad de oxígeno, calidad y cantidad de luz, entre otros.

CONCLUSIONES

El ES produce estrés oxidativo en células de M. quitense, puesto en evidencia a través del incremento de actividad de la enzima GST y la disminución de las actividades de CAT y POD. Por otra parte, se concluye que los efectos del plaguicida ES en M. quitense fueron influenciados por las diferentes temperaturas del medio ensayadas, ya que las respuestas enzimáticas fueron diferentes según la temperatura fuese de 11 o 19 ºC.

En este sentido cobra importancia evaluar factores como la temperatura en los bioensayos, dado que son un factor de confusión al momento de interpretar los resultados.