Origen de las rizobacterias empleadas como inoculantes

Las rizobacterias empleadas como inoculantes son cepas productoras de sideróforos y fitohormonas, aisladas por ^{Avilés-Narváez (2016)}: Serratia sp. A (Rz A), de la rizósfera de Sphaeralcea angustifolia (Cav.) G. Don; Serratia sp. L (Rz L), y Serratia sp. F (Rz F), de la rizosfera de Tithonia diversitifolia (Hemsl.) A. Gray. Todas estas especies crecen en un sitio contaminado con metales pesados (As, Cu, Pb y Zn) localizado en Villa de la Paz, San Luís Potosí, México (23º 41’ N, 100º 42’ O), región que ha sido objeto de explotación minera intensa durante varias décadas (^{Vásquez et al. 2006}).

Mantenimiento y propagación del tejido calloso de E. micromeris

El tejido calloso empleado de E. micromeris, se obtuvo a partir del material fresco del cultivo in vitro de plantas de la colección biológica del Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. Su propagación se realizó a partir de tejido calloso fresco no diferenciado que se mantuvo en medio sólido 37 (Murashige-Skoog [MS] ¼ sales) (^{Murashige y Skoog 1962}) con la adición de 0.5 mg/L de ácido indolacético (AIA) y 1mg/L de bencil amino purina (BAP).

Establecimiento de los bioensayos

Se fraccionaron callos de E. micromeris de 1 cm² y se depositaron cuatro fracciones de 0.25 cm² en frascos de cultivo tipo Gerber con tapas Magenta, que contenían 30 mL de medio sólido 37 (MS ¼ sales) con 0.5 mg/L de AIA y 1 mg/L de BAP, a los que se les adicionó cadmio (3 CdSO₄ • 8 H₂O) en tres concentraciones: 0.1, 0.5 y 1.0 mM, inoculados por separado con las tres rizobacterias seleccionadas. La preparación de los inóculos bacterianos se realizó según lo establecido por ^{Ramírez-Melo et al. (2013)} a partir de un cultivo masivo en placa con medio sólido LB (Luria-Bertani) cultivado por 48 h, del que se tomó una asada y se ajustó una suspensión bacteriana en agua destilada estéril a una densidad de 5 × 10⁷ células/mL. De esta suspensión bacteriana se tomaron 0.25 mL para inocular las masas celulares, de acuerdo con lo reportado por ^{Corona-Álvarez et al. (2017)}. Los tratamientos experimentales fueron los siguientes: testigo (sólo con medio MS 37), MS + Cd 0.1 mM, MS + Cd 0.5 mM y MS + Cd 1.0 mM; con rizobacterias: MS+ Rz A, MS + Rz L y MS+Rz F; y el inoculante y las tres concentraciones de cadmio: MS + Rz A + Cd 0.1 mM, MS + Rz A + Cd 0.5 mM, MS + Rz A + Cd 1.0 mM, MS + Rz L + Cd 0.1mM. MS + Rz L + Cd 0.5 mM, MS + Rz L + Cd 1.0 mM, MS + Rz F + Cd 0.1 mM, MS + Rz F + Cd 0.5 mM y MS + Rz F + Cd 1.0 mM. Los tratamientos se instalaron por triplicado y los frascos se dejaron en una cámara de cultivo en condiciones de iluminación continua con una lámpara de luz fría de 4500 lux (67.5 µmol/m²/s) a temperatura ambiente (28 ºC) y con fotoperiodo de 16:8 por ocho días.

Evaluación del crecimiento y viabilidad del tejido calloso de E. micromeris

Después del tiempo de incubación, las fracciones de callo se analizaron visualmente para evaluar algún daño debido a las condiciones experimentales o por el efecto de la inoculación. De acuerdo con el criterio de ^{Souissi y Kremer (1998)}, se tomaron en cuenta el color y la reducción del crecimiento o la desintegración del tejido calloso. Estos elementos se calificaron en una escala de 0 a 4: 0: sin decoloración, cambios visibles ni reducción en el crecimiento; 1: con ligera decoloración y sin reducción visible del crecimiento; 2: con cambios en el color del tejido y ligera reducción del crecimiento; 3: con cambios en el color del tejido, reducción obvia del crecimiento y contracciones del tejido frecuentes, y 4: cambios en el color del tejido, desintegración del callo y reducción severa del crecimiento.

Se obtuvo el peso fresco de las masas celulares y se evaluó la viabilidad celular de éstas, con el empleo del colorante azul de Evans, que no es permeable y produce baja toxicidad. El empleo de este colorante esta descrito por varios autores (^{Gaff y Okong’o-Ogola 1971}, ^{Turner y Novacky 1974}, ^{Souissi y Kremer 1994}, ¹⁹⁹⁸, ^{Song et al. 1999}, ^{Iriti et al. 2006}, ^{Kollárová et al. 2017)} para determinar el número relativo de células muertas en cultivos de células en suspensión y de callo, mediante la cuenta de células muertas que se tiñen con el azul y el número de células vivas que no presentan esta coloración. La tinción se realizó de acuerdo con el método modificado por ^{Toledo (2012)} y consistió en colocar las masas celulares en tubos de ensaye, adicionando 1 mL de solución de azul de Evans al 0.5 % durante 10 min. Transcurrido ese tiempo se decantó el líquido de cada muestra y se enjuagó con agua destilada hasta que la solución decantada fuera incolora. Se homogenizaron los fragmentos de callo con un homogeneizador de tejidos Potter-Elvehjem (PTFE, Sigma-Aldrich) y se les adiciono 1 mL de agua destilada. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 3 min a temperatura ambiente, se recuperó el sobrenadante en tubos de ensaye de 5 mL para, finalmente, leer su absorbancia a una longitud de onda de 630 nm. La concentración final de azul de Evans se determinó con el empleo de una curva tipo de este colorante.

Para todas las masas celulares obtenidas, se determinó el contenido total de proteína por la técnica convencional de ^{Bradford (1976)}, tomando 100 mg de callo que se homogenizaron con el Potter-Elvehjem (PTFE, Sigma-Aldrich) con la adición de un regulador de fosfatos (50 mM, pH = 6.0, en frío). Una vez obtenidos los extractos celulares se tomó 1 mL de éstos y se le adicionaron 3 mL del reactivo azul de Coomassie G-250. Se dejó incubar por 10 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia del complejo colorido formado a 595 nm. Se empleó una curva tipo de albúmina bovina para la determinación de la concentración de proteína. La concentración de proteína total celular se expresó como mg/mL de proteína celular total/g de peso fresco.

Evaluación de la actividad de fenoloxidasas como respuesta al estrés oxidativo del tejido calloso de E. micromeris expuesto a cadmio

La actividad de las guaiacol peroxidasas (GPX) de cada extracto celular se determinó por el método espectrofotométrico de la oxidación de guaiacol de ^{Guerrero-Zúñiga y Rodríguez-Dorantes (2009)}, depositando lo siguiente en tubos Eppendorf de 1.5 mL: 100 μL del extracto celular obtenido + 1 mL de regulador de fosfato de potasio (100 mM, pH = 6.0) + 32 μL de guaiacol 0.2 M + 32 μL de peróxido de hidrógeno 0.03 M. Los tubos se incubaron por 30 min a temperatura ambiente hasta obtener evidencia de la actividad de guaiacol peroxidasas a través del desarrollo de una coloración café-rojiza, característica de la oxidación y polimerización del guaiacol; finalmente, se leyó la absorbancia a 436 nm. La actividad de hemoperoxidasas (HPX) de los extractos celulares se determinó con el método espectrofotométrico de la oxidación de tetrametilbencidina (TMBZ), de acuerdo con ^{Herrera et al. (2008)}, mediante el depósito de los siguientes componentes en tubos Eppendorf de 1.5 mL: 100 μL de muestra + 1mL de regulador de acetato de sodio (0.20 M, pH = 5.3) + 100 μL de TMBZ + 50 μL de peróxido de hidrógeno al 0.17 %. Los tubos se incubaron por 30 min a temperatura ambiente y se evidenció la actividad de hemoperoxidasas a través del desarrollo de la coloración azul característica de la oxidación de tetrametilbencidina. Finalmente se leyó la absorbancia a 652 nm. La actividad enzimática específica de ambas enzimas se calculó empleando la ecuación modificada por ^{Escalante et al. (2012)}:

donde As es la absorbancia obtenida de las lecturas a 436 y 652nm; ξ el coeficiente de extinción molar del guaiacol (Ɛ₄₃₆ = 6400 M/cm) y de la TMBZ (Ɛ₆₅₂ = 39 000 M/cm); R el volumen total del ensayo; S el volumen de la muestra, y t el tiempo de incubación de la reacción enzimática. La actividad de ambas enzimas se expresó como nM de guaiacol oxidado/min/g de peso fresco y nM de TMBZ oxidada/min/g de peso fresco.

A todos los resultados obtenidos se les aplicó un análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey-Kramer de comparación múltiple, empleando el paquete estadístico GraphPad InStat, v. 3.10 (2009). Se realizó un análisis numérico comparativo entre las diferentes condiciones experimentales con los datos de viabilidad celular (porcentaje de azul de Evans), proteína total y actividad enzimática (GPX y HPX), empleando el programa NTSyS-PC (numerical taxonomy and multivariate analysis system) v. 2.11X (2005), para la aplicación del índice de distancia euclidiana. Una vez obtenidos estos valores, se construyó el fenograma respectivo utilizando el método de agrupamiento UPGMA (unweighted pair group method of arithmetic averages) y se estableció la veracidad y confianza del fenograma obtenido a través de la obtención del coeficiente de correlación producto-momento de Pearson.

Evaluación de la viabilidad celular y el crecimiento del tejido calloso de E. micromeris

El crecimiento de las masas celulares, relacionado con el contenido de proteína total cuantificado, mostró que en general los tratamientos inoculados no lo promovieron. Los valores de dicho crecimiento fueron de 1 a 12 mg/mL de proteína celular total/g peso fresco (Fig. 1a), en comparación con los tratamientos en presencia de Cd (12 a 45 mg/mL proteína celular total/g peso fresco), en los que no se observó un efecto dañino sobre el tejido calloso de E. micromeris en las tres concentraciones de este metal. Por el contrario, se observó un efecto promotor del crecimiento (Fig. 1b). Se sugiere que esta respuesta puede relacionarse con un efecto hormético producido por el Cd (inducción de crecimiento ante un gradiente de concentraciones del metal), pues se ha determinado que como primera barrera a la toxicidad de este metal, la mayoría de las especies acumulan Cd, con el fin de limitar su transporte (^{Vásquez et al. 2006}).

Fig. 1 Cuantificación de proteína total celular del tejido calloso de E. micromeris: (a) exposición a cadmio; (b) exposición a cadmio e inoculación con rizobacterias. Sólo las condiciones con marcadas con un asterisco (*) resultaron estadísticamente significativas (n = 12, p < 0.001) 

Considerando que en la viabilidad celular determinada (Fig. 2) un mayor porcentaje cuantificado del colorante corresponde a una elevada muerte celular en el tejido calloso, éste correspondió a los tratamientos del tejido calloso de E. micromeris inoculados con 5 y 8 % de azul de Evans, seguidos por el tratamiento con el medio de cultivo con 3 %. Los tratamientos que presentaron un menor indicio de muerte celular fueron los que tenían la presencia del inoculante y Cd con alrededor del 2 %. ^{Souissi y Kremer (1998)} mencionan que la presencia de rizobacterias produce un efecto promotor o inhibidor del crecimiento de los callos. En este estudio, la inoculación del tejido calloso de E. micromeris ocasionó un efecto fitotóxico no solamente en la disminución del tamaño de los callos (MS + Rz A = 0.11 g, MS + Rz L = 0.07 g y MS + Rz F = 0.087 g), en comparación con los tratamientos con el medio (0.18 g), sino también en su apariencia (Fig. 3), ya que las masas celulares presentaron una coloración obscura, característica de un proceso de necrosis en el callo. Según el criterio de ^{Souissi y Kremer (1998)}, esto se considera un daño de nivel 3 (cambios en la coloración, reducción obvia en el crecimiento y contracción de los callos). Estos autores y ^{Goodman et al. (1986)}) sugieren que la variación en los síntomas ocasionados por las rizobacterias proviene de diferencias en el modo de acción y la bioquímica de la interacción planta-rizobacteria en el tejido calloso.

Fig. 2 Evaluación de la viabilidad del tejido calloso de E. micromeris en todas las condiciones experimentales probadas. Las diferentes letras muestran diferencias estadísticamente significativas (n = 12, p < 0.001) 

Fig. 3 Desarrollo de los cultivos de tejido calloso de E. micromeris inoculados con Rz L: (a) tratamiento con Rz L, (b) tratamiento con Cd 0.1 mM + Rz L, (c) tratamiento con Cd 0.5 mM + Rz L y Cd 1.0 mM + Rz L 

Evaluación de la actividad de GPX y HPX ante la presencia de Cd en el tejido calloso de E. micromeris

La actividad obtenida de las GPX fue mayor en los tratamientos con Cd (0.1, 0.5 y 1.0 mM) comparada con el tratamiento MS (Fig. 4a), entre los 80 y 110 × 10⁶ nM de guaiacol oxidado/g peso fresco. En los tratamientos de los callos inoculados (Fig. 4b), la actividad de GPX obtenida fue menor (entre 6 y 46 × 10⁶ nM de guaiacol oxidado/g peso fresco); en particular la presencia de Cd y las rizobacterias Rz L y Rz F, indujeron una mayor actividad de estas enzimas. La actividad obtenida de las HPX contrastó con la de las GPX, ya que en las primeras ésta fue menor en las masas celulares con el tratamiento MS y la presencia de Cd (Fig. 4c) (de 2 a 8 × 10⁶ nM TMBZ/min/g peso fresco) y mayor en los tratamientos inoculados (Fig. 4d) (de 24 a 39 × 10⁶ nM TMBZ/min/g peso fresco).

Fig. 4 Evaluación de la actividad enzimática del tejido calloso de E. micromeris: (a) actividad de GPX de callos expuestos a cadmio, (b) actividad de GPX de callos expuestos a cadmio e inoculados con rizobacterias, (c) actividad de HPX de callos expuestos a cadmio y (d) actividad de HPX de callos expuestos a cadmio e inoculados con las tres rizobacterias. Las cifras con diferente letra resultaron estadísticamente significativas (n = 12, p < 0.001) 

La respuesta de la Rz L y Rz F se repitió en presencia de las diferentes concentraciones de Cd. La actividad de HPX, que fue mayor en los cultivos de callo inoculados con la Rz A, disminuyó con la adición del metal pesado de 38 a 24 × 10⁶ nM TMBZ/min/g peso fresco. Uno de los parámetros bioquímicos reportados como biomarcadores de respuesta a la exposición a metales pesados en las plantas es el incremento o inhibición de la actividad de enzimas antioxidantes. ^{Pernía et al. (2008)} y ^{Rodríguez et al. (2008)} reportan que la presencia de cadmio produce un exceso de especies reactivas de oxigeno (ROS) que se asocia con incremento en la actividad de este tipo de fenoloxidasas. En este trabajo se obtuvo un incremento en la actividad de HPX, la cual podría vincularse con este tipo de respuestas, donde las condiciones de estrés generaron una reacción protectora ante las condiciones de toxicidad. En términos de la actividad de fenoloxidasas, ésta disminuyó en todos los tratamientos probados al aumentar la concentración de Cd, lo cual coincidió con lo reportado por ^{Szöllösi et al. (2009)}. Esto sugiere la presencia de un evento asociado a la dosis-respuesta en los tratamientos inoculados, lo que no se observó en presencia del metal solo con un incremento en la respuesta oxidativa a sus altas concentraciones.

Respuesta integral del tejido calloso de E. micromeris ante la presencia de Cd y los inoculantes

La figura 5 muestra la asociación de la respuesta integral del tejido calloso ante la presencia de Cd y las tres rizobacterias. El fenograma muestra la asociación inicial del Grupo I, conformado por dos conjuntos bien definidos: uno que asocia las respuestas particulares del tejido calloso ante la presencia de cadmio, donde los resultados que contribuyen a esta agrupación son la proteína total y la actividad de GPX; y otro conformado por el resto de las condiciones experimentales, que a su vez constituyen el Grupo II. En éste se muestra la respuesta particular del tejido calloso crecido en condiciones normales, relacionado con el Grupo IIa, en el cual se incluyen todas las condiciones experimentales con la inoculación del tejido calloso. En este grupo se incluyen conjuntos de condiciones muy específicas: las rizobacterias Serratia sp. L y Serratia sp. F, cuyas respuestas son comunes aun en agrupaciones separadas. En este sentido, destacan las respuestas obtenidas en las condiciones experimentales con la adición de 0.1 mM de Cd y la presencia de las rizobacterias mencionadas. De todas las agrupaciones, la respuesta particular de Serratia sp. A fue similar con la exposición de los callos a 0.5 y 1.0 mM de Cd. ^{Iori et al. (2012)} reportan que los cultivos de callo de dos clones parentales de Populus nigra L. (Poli y 58-861) expuestos a sulfato de cadmio a las concentraciones de 0.15 y 0.25 mM, tuvieron respuestas de crecimiento y actividad de GPX diferentes. En el clon Poli, la actividad disminuyó a la concentración de 0.15 mM, y en ambos clones esto ocurrió con 0.25 mM de Cd. Los autores reportan que esto pudo deberse al efecto producido por la unión del Cd a los grupos funcionales enzimáticos, ya que según ^{Prasad (1995)} y ^{Joshi y Mohanty (2004)}, éste interfiere con el doblamiento y las propiedades catalíticas enzimáticas. ^{Azevedo et al. (2005a}, ^b) evaluaron el efecto del cadmio sobre los sistemas enzimáticos de defensa en tejido calloso de Helianthus annuus L., en particular aquellos que están involucrados en prevenir el estrés oxidativo. El tejido calloso creció en presencia de Cd a las concentraciones de 0, 0.005, 0.050 y 0.50 mM, y se observó una reducción significativa del contenido de proteína total del tejido calloso a las concentraciones de 0.050 y 0.50 mM. Por su parte, la actividad de peroxidasas se incrementó en los callos expuestos a 0.005 mM y decreció en aquellos expuestos a la concentración de 0.50 mM. Los autores mencionan que este decremento pudo deberse al hecho de que se presenta una alteración en la integración de la membrana plasmática, lo cual sugiere que los sistemas del callo desarrollan mecanismos antioxidantes que les permiten responder al estrés provocado por el Cd.

Fig. 5 Fenograma del agrupamiento de las condiciones experimentales de los cultivos de callo de E. micromeris (r = 0.90); A: testigo; B: Cd 0.1 mM; C: Cd 0.5 mM; D: Cd 1.0 mM; E: Rz A; F: Rz L; G: Rz F; H: Cd 0.1 mM + Rz A; I: Cd 0.1 mM + Rz L; J: Cd 0.1 mM + Rz F; K: Cd 0.5 mM + Rz A; L: Cd 0.5 mM + Rz L; M: Cd 0.5 mM + Rz F; N: Cd 1.0 mM + Rz A; O: Cd 1.0 mM + Rz L, y P: Cd 1.0 mM + Rz F 

Los resultados aquí reportados y los que se citan de la literatura, concluyen que este tipo de respuestas en tejido calloso están relacionadas con la sensibilidad al cadmio y sobre todo con la posibilidad de potenciar mecanismos antioxidantes que impliquen sistemas de defensa relacionados con las actividades enzimáticas. Esto sugiere la presencia de mecanismos celulares que proporcionan tolerancia al metal y, con ello, permiten la adaptación. Dichos mecanismos celulares también pueden vincularse con la inducción de sistemas enzimáticos como respuesta al estrés oxidativo. ^{Fornazier et al. (2002)}, ^{Shützendübel y Polle (2002)} y ^{Benavides et al. (2005)} reportan que la modulación de la actividad enzimática por Cd depende fuertemente de las concentraciones de cadmio, el tiempo de exposición a éste y de la especie u órgano vegetal.