Equipo

Se utilizó un equipo de EAA Perkin Elmer modelo AAnalyst 400, equipado con un horno de grafito Perkin Elmer modelo HG 900 con automuestreador AS 800. Se utilizó lámpara mono-elemento de aluminio, sistema de corrección de fondo y tubos de grafito integrados con plataforma Lvov (^{Perkin Elmer 2012}).

Adicionalmente, se cuantificó Al por EAA por flama de óxido nitroso-acetileno. Las condiciones de operación se indican en el cuadro I. Para la descomposición de las muestras de tejidos de animales, se utilizó un equipo de horno de microondas MARSxpress 5 CEM Corporation (Mathews, NC, EUA).

Calibración del equipo de EAA

En la cuantificación de aluminio en soluciones estándares, material de referencia certificado, muestras de tejido de ratas, agua desionizada y alimento, se utilizó un equipo EAA Perkin-Elmer Modelo AAnalyst 400, tanto para flama como para horno de grafito. La calibración se realizó mediante la prueba de sensibilidad como se indica en el cuadro I.

Reactivos, estándares y material de referencia certificado

Los reactivos Mg( NO₃)₂, HNO₃ concentrado y KCl fueron obtenidos de J.T. Baker (Center Valley, PA, EUA). Se utilizó un estándar de aluminio de 1000 ± 2 mg/L (AccuStandard, New Haven, CT, EUA), un material de referencia certificado (CRM-S-B) que contiene 700 ± 4 mg/L de Al (High-Purity Standard, Charleston, SC, EUA) y un material de referencia certificado de tejido de ostión (del National Institute of Standards and Technology estadounidense [NIST-1566b, Gaithersburg, MD, US]) que contiene 197.2 ± 6 mg/kg de Al.

Preparación de materiales de cristalería

El material fue sometido a un estricto control para evitar la contaminación por elementos traza, siguiendo la metodología recomendada por ^{van Loon (1985)} y ^{Bohrer et al. (2008)}.

Los materiales de trabajo de vidrio (pipetas serológicas, volumétricas y matraces volumétricos, entre otros) se lavaron exhaustivamente con detergente líquido comercial para después ser sometidos en una solución de HNO₃ al 20 % (J.T. Baker) durante tres días. Posteriormente fueron enjuagados con agua desionizada. Una vez secado, el material se guardó en recipientes de plástico con tapa hermética hasta su uso.

Calibración de balanza analítica, material volumétrico y micropipetas

El material volumétrico, así como las micropipetas (High Tech Lab) fueron calibrados mediante el método gravimétrico (^{Batista et al. 2009}, ^{Lorefice 2009}, ^{Liang et al. 2013}), con una balanza analítica marca Vibra modelo AF-R220E 220/0.0001g (Max/d). Esta balanza previamente fue calibrada con un juego de masas patrón de laboratorio (0.2, 0.5, 1 y 100 g) marca Rice Like, certificadas por la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA).

Validación del método

Los parámetros analíticos de calidad que se han considerado para la validación del método son los siguientes:

Linealidad. Se comprobó a través de curvas de calibración y estimación del coeficiente de correlación (r) y de la pendiente (m). Para ello, se prepararon tres curvas de calibración a partir de un estándar de Al de alta pureza (Accustandard) que contiene 1000 mg/L de Al.

Concentraciones de trabajo. Fueron de 10, 20, 50, 100 y 200 mg/L de Al, las cuales se acondicionaron con HNO₃ al 2 % (J.T. Baker) y con KCl al 0.2 % (J.T. Baker) para su cuantificación con EAA-F con óxido nitroso-acetileno. Adicionalmente se prepararon tres curvas de calibración a concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100 μg/L de Al, y se acondicionaron con HNO₃ al 2 % y con Mg(NO₃)₂ al 0.2 % (J.T. Baker) para su cuantificación por EAA-HG.

Exactitud y precisión. Estas variables se determinaron a través del porcentaje de recuperación (% Rec) y el porcentaje de coeficiente de variación (% CV), respectivamente. Para ello, se utilizó el material de referencia certificado CRM-S-B (sedimento de suelo en solución acuosa, High-Purity Standards, Charleston SC, EUA), que contiene 700 ± 4 mg/L de Al.

Posteriormente se preparó un estándar de trabajo de 70 mg/L de Al, el cual se acondicionó con HNO₃ al 2 % y con KCl al 0.2 % para EAA-F. Para EAA-HG, el estándar de trabajo se preparó con una concentración de 70 µg/L de Al y se acondicionó con HNO₃ al 2 % y con Mg(NO₃)₂ al 0.2 %.

Repetibilidad. Se determinó mediante análisis de varianza, utilizando el estadístico de prueba F con un nivel de significancia del 5 % (α = 0.05) y n = 25. Para esto, se prepararon estándares de trabajo por quintuplicado por semana durante un tiempo total de cinco semanas a concentraciones de 20, 50 y 100 mg/L de Al, los cuales se acondicionaron con HNO₃ al 2 % y KCl al 0.2 % para EAA-F.

Para EAA-HG, se utilizaron estándares de trabajo a concentraciones por triplicado de 20, 40 y 60 µg/L de Al, que se acondicionaron con HNO₃ al 2 % y Mg(NO₃)₂ al 0.2 %. El criterio de aceptación de la repetibilidad consiste en que F _calculada ≤ F _tablas (^{Blair y Taylor 2007}).

Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC). Se obtuvieron a partir de los datos de las curvas de calibración para EAA-F y para EAA-HG. El LD se calculó a partir de 3 s/m, donde s es la desviación estándar de 10 mediciones del blanco y m es la pendiente de la curva de calibración (^{ISO 1994}, ²⁰⁰⁵).

El LC fue calculado como 10 s/m. El blanco para EAA-F fue una solución de HNO₃ al 2 % y con KCl 0.2 %, en tanto que el blanco para EAA-HG fue una solución de HNO₃ al 2 % y Mg(NO₃)₂ al 0.2 % (^{ISO 2005}, ^{Blair y Taylor 2007}).

El proceso de validación del método analítico se completó mediante la utilización de un material de referencia certificado de tejido de ostión (NIST-1566b) que contiene 197.2 ± 6.0 mg de Al/kg de tejido y que reemplaza al tejido de rata, ya que no existe actualmente este tipo de tejido como material de referencia certificado.

En esta etapa se evaluó la exactitud a través del porcentaje de recuperación (% Rec) y la precisión a través del porcentaje del coeficiente de variación (% CV).

Aplicabilidad del método validado

El método analítico validado se empleó para cuantificar la concentración de Al en tejidos de ratas sin fortificar y fortificados con 100 mg/L de Al para EAA-F y con 200 µg/L de Al para EAA-HG.

Condiciones de bioterio

Se seleccionó un grupo de 10 ratas hembra Sprague Dawley proporcionadas por el bioterio del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos de la Universidad de Sonora.

Las ratas, de 200 ± 20 g de peso corporal y sin algún tipo de tratamiento específico, fueron mantenidas en condiciones estándar de bioterio, con ciclos de luz/oscuridad de 12 h, humedad de 40 a 70 %, temperatura de 18 a 22 ºC, agua y alimento de libre consumo (^{Bohrer et al. 2008}). El alimento fue adquirido de Formulab Diet (5008C33, San Luis MO, EUA) y el agua estuvo libre de Al.

Obtención de muestras biológicas

Las ratas Sprague Dawley fueron anestesiadas con halotano y eutanizadas por dislocación cervical, apegados a lo que establece la normatividad internacional, para evitar el sufrimiento animal (^{EMEA 2009}, ^{FDA 2014}). Los tejidos se obtuvieron mediante disección con bisturí de acero inoxidable.

Se realizó una mezcla de cada grupo de tejidos para su molienda y posteriormente proceder a su descomposición. Los materiales utilizados fueron previamente lavados y desmineralizados tal y como lo establece la normatividad vigente en México (^{CENAM-EMA 2012}).

Descomposición de las muestras de tejidos de ratas Sprague-Dawley fortificadas con aluminio, testigos y del material de referencia certificado (NIST 1566b)

Los tejidos de rata, al igual que el alimento, el agua de beber y el material de referencia certificado (tejido de ostión NIST-1566b) se digirieron en un equipo de horno de microondas MARSxpress 5 (CEM Corporation, Mathews, NC, EUA) (^{CEM 2014}). Para ello, se pesaron por triplicado en tubos de teflón de 20.0 × 4.0 cm, 0.500 ± 0.05 g de mama, hígado, hueso y cerebro, así como alimento, agua de beber y tejido de ostión como controles.

A estas muestras se les agregaron 10 mL de estándar de Al de 1000 mg/L (Accustandard) y se digirieron con 10 mL de HNO₃ concentrado (J.T.Baker) en horno de microondas MARSxpress 5 con un programa de digestión de 200 ºC/35 bar/1600 W/15 min. El extracto ácido resultante se aforó a 100 mL con agua desionizada.

Para EAA por horno de grafito se pesaron 0.250 ± 0.025 g de los mismos tejidos de rata, así como alimento y agua de beber. A estas muestras se les agregó 1 mL de estándar de Al de 10 mg/L y se digirieron con 5 mL de HNO₃ concentrado (J.T.Baker) en horno de microondas MARSxpress 5, con las mismas condiciones de digestión señaladas.

El residuo ácido resultante se aforó con 50 mL con agua desionizada. La concentración de Al se cuantificó mediante EAA-F y EAA-HG. Para flama se utilizó KCl al 0.2 % para eliminar la interferencia de ionización, y para horno de grafito se utilizó Mg(NO₃)₂ al 0.2 % como modificador químico. En esta etapa se evaluó la exactitud a través del porcentaje de recuperación (% Rec) y la precisión a través del porcentaje del coeficiente de variación (% CV).

Adicionalmente se prepararon tres réplicas de blancos de digestión con agua desionizada digeridas en horno de microondas en las mismas condiciones de operación que las muestras y los testigos, acondicionadas con HNO₃ al 2 % y KCl al 0.2 % para EAA-F, en tanto que para EAA-HG se acondicionaron con HNO₃ al 2 % y Mg(NO₃)₂ al 0.2 % (^{Perkin Elmer 2012}).

Validación del método

Linealidad. El proceso de validación del método analítico se valoró en primera instancia a partir de la linealidad, la cual se evaluó para EAA por flama y horno de grafito. En la figura 1 se puede apreciar que el coeficiente de correlación (r) fue de 1.000, lo cual indica que la asociación entre concentración de Al y absorbancia es muy estrecha para las concentraciones de 10, 20, 50, 100 y 200 mg/L, en la variante analítica de EAA-F.

Fig. 1 Curva de calibración para Al cuantificado por espectroscopia de absorción atómica por flama (mg/L), n = 15 

En la figura 2 se muestra que la linealidad mediante coeficiente de correlación (r) fue de 0.9993 para la variante analítica de EAA-HG. Ambas pendientes (m) tienen el mismo valor de 0.004. Estos resultados indican que este parámetro analítico es aceptable, ya que el criterio de aceptación es de r ≥ 0.995 (^{Thompson et al. 2002}).

Fig. 2 Curva de calibración para Al cuantificado por espectroscopia de absorción atómica por horno de grafito (µg/L), n = 15 

Los resultados obtenidos para la linealidad son similares a los obtenidos por otros investigadores en el proceso de validación de un método para la cuantificación de Al como adyuvante en vacunas, cuantificado por EAA-F (^{Mishra et al. 2007}).

El resultado para linealidad también es similar al obtenido por otros investigadores, quienes evaluaron cuatro métodos diferentes para la digestión de tejido de ratones albinos Swiss y posterior cuantificación de Al mediante EAA-HG (^{Bohrer et al. 2003}).

En otro trabajo de investigación, ^{Correia et al. 2006} validaron un método analítico para determinar Al, cobre y plomo en uvas mediante EAA-HG (^{Correia et al. 2006}). Sin embargo, no evaluaron la linealidad mediante el coeficiente de correlación, sino que establecieron el rango de linealidad para Al. Éste fue de 1.1 a 50 µg/L, a diferencia de nuestro trabajo, en el cual se estableció entre 20 y 100 µg/L de Al.

Exactitud y precisión. En el cuadro II se muestran los resultados obtenidos para exactitud y precisión en ambos métodos. Se puede apreciar que la exactitud evaluada mediante el % Rec fue de 100.62 y 97.75 para EAA por flama y horno de grafito, respectivamente. En tanto que la precisión evaluada mediante el % CV fue de 0.610 y 1.301 para EAA por flama y horno de grafito, respectivamente.

Los resultados obtenidos se consideran aceptables, ya que el criterio de aceptación para exactitud es de 100 ± 5 % respecto del porcentaje de recuperación cuando se utiliza un material de referencia certificado (CRM-S-B) y el criterio de aceptación para la precisión es % CV ≤ 2 para métodos instrumentales (^{ISO 1994}, ^{Thompson et al. 2002}).

Los resultados obtenidos para exactitud y precisión son similares a los obtenidos por otros investigadores (^{Mishra et al. 2007}) para Al en vacunas (% Rec de 93.26 a 103.41 y % CV de 1.62). Estos resultados son similares a los obtenidos durante la validación del método para cuantificar Cu y otros metales (entre ellos Al) en frutos del olivo (aceituna) mediante EAA-HG, con % Rec mayores de 95 y coeficientes de variación instrumental de 3 % (^{Soares et al. 2006}).

Repetibilidad. La precisión también se evaluó en condiciones de repetibilidad, realizada en las mismas condiciones de trabajo (el mismo analista, el mismo equipo, tiempos cortos) (^{Liang et al. 2013}). Los resultados obtenidos se muestran en el cuadro III, donde puede apreciarse que el método es repetible para las tres concentraciones de Al determinado por EAA-F y para las tres concentraciones de Al determinado mediante EAA-HG, con un nivel de significancia del 5 % (α = 0.05) y para n = 25. Estos resultados de repetibilidad son similares a los obtenidos durante la validación del método para determinar la concentración de Al en uvas (^{Correia et al. 2006}).

Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC). Los resultados obtenidos respecto de estas variables para Al determinado por EAA-F fueron de 0.06 y 0.19 mg/L de Al y de 0.05 y 0.18 µg/L de Al determinado por EAA-HG. Estos resultados son menores que los reportados para Al como adyuvante en vacunas determinado por EAA-F (LD = 0.23 mg/L y LC = 1.11 mg/L) (^{Mishra et al. 2007}), y también menores que los reportados en trabajos previos por ^{Correia et al. (2006)} y ^{Soares et al. (2006)} (LD = 1.11 µg/L y LC = 3.70 µg/L de Al determinado por EAA-HG).

Material de referencia certificado. Ya que no fue posible utilizar un material de referencia certificado de tejido de ratas, el proceso de validación del método se realizó utilizando un material de referencia certificado de tejido de ostión (NIST-1566b) que tiene una concentración de Al de 197.2 ± 6 mg de Al/kg de tejido.

Los resultados obtenidos para la exactitud a través del % Rec fueron de 100.60 para EAA-F y de 100.51 para EAA-HG (Cuadro IV). El criterio de aceptación para un material de referencia certificado es de 100 ± 5 % (^{CENAM-EMA 2012}). Estos resultados representan un valor muy cercano al 100 % y constituyen un rango más estrecho respecto a los resultados obtenidos por ^{Correia et al. (2006)} al utilizar hojas de espinaca (NIST-1570a) como material de referencia certificado en sustitución de las uvas, cuyo porcentaje de recuperación fue del 97 % para Al.

No obstante, ^{Bohrer et al. (2003)} reportan valores de recuperación del 89 al 121 % (105 ± 16) para Al utilizando hígado de pollo como material de referencia certificado en sustitución de tejido de ratón albino Swiss.

Aplicabilidad del método validado

El método validado se utilizó en tejidos de rata (mama, hígado, hueso y cerebro), agua de beber y alimento para ratas sin fortificar y fortificado con 100 mg/L de estándar de Al. Los tejidos de rata Sprague Dawley, agua de beber y alimento para ratas fueron digeridos en horno de microondas.

Los resultados obtenidos se muestran en el cuadro IV. Como se puede apreciar, los porcentajes de recuperación de Al en los diferentes tejidos de rata, alimento, agua y controles se encuentran dentro del rango recomendado de 100 ± 15 % (^{CENAM-EMA 2012}). Es importante mencionar que no se detectó presencia de Al en los blancos de digestión para EAA-F.

Consideraciones adicionales

Una vez que se ha validado un método analítico y se ha demostrado su aplicabilidad (^{González y Herrador 2007}), la normatividad internacional establece que es necesario estimar la incertidumbre para darle plena confiabilidad a los resultados obtenidos (^{ISO 2005}). Si bien hay una gran cantidad de artículos científicos relacionados con diversas metodologías analíticas para cuantificar Al en diferentes tipos de tejidos de animales de experimentación o en humanos, la mayoría no realizan o no consideran el proceso de validación del método empleado.

En la literatura científica hay pocos trabajos enfocados a este proceso de validación, y son menos aun los que estiman la incertidumbre después de validar el método analítico (^{Krouwer 2003}, ^{Theodorsson 2012}). En este sentido, continuaremos el proceso analítico de esta metodología validada y en trabajos futuros presentaremos los datos relacionados con la estimación de la incertidumbre.