INTRODUCCIÓN

El suelo es uno de ambientes naturales donde proliferan los microorganismos, particularmente las bacterias, que constituyen comunidades extremadamente complejas de elevada diversidad biológica. Las bacterias de una misma especie conforman poblaciones y la interacción de poblaciones de diferentes especies provoca un equilibrio que asegura una relativa constancia de la microbiota (^{Black 2012}).

La interacción de elementos abióticos y la microbiota mantiene las características deseables de los suelos para sustentar labores agrícolas, agropecuarias y muchas otras (^{Gadd 2010}).

Mediante diferentes actividades antrópicas, se descargan usualmente elevadas cantidades de sustancias perjudiciales en los suelos que no pueden ser degradadas o modificadas en tiempos adecuados por la población microbiana, alterando el equilibrio natural de la microbiota. En consecuencia, ocurre una acumulación de dichas sustancias en los suelos, las cuales contaminan el medio ambiente y ejercen efectos negativos sobre las poblaciones microbianas. Esto ocasiona la disminución masiva de muchas poblaciones bacterianas, de las cuales sobrevive un número reducido, o bien elimina una gran proporción de las especies de estas comunidades. Así los suelos contaminados presentan muy baja diversidad biológica y reducida biomasa bacteriana (^{Smets et al. 2003}, ^{Piotrowska-Seget et al. 2005}, ^{Silver y Phung 2005}, ^{Bozo et al. 2007}, ^{Dell’Amico et al. 2008}).

Adicionalmente, estas condiciones de estrés provocan cambios fisiológicos en las bacterias que impiden su proliferación (^{McDougald et al. 1998}, ^{Couter 2003}, ^{Darcan et al. 2009}, ^{Cortez et al. 2013}).

Los metales, cuya escoria es generada por actividades siderúrgicas, galvanización, minería, curtiembre de pieles y cueros, entre otras, al ser descargados y superar niveles críticos contaminan los ambientes naturales, fundamentalmente suelos y aguas, modificando la microbiota -incluyendo la bacteriana-, lo cual a posteriori modifica negativamente las características químicas y fisicoquímicas de los ecosistemas (^{Torsvik y Ǿvreas 2002}).

En este trabajo se determinan parámetros bioquímicos (contenido de materia orgánica total, actividad ureásica, respiración basal y biomasa microbiana) y biológicos (carga y diversidad bacteriana) en muestras de suelos con bajas concentraciones de metales, consideradas permisibles según las normas para el control de la recuperación de materiales peligrosos y el manejo de los desechos peligrosos de la legislación venezolana vigente (^{Decreto 2635, Gaceta Oficial 1998})

Adicionalmente, se identifican a nivel de género algunas de las cepas bacterianas aisladas del suelo impactado, se determina la resistencia y las concentraciones mínimas inhibitorias para níquel y cromo trivalente y hexavalente.

Con los resultados obtenidos en este trabajo, se pretende dar una voz de alerta a los entes encargados de generar normativas ambientales en Venezuela, de tal manera que se puedan proponer cambios adecuados que eviten la modificación de la microbiota del suelo en cuanto a su diversidad y cantidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis bioquímico de muestras de suelo

Las muestras de suelo se procesaron y sometieron a determinaciones de porcentaje de carbono orgánico total (COT), respiración basal (RB), actividad ureásica (AU), biomasa microbiana (BM) y carga bacteriana (CB). De cada muestra se efectuaron tres réplicas, efectuándose 27 ensayos de muestras contaminadas y tres de la muestra testigo.

Contenido de carbono orgánico total (COT)

Se empleó el método de ^{Wallinga et al. (1992)}, para lo cual se pesaron 0.5 g de suelo y se sometieron a oxidación vía húmeda con K₂CrO₄ y H₂SO₄ concentrado; tras 24 h en reposo se centrifugaron a 3000 rpm y el sobrenadante se analizó mediante espectrofotometría a 660 nm. La cuantificación se realizó por medio de una curva de calibración con sacarosa (0.1-0.4 mg C/mL), analizándose 1 mL del sobrenadante obtenido (25 mL). El contenido se expresó en g C/100 g de suelo seco.

Respiración basal (RB)

Se siguió el método descrito por ^{Anderson (1982)}, colocando 30 g de suelo en recipientes cerrados con un vial plástico con 15 mL de NaOH 0.1 M, para capturar el CO₂ generado en oscuridad y a temperatura ambiente. El CO₂ se determinó por titulación con HCl 0.1 M, previa precipitación con BaCl₂ 0.05 M. La tasa respiratoria se expresó en mg CO₂/kg de suelo × h calculados mediante la ecuación 1.

(1)

Donde a es el volumen de HCl gastado en el blanco (mL); b es el volumen de HCl gastado en la muestra (mL); CH _Cl es la concentración exacta de HCl (mol/L); FC incluye los factores de conversión estequiométricos y de unidades (mg × g × L/ kg × mL × mol); ms es la masa de suelo seco (g), y t el tiempo (h).

Actividad ureásica (AU)

Se empleó el método de ^{Kandeler y Gerber (1988)}, para lo cual se procesó 1 g de suelo con 0.5 mL de urea y se incubaron a 37 ºC durante 2 h. Luego se adicionaron 10.0 mL de una solución de KCl-HCl, se agitaron todas las muestras por 30 min y se centrifugaron a 2500 rpm por 10 min.

Una alícuota de 1 mL (de un total de 11 mL) se sometió a la determinación de amonio mediante reacción con una solución de salicilato/hidróxido y 2 mL de medio de oxidación, determinándose la absorbancia a 600 nm. Se construyó una curva de calibración con contenido de 5-25 µg de N (amonio). La actividad se expresó en µg N/g × h.

Biomasa microbiana (BM)

Se siguió el método de ^{Anderson y Domsch (1978)}, se procesaron 30 g de suelo en presencia de 120 g de glucosa y un vial con NaOH 0.1 M. Después de 6 h de incubación en oscuridad, el CO₂ producido se tituló con HCl 0.1 M según lo establecido para la determinación de la respiración basal.

La BM se expresó en mg C/100 g con la relación Y = 40.04 X + 0.37, donde Y es la BM y X la respiración basal (mL CO₂/100 g). Para la conversión de la tasa respiratoria (mg CO₂) a mL de CO₂ se empleó el siguiente factor de conversión: 0.4908 mg C - CO₂ = 1.7995 mg CO₂ = 1 mL CO₂ a 25 ºC.

Carga bacteriana (CB)

En 9 mL de NaCl 0.8 % (p/v) se suspendió 1 g de suelo, preparando diluciones seriadas (10^-2, 10^-3 y 10^-4), de las cuales se sembraron por profundidad alícuotas de 0.1 mL en ALB suplementado con un 1 g/L de antimicótico (fluconazol®, Genven). Las placas se incubaron durante 24 h a 33 ºC y se determinaron las unidades formadoras de colonias (UFC/g) en un contador de colonias. Para estas determinaciones se tomaron muestras en las estaciones de lluvia (mayo) y sequía (enero).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados correspondientes a los parámetros bioquímicos de las muestras de suelo impactado y testigo se detallan en el cuadro I.

El contenido de COT presentó valores muy bajos en los tres sectores impactados con metales, con un valor promedio de 0.436 g C/100 g de suelo seco (0.158 a 0.883 g C/100 g). Al compararlo con el valor de la muestra testigo (1.420 g C/100 g) se estableció una reducción de 70 % ([1 - 0.436/1.420] ×100).

La AU también fue menor en los tres sectores estudiados, mostrando un valor promedio de 4.902 µg N/g x h (3.081 a 6.032 µg N/g × h), mientras que el testigo se ubicó en 10.508 µg N/g × h; el descenso alcanzó 54 % ([1 - 4.902/10.508] × 100).

La RB presentó promedios de 8.226 y 9.910 mg CO₂/kg × h para las muestras impactadas y testigo, respectivamente, con una disminución del 17 % ([1 - 8.23/9.81] × 100), la cual no es estadísticamente significativa.

La BM mostró un promedio en las muestras impactadas de 12.087 mg C/100 g (0.333 a 28.481 mg C/100 g), y en el testigo de 22.789 mg C/100 g; la disminución se calculó en 47 % ([1 - 12.087/22.789] × 100).

En conjunto estos resultados indicaron, de acuerdo con el análisis de varianza, disminuciones estadísticamente significativas para COT, AU y BM, y no significativas para RB. El COT y la AU son parámetros relacionados con los ciclos biogeoquímicos del C y N, elementos fundamentales para los procesos vitales en seres vivos.

La reducción en el COT implica carencia de moléculas orgánicas en el suelo impactado y la disminución de la AU indica una baja producción de N reducido (amonio). Ambos compuestos son utilizados por la microbiota como fuentes energéticas y moléculas precursoras para la síntesis de biomoléculas necesarias para la conformación de estructuras celulares, enzimas, coenzimas y funciones celulares típicas.

La reducción en la BM, que no puede incrementarse por falta de nutrientes, parece corroborar esta situación. Aunque la RB no sufrió una afectación significativa, debe considerarse que al disminuir la BM en un 47 % en las muestras impactadas con metales, la actividad respiratoria de la microbiota debería incrementarse.

En efecto, el cociente RB/BM en estas muestras fue de 0.68 (8.226/12.087) y en el testigo de 0.43 (9.910/22.789), lo cual indica que la actividad respiratoria de la biomasa en muestras que contenían metales a concentraciones permisibles fue 1.58 (0.68/0.43) veces mayor respecto al sistema testigo, lo cual demuestra la presencia de una condición de estrés microbiano.

Adicionalmente, los cocientes COT/BM en muestras impactadas y testigo fueron de 0.036 (0.436/12.087) y 0.062 (1.420/22.789), respectivamente, lo cual indica que la microbiota en el testigo dispone de 1.7 veces (0.062/0.036) más material carbonado que las muestras impactadas. Esta situación confirma la disminución del COT en las muestras que contienen metales y una RB aparentemente normal en ambas muestras.

En la literatura se ha reportado el establecimiento de situaciones que alteran las poblaciones bacterianas en suelos contaminados por metales y produce estrés oxidativo (^{Fontanetti et al. 2011}, ^{Lemire et al. 2013}, ^{Sulmon et al. 2015}). Dicho estrés implica un incremento en la síntesis de enzimas antioxidantes (óxido dismutasas, catalasas, peroxidasas, glutatión peroxidasas), proteínas queladoras de metales, metalotioninas, (^{Bozo et al. 2007}, ^{Sulmon et al. 2015}) y sideróforos (^{Lemire et al. 2013}).

Tales estrategias de emergencia requieren de fuentes energéticas para reponer el estado homeostático de la célula (^{Sulmon et al. 2015}). En consecuencia, la energía proviene de la oxidación de moléculas carbonadas presentes en el hábitat donde proliferan los organismos, en este caso particular del suelo.

Los resultados correspondientes a la CB se muestran en el cuadro II. Se observó, para las muestras de ambas estaciones (lluviosa y de sequía) un incremento de la densidad bacteriana (UFC/g) a medida que el sector analizado se aleja de la planta de producción. Este incremento, podría indicar una menor concentración de metales en zonas más retiradas del punto de impacto de la actividad metalúrgica. Una situación similar se reportó al detectarse disminuciones en las concentraciones de Zn, Al, Pb y Cd, en líquenes, conforme las muestras se alejaban de una carretera por donde se transportaba el mineral proveniente de una mina (^{Holt y Miller 2010}).

Para la estación lluviosa los valores de CB se incrementaron desde 1.22 × 10⁵ hasta 9.94 × 10⁵ UFC/g en las secciones 1 y 3, respectivamente. El testigo mostró valores de 39.8 × 10⁵ UFC/g. El promedio en las secciones impactadas fue de 6.65 × 10⁵ UFC/g que, al compararse con el testigo, indicaron un 83% de disminución de la carga bacteriana.

En el caso de la estación seca, el promedio de CB en las secciones impactadas fue de 1.73 × 10⁵ UFC/g, con una variación de 0.63 a 4.08 × 10⁵ UFC/g, en tanto que el valor del testigo fue de 2.51 × 10⁵ UFC/g y la disminución se calculó en 30 %.

Los resultados de la CB en ambas estaciones se correlacionan bien con la disminución referida de la BM en los sectores impactados. La diferencia en los valores de las muestras testigo se debe a la disponibilidad de agua, la cual es fundamental para la proliferación bacteriana. En general, la CB en la estación lluviosa siempre fue mayor en todos los sectores al compararse con los valores de la estación seca.

Si bien en la estación lluviosa se obtuvieron los valores más altos de CB, es contrastante que la mayor reducción en este parámetro se detectó en esta época. Esto puede deberse a una mayor disponibilidad de los metales para la población bacteriana, debida a la solubilización inducida por los niveles de agua relativamente altos presentes en el terreno, lo cual está restringido en terrenos más secos.

Como era de esperarse, hubo variabilidad en la morfología macroscópica de las colonias bacterianas aisladas de las muestras de suelo contaminado y cultivadas en AR, las cuales se diferenciaron con base en su forma, elevación, borde, tamaño y color (resultados no mostrados). Sin embargo, luego de una minuciosa observación sólo se lograron detectar 12 morfotipos bacterianos diferentes, que se denominaron cepas MT1 a la MT12.

Es notorio el bajo nivel de diversidad biológica en las muestras de suelo, lo cual ha sido reportado por otros investigadores (^{Smets et al. 2003}, ^{Bozo et al. 2007}).

Aunque se ha reportado que sólo 0.1 a 1 % de la población microbiana puede detectarse en muestras ambientales mediante técnicas clásicas de cultivo in vitro (^{Malik et al. 2008}), actualmente se efectúan intentos para mejorar estos porcentajes de detección (^{Tanaka 2014}). No obstante, se ha sugerido que la carga bacteriana podría superar el billón de organismos por gramo de suelo pertenecientes a más de mil diferentes especies (^{Torsvik y Ǿvreas 2002}).

Como es sabido, en la actualidad existen técnicas moleculares (mediante la identificación del gen ARNr16S) y bioquímicas (perfil de ácidos grasos metil esterificados, entre otras) que permiten evaluar la diversidad de microorganismos cultivables y no cultivables de una manera más exhaustiva (^{Malik et al. 2008}). Sin embargo, este trabajo sólo pretende mostrar los cambios en la diversidad de las bacterias cultivables, asociados con la presencia de metales en concentraciones que se estiman permisibles según la legislación venezolana.

Con base en la capacidad proliferativa de las 12 cepas aisladas, y por consideraciones logísticas, sólo cinco de ellas se sometieron a los protocolos de identificación a nivel de género: las cepas MT1, MT4, MT5, MT6 y MT11. En el cuadro III se indican los resultados de las pruebas bioquímicas, observaciones al microscopio de luz y su identificación taxonómica. Se asignaron las denominaciones MT1 al género Rhotia, MT4 a Vibrio, MT5 a Klebsiella, MT6 a Acinetobacter y MT11 a Raoultella.

La identificación de los géneros bacterianos se efectuó luego del análisis de las 23 pruebas (bioquímicas, fisiológicas y morfológicas) realizadas y tomando como referencia publicaciones especializadas en la identificación bacteriana (^{Forbes et al. 2004}, ^{Win et al. 2008}). Es claro que no se indican especies, pero la asignación de géneros es totalmente válida.

Las cinco cepas bacterianas caracterizadas fueron sometidas a análisis de sensibilidad en medios AR con contenido de metales mediante la técnica de difusión en placa (^{Abskharon et al. 2008}). Un halo de inhibición menor a 20 mm se consideró como capacidad de resistencia al metal (^{Schmidt y Schlegel 1989}).

Todas las cepas fueron sensibles a cobalto (halos de inhibición superiores a 20 mm) y el sodio no ejerció efectos negativos sobre ellas (se incluyó como testigo de la prueba). Todas las cepas mostraron resistencia al Ni²⁺, Cr³⁺ y Cr⁶⁺; al respecto, el níquel y el cromo, junto con el cobre y cadmio, son los metales más comúnmente reportados como contaminantes del medio ambiente (^{Alboghobeish et al. 2014}).

La inspección de los halos de inhibición indicó variabilidad en la resistencia a los metales (Cuadro IV), siendo los correspondientes a la cepa MT6 los de menor diámetro (iguales o menores a 15 mm), lo que indicó la más alta capacidad de resistencia en Acinetobacter sp. Consecuentemente, para la ejecución del diseño experimental factorial 33 se empleó Acinetobacter. Los datos obtenidos se presentan como gráficas de superficies de respuesta a Ni²⁺, Cr³⁺ y Cr⁶⁺ en la figura 1.

Fig. 1 Superficie de respuesta para el crecimiento bacteriano en función del pH y la concentración de: (a) Ni⁺², (b) Cr⁺³ y (c) Cr⁺⁶ 

La disminución de la densidad óptica (DO) -medida de proliferación de la población bacteriana- es evidente al incrementar la concentración del metal, alcanzándose los niveles más bajos y con poca variabilidad en concentraciones superiores a 5.0 mM. Resultados similares se obtuvieron al variar el pH del medio de 9.0 a 6.0.

Al comparar las variaciones de la DO detectadas con la variación de la concentración del metal y la de pH, se puede concluir que la concentración de metal es el factor preponderante en la capacidad proliferativa de la cepa bacteriana, ya que las mayores variaciones en la DO se obtuvieron al variar la concentración del metal.

El análisis de varianza indicó que la concentración de metal y el pH, más la interacción de ambos parámetros, tuvieron una influencia significativa en el crecimiento bacteriano, al establecer un valor de p crítico < 0.05. Esto se corroboró mediante un diagrama de Pareto en que los parámetros ya mencionados presentaron valores críticos de p > 2.0 (datos no mostrados).

Es importante señalar que a pH superiores a 6-7 la disponibilidad del Cr³⁺ y Ni²⁺ disminuye considerablemente debido a la formación de sus respectivos hidróxidos insolubles, lo que reduce la concentración activa de estos metales en las condiciones experimentales usadas en las determinaciones.

Una limitación de nuestros datos es que no se han tomado en consideración aspectos físicos y químicos del suelo que podrían influir en la biodisponibilidad de los metales, tales como capacidad intercambiadora de cationes, aniones quelantes de metales y fuerza iónica del suelo (^{Lemire et al. 2013}).

Adicionalmente, las gráficas de superficie de respuesta (Fig. 1) pueden sugerir que las concentraciones mínimas de los metales ensayados a las que se inhibió la capacidad de duplicación de los cultivos bacterianos (variación de absorbancia cero) estarían ubicadas en el intervalo de 5-7 mM. Datos de otros laboratorios reportan valores de concentraciones mínimas inhibitorias de 3-5 mM Ni (^{Bhadra et al. 2006}) y 3-4 mM Cr (^{Essahale et al. 2012}) para diferentes cepas de Acinetobacter. Valores de 2.7, 3.4, 13.6 y 54.5 mM para Ni y 1.9, 3.8 y 7.7 mM para Cr han sido reportados para diferentes cepas de los géneros Pseudomonas y Alcaligenes (^{Moraga et al. 2003}).

Respecto de los cinco géneros bacterianos identificados en este estudio, otros autores han reportado previamente resistencia a metales y la dependencia de ésta a la presencia de plásmidos para Vibrio (^{Zhang et al. 2012}), Klebsiella (^{Matasaje et al. 2011}), Acinetobacter (^{Essahale et al. 2012}) y Raoultella (^{Sun et al. 2015}). No obstante, la dualidad resistencia a metales/plásmido no siempre se cumple. En un caso reportado para Pb la resistencia al metal fue asignada a genes cromosomales, aun determinándose resistencia a otros metales en plásmidos contenidos en la misma cepa bacteriana (^{Aktan et al. 2013}).

Es importante señalar la baja diversidad bacteriana detectada en el suelo analizado. De acuerdo con los artículos 49 y 50 del decreto 2635 de la legislación venezolana, que establece valores permisibles para residuos sólidos empleando prácticas de confinamiento en suelos, los niveles máximos de cromo total son de 500 mg/kg, en tanto que para lixiviados se establecen 5 mg/L para Cr+6 y Ni+2 (anexo D de dicho decreto), equivalentes a 96 y 85 µM, respectivamente (^{Gaceta Oficial 1998}).

Evaluacionesrealizadas por nuestro grupo han determinado que los niveles disponibles de estos dos metales en el suelo estudiado ([Cr+6] = 1.73 mg/kg, [Ni+2] = 1.25 mg/kg) no superan los niveles establecidos por la normativa ambiental, lo cual indicarían que los suelos no están contaminados (^{Sánchez 2012}). No obstante, la evaluación de los parámetros bioquímicos determinados en este estudio (COT, AU y BM) arrojó valores estadística y significativamente disminuidos, al compararse con los obtenidos en el área control. Adicionalmente, la biodiversidad y carga bacterianas estuvieron seriamente disminuidas.

Es relevante mencionar que se ha reportado en la literatura que bajas concentraciones, consideradas no perjudiciales, de sustancias tóxicas pueden ejercer efectos estimulatorios beneficiosos en organismos de diferentes taxa, desde bacterias a plantas y metazoos (^{Costantini et al. 2010}, ^{Sulmon et al. 2015}), fenómeno denominado hormesis.

De hecho, las cepas bacterianas aisladas constituyen una subpoblación aclimatada a bajas concentraciones de metales, aunque la mayor parte de la microbiota se redujo drásticamente en términos de especies y carga bacteriana. Debido a esta situación, los efectos de tales concentraciones de metales y cambios en la microbiota sobre la capacidad de dichos suelos para sustentar labores agropecuarias -es decir, sobre la salud del suelo- resultan impredecibles.

En concordancia con estos resultados, la macrobiota vegetal en la parcela impactada es casi inexistente, si se le compara con la parcela testigo, y el aspecto general de la tierra (color, textura, granulosidad) también muestra diferencias.

Parece pertinente que los niveles permisibles de metales en suelos deberían evaluarse nuevamente, ya que la evidencia experimental presentada en este trabajo es indicativa de que, aun con niveles de metales “relativamente bajos”, las propiedades biológicas y bioquímicas del suelo se alteraron negativamente. Por tanto, la biodiversidad y biomasa bacterianas deberían considerarse e incluirse en la legislación como bioindicadores de contaminación en suelos. Esto redundará en una mejor calidad de vida para la sociedad y en el aseguramiento de la sustentabilidad de los ambientes naturales.

Estudios de esta naturaleza constituyen voces de alerta que deberían tomar en cuenta los entes oficiales encargados de garantizar las condiciones físicas, químicas, bioquímicas y biológicas de los ecosistemas.

CONCLUSIONES

Los parámetros bioquímicos (porcentaje de COT, AU y BM) no disminuyeron estadísticamente y la RB no se afectó estadísticamente. Sin embargo, el cociente RB/BM fue elevado respecto al suelo testigo, lo cual indica empobrecimiento del material orgánico en el suelo impactado con metales y como resultado afectación de la salud del suelo.

La diversidad y carga bacterianas medidos en los suelos fueron bajos, con valores de pH 9.0 y concentraciones de metales consideradas como permisibles por la legislación venezolana vigente.

Se aislaron únicamente 12 morfotipos diferentes y se asignaron cinco de ellos a los géneros Rhotia, Vibrio, Klebsiella, Acinetobacter y Raoultella. La carga bacteriana disminuyó en 80 y 30 % en las estaciones lluviosa y de sequía, respectivamente, al compararse con el suelo testigo.

Estos datos experimentales permiten aseverar que bajas concentraciones de metales, aun consideradas permisibles, alteran negativamente la calidad de los suelos.