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INTRODUCCIÓN
La contaminación de los suelos por los hidrocarburos de petróleo es uno de los principales objetivos en el desarrollo de tecnologías de remediación debido a los pasivos ambientales que se generan durante las actividades de exploración, producción, transporte y refinación, y los daños que producen a los ecosistemas y al hombre (Infante et al. 2012). En Venezuela se ha empleado la tecnología de biorremediación para recuperar suelos contaminados y tratar grandes cantidades de desechos (Infante et al. 2010). Esta técnica se basa en la estimulación de la actividad microbiana para disminuir o suprimir las fracciones tóxicas de los hidrocarburos (García et al. 2012).
La eficiencia de la biorremediación depende no sólo de la presencia en el suelo de microorganismos con capacidad de biodegradar los hidrocarburos, sino también de condiciones físicas y químicas adecuadas en los suelos, especialmente las condiciones nutricionales que permitan la proliferación y mantenimiento en el tiempo de estos microorganismos, pues nutrientes tales como el fósforo y el nitrógeno, tienden a ser limitantes para la actividad microbiana, afectando el proceso de biodegradación (Das y Chandran 2011).
Los hidrocarburos en el ambiente son biodegradados principalmente por bacterias, levaduras y hongos. En tal sentido, se ha indicado que la eficiencia de biodegradación de estos compuestos está en el intervalo de 6 % a 82 % para los hongos y hasta un 50 % para las bacterias (Pinholt et al. 1979, Das y Chandran 2011). Venezuela cuenta con grandes reservas de petróleo que se encuentran en áreas donde predominan sabanas, en consecuencia son altos los riesgos de degradación de estos ecosistemas por derrames y disposición inadecuada de hidrocarburos. Ello a su vez justifica las investigaciones sobre el efecto de este tipo de contingencias ambientales sobre la actividad microbiana del suelo, pues la estructura funcional de comunidades microbianas basada en las características metabólicas de los microorganismos como respuesta de su expresión genética, ha sido ampliamente utilizada como indicador biológico debido a su capacidad de proveer información integrando diversos factores ambientales (Zamora et al. 2012a). Así, la diversidad funcional comprende el conjunto de capacidades metabólicas presentes en un ambiente y aun cuando no requiere de conocimientos detallados acerca de la identidad de los microorganismos involucrados, expresa su actividad dentro del ecosistema (Zak et al. 1994), con la ventaja que puede cuantificarse a través de índices, permitiendo comparar diferentes comunidades o la misma comunidad en el tiempo (Zamora et al. 2012b).
Con base en lo antes expuesto, este trabajo se orientó a evaluar los cambios en la actividad de las comunidades microbianas de un suelo de sabana contaminado con un crudo mediano luego de 120 d de tratamiento y las condiciones para mejorar la biodegradación del hidrocarburo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
El suelo para el ensayo provino de los primeros 15 cm del perfil del horizonte superficial de un Typic Paleustults, franco arenoso, pH de 6.36 (1:1 en agua) y bajos contenidos de N (1.17 %) y P disponible (0.38 ppm), procedente de Santa Bárbara, estado Monagas, Venezuela, localidad en donde predominan ecosistemas de sabanas. El crudo utilizado fue un crudo reformulado mediano de 24.3 º de acuerdo con la clasificación del American Petroleum Institute (API), proveniente de una mezcla de un crudo pesado (Urdaneta de 19.1 º API) y un crudo liviano (Mesa de 29.9 º API). La composición del crudo fue de 36.2 % de saturados, 40.3 % de aromáticos, 19.4 % de resinas y 4.1 % de asfaltenos.
Se establecieron tres tratamientos:
i) Sin fertilización (SF): suelo contaminado con crudo al 9 % (m/m)
ii) Con fertilización (F): suelo contaminado con crudo al 9 % (m/m) y fertilizado al inicio del ensayo con fertilizante inorgánico comercial de nitrógeno-fósforo-potasio (NPK): 15:15:15 y hojarasca de mango (Mangifera indica) obtenidas en el área de muestreo. La dosis de fertilización fue de 1.73 g de NPK y 12.74 g de hojarasca seca por cada 1 kg de suelo contaminado. La cantidad de fertilizante agregado corresponde a las relaciones C:N 150:1 y N:P:K 4:1:1 recomendadas por Deuel y Holliday (1997). El fertilizante inorgánico aportó el 55 % del N y el 100 % de P y K, mientras que la hojarasca aportó el 45 % del N restante.
iii) Testigo abiótico (TA): suelo contaminado con crudo al 9 % (m/m), fertilizado de manera similar a F y esterilizado en autoclave (1 h, 121 ºC, 1.5 atm).
Cada tratamiento contó con tres réplicas que consistieron en bandejas con 4 kg de las mezclas. Los tratamientos fueron ubicados en un invernadero con temperatura promedio de 27 ºC, sometidos a riego (con agua destilada estéril) hasta 60 % de la capacidad de campo del suelo y aireados con rastrillo dos veces por semana durante 120 d. Para evaluar los cambios en las variables seleccionadas se tomaron muestras de cada réplica de los tratamientos al inicio y a los 120 d de iniciado el ensayo. Los análisis microbiológicos se realizaron inmediatamente, mientras que las muestras para los análisis químicos se refrigeraron (4 ºC) hasta su procesamiento en el laboratorio. Los análisis realizados fueron:
Contenido de aceites, grasas y biomarcadores
Los cambios en el contenido de hidrocarburos se estimaron a través de la determinación de la concentración de aceites y grasas, mediante el método 3540B (EPA 1994), utilizando un sistema de extracción Soxhlet y diclorometano como solvente. Para la extracción se tomaron 5 g de suelo y 200 mL de diclorometano, colocándose esta mezcla en el sistema de extracción Soxhlet durante 8 h en reflujo. Luego, se separó el extracto del solvente aplicándole rotavapor al balón. La masa de aceites y grasas se determinó por la diferencia de peso con el balón de destilación.
De los extractos obtenidos, así como del crudo utilizado, se separaron las fracciones de saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA) de acuerdo con el método 5520 (APHA 1998), usando un equipo Water 600 de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Para el estudio de los biomarcadores, la fracción de saturados fue analizada en un cromatógrafo de gases HP6890 con columna capilar de metil silicona y detector de ionización a la llama (FID, por sus siglas en inglés). La programación de temperatura durante la cromatografía fue de 8 ºC por min, la temperatura del detector se mantuvo en 360 ºC, la del inyector fue de 300 ºC y la columna de 70 a 340 ºC. Se obtuvieron los cromatogramas de los n-alcanos e isoprenoides pristano y fitano. A partir de las áreas se calcularon las relaciones de los biomarcadores con los hidrocarburos normales de 17 y 18 átomos de carbono para identificar procesos de biodegradación (Kaufman et al. 1990, Marteau et al. 2002).
Respiración basal
Se empleó el método de la trampa de álcali (Anderson e Ingram 1989). El CO2 producido por el suelo durante 24 h y absorbido por 5 mL de NaOH 0.1 N, se calculó a través de la titulación con HCl 0.1 N en presencia de fenolftaleína como indicador, previa precipitación del exceso de carbonatos con 5 mL de BaCl2 0.5 N.
Caracterización funcional de la comunidad microbiana
Se utilizaron ecoplacas Biolog® para determinar los patrones de utilización de sustratos orgánicos en la comunidad microbiana de cada tratamiento, utilizando una modificación del procedimiento de Glimm et al. (1997). Cada placa contenía 31 sustratos orgánicos diferentes y una celda blanco. Las fuentes de carbono incluyeron aminoácidos, carbohidratos, ácidos carboxílicos, polímeros y varios compuestos misceláneos (Cuadro I). La utilización de las fuentes de carbono fue medida a través de la reducción de cloruro de tetrazolio, un indicador redox que cambia de color de transparente a púrpura (Zak et al. 1994).
CUADRO I AGRUPACIONES GREMIALES DE FUENTES DE CARBONO DETERMINADAS EN LAS ECOPLACAS DE BIOLOG®
Fuente: Weber y Legge (2009)
Para la obtención de los inóculos microbianos que se utilizaron en esta prueba se colocaron 5 g de suelo de cada uno de los tratamientos en 45 mL de solución salina estéril (0.85 % de NaCl) y se agitó durante 1 h. La suspensión obtenida se diluyó en solución salina hasta 10-4. En cada celda de la ecoplaca se inoculó una alícuota de 150 µL y luego de 72 h de incubación se determinó la absorbancia a 595 nm de cada celda utilizando un fotómetro de microplacas (BioTek®). Se consideraron positivos aquellos valores de absorbancia por encima de 0.2 unidades (Garland y Mills 1991). Para los datos de absorbancia de BIOLOG® se calculó el promedio de desarrollo de color (AWCD, por sus siglas en inglés) para cada celda (Garland y Mills 1991, Glimm et al. 1997). El valor de absorbancia obtenido a las 48 h, fue dividido por el AWCD calculado, para eliminar la influencia de la densidad del inóculo en las placas. Asimismo, se determinaron la riqueza de sustratos (S) entendida como la variedad de sustratos que son aprovechados por la comunidad microbiana, la diversidad funcional (H’) de acuerdo con el índice de Shannon-Weaver (H = -Σpi lnpi;, donde pi es el valor de densidad óptica por cada sustrato) y la equidad catabólica (E) o el grado de preferencia hacia los diferentes sustratos (E = H / Hmax = H / log S) (Zak et al. 1994).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza de un factor para determinar las diferencias en el contenido de aceites y grasas y también se estimó la diversidad funcional en los diferentes tratamientos, tanto al inicio como al final del experimento. Se empleó la prueba de la diferencia honestamente significativa (HSD, por sus siglas en inglés) de Tukey para determinar diferencias estadísticamente significativas con α = 0.05 entre los tratamientos. Con la finalidad de determinar las diferencias de los perfiles fisiológicos entre las comunidades microbianas de los tratamientos, se realizó un análisis de componentes principales (ACP), con base en los valores de absorbancia ajustados. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa libre PAST 3.04 (Hammer y Harper 2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Contenido de hidrocarburos y efectividad de la biodegradación
El cuadro II muestra el contenido de aceites y grasas, así como la reducción del hidrocarburo al final de la incubación. El valor inicial de aceites y grasas fue de 8.8 %, lo que implica una recuperación del 98 %, que es satisfactorio. Luego de 120 d se observó una disminución en el contenido de aceites y grasas para cada tratamiento, siendo mayor en F, seguido de SF y menor en TA (p < 0.05). Este resultado evidencia el papel tanto de los microorganismos como del aporte de nutrientes en el proceso de descontaminación del suelo.
CUADRO II CONTENIDO DE ACEITES Y GRASAS Y REDUCCIÓN EN EL CONTENIDO DE HIDROCARBUROS (HC) ± DESVIACIÓN ESTÁNDAR EN CADA TRATAMIENTO EVALUADO
Letras distintas para el mismo parámetro indican diferencias significativas. TA = testigo abiótico, SF = sin fertilización, F = con fertilización
La tasa de descontaminación en el suelo fertilizado (37 %) fue muy similar a la obtenida por Mager y Hernández-Valencia (2013). Estos autores encontraron en un suelo contaminado al 3 % con crudo de 27.2º API, fertilizado y de similares características de textura al de este estudio, que luego de 120 d, el contenido de aceites y grasas se redujo en 39 %. Sin embargo, en el trabajo mencionado se usó apenas un tercio del crudo que se utilizó en este estudio, lo que implica un efecto tóxico menor sobre las comunidades microbianas. Adicionalmente, la fertilización fue fraccionada (0, 15, 30 y 45 d) y con fuentes inorgánicas solubles como urea y fosfato diamónico, de disponibilidad inmediata para los microorganismos. Por otra parte, el crudo utilizado en este estudio tiene mayor proporción de compuestos recalcitrantes como resinas y asfaltenos. Todos estos elementos apuntan sobre el papel de la hojarasca como fuente alternativa de carbono para los microorganismos, lo que contribuye a la descontaminación del suelo.
La comparación del contenido de aceites y grasas entre los tratamientos con fertilización (F) y sin fertilización (SF), evidencia la importancia de la adición de nutrientes, ya que incrementa el porcentaje de degradación en 13 %. Resultados similares fueron obtenidos por Atlas (1981) y García et al. (2012), quienes encontraron una mayor tasa de biodegradación en suelos fertilizados y aireados frecuentemente, respecto a otros que no presentaron esta condición. Por otra parte, cuando se comparan los valores de aceites y grasas entre TA y F y entre TA y SF, se deduce que los microorganismos contribuyen con un 37 y 32 %, respectivamente en la disminución del contenido de aceites y grasas. En F la mayor reducción del contenido de aceites y grasas no es sólo favorecida por la fertilización inorgánica, sino también podría estar asociada con la adición de hojarasca que mejora la estructura y aireación del suelo y en consecuencia, la actividad microbiana (Kauppi et al. 2011). En ese sentido, se ha demostrado que el contacto microorganismo-hidrocarburo es clave en el proceso de biorremediación (Andreas 2010). El uso de agentes estructurantes biodegradables, aumenta la retención de la humedad, reduce la lixiviación del hidrocarburo y mejora el contacto entre los microorganismos y el hidrocarburo (Garcia et al. 2012).
Los análisis cromatográficos de n-alcanos e isoprenoides mostrados en la figura 1, indican que la transformación del hidrocarburo en F es mayor respecto a SF, TA y a la muestra de crudo inalterada (testigo). Al respecto, el cálculo de las relaciones entre los isoprenoides respecto a los n-alcanos de 17 y 18 átomos de carbono, permite identificar estos procesos de transformación. Particularmente procesos de evaporación y biodegradación, así como la susceptibilidad de los hidrocarburos remanentes a la degradación (Cuadro III). El pristano y el fitano son resistentes a la biodegradación respecto a n-C17 y n-C18, que actúan como coeluyentes (Peters et al. 2005), por lo que las relaciones deben aumentar a medida que avanza el proceso de biodegradación.
Fig. 1 Descomposición de saturados determinada a través de cromatografía de gases para los distintos tratamientos al finalizar el período de incubación. A = muestra de crudo utilizado, B = testigo abiótico a los 120 d, C = sin fertilización a los 120 d, D = con fertilización a los 120 d
CUADRO III RELACIONES ENTRE ISOPRENOIDES Y N-ALCANOS EN LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS LUEGO DE 120 DÍAS
Testigo = muestra del crudo utilizado, TA = testigo abiótico, SF = sin fertilización, F = con fertilización, Pr = Pristano, F = Fitano, n-Cx = hidrocarburo normal de x átomos de carbono (n-alcanos)
Con base en lo anterior, se encontró que F presentó una relación Pr/n-C17 mayor respecto a los demás tratamientos y el testigo. Ello indica la biodegradación del hidrocarburo, mientras que en SF la relación Pr/n-C17 es cercana a la unidad, lo que señala un menor efecto de la biodegradación (Cuadro III). Este aspecto también se ve reflejado en las relaciones F/n-C18, en las cuales se observa la misma tendencia creciente asociada con procesos de biodegradación (Bonazountas y Kallidromitou 1993, García et al. 2012). Asimismo, la relación entre los hidrocarburos de cadena lineal n-C29/C17 permiten cuantificar en forma diferenciada la biodegradación y el fraccionamiento evaporativo (Marteau et al. 2002, Peters et al. 2005). Se observaron valores altos en cuanto a la relación n-C29/n-C17 en TA respecto a los demás tratamientos, lo que sugiere que podría estar asociado con la transformación del hidrocarburo por evaporación, que parece ser mayor en ausencia de actividad biológica (Cuadro III). La relación entre los isoprenoides y los n-alcanos obtenida para cada uno de los tratamientos, se muestra en la figura 2. Se pueden observar las diferentes transformaciones del hidrocarburo, resaltando que en F se presentó una mayor tasa de biodegradación respecto a SF y ello evidencia que la fertilización facilita la biodegradación del hidrocarburo, similar a lo observado por Infante et al. (2010).
Fig. 2 Comparación de las relaciones entre isoprenoides y n-alcanos de los hidrocarburos extraídos de los tratamientos. Pr = pristano, F = fitano, n-Cx = n-alcano de x átomos de carbono, Testigo = muestra de crudo utilizado, TA = testigo abiótico a los 120 d, SF = sin fertilización a los 120 d, F = con fertilización a los 120 d
Respuesta de la comunidad microbiana a los tratamientos
Los resultados del cuadro IV muestran que la respiración basal del suelo es similar en SF y F al inicio del experimento, e incrementa luego de 120 d de incubación (p < 0.05). Este resultado sugiere que luego de este periodo aún hay C mineralizable proveniente del hidrocarburo en SF y del hidrocarburo y la hojarasca en el caso de F. Adicionalmente, la respiración basal fue mayor en F respecto a SF (p < 0.05), hecho que reafirma el papel estimulador de la fertilización sobre la actividad microbiana. En TA no se detectó actividad microbiológica por haber sido esterilizado.
CUADRO IV RESPIRACIÓN BASAL ± DESVIACIÓN ESTÁNDAR EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS EVALUADOS
Letras distintas para el mismo parámetro indican diferencias significativas. TA = testigo abiótico, SF = sin fertilización, F = con fertilización, ND = no detectado
La figura 3 muestra los perfiles de utilización de sustratos orgánicos de las comunidades microbianas asociadas con los tratamientos F y SF para los dos tiempos de incubación evaluados. Mientras que la figura 4 representa el análisis de ordenación de los datos de BIOLOG®. No se analizó el tratamiento TA, ya que éste fue esterilizado y no mostró actividad microbiológica en la evaluación de respiración basal. Se puede observar las diferentes posiciones de los tratamientos en el plano de los dos primeros componentes (88.3 % de la varianza explicada). La comunidad microbiana en SF al inicio del experimento mostró un perfil fisiológico que refleja el uso de todos los sustratos presentes en la ecoplaca (Fig. 3). En especial, el uso de carbohidratos (D,L-α-glicerolfosfato), polímeros (α-ciclodextrina), aminoácidos (L-treonina) y ácidos carboxílicos (ácido α-ketobutírico) (Fig. 4).
Fig. 3 Comparación de los perfiles fisiológicos asociados a la comunidad microbiana en los tratamientos. A = carbohidratos y aminoácidos, B = ácidos carboxílicos, polímeros y aminas, SF = sin fertilización, F = con fertilización, (i) inicio, (f) 120 d. Las barras indican la desviación estándar
Fig. 4 Análisis de componentes principales de los perfiles fisiológicos asociados a la comunidad microbiana en los tratamientos. SF = sin fertilización, F = con fertilización, (i) inicio, (f) 120 d
Luego de 120 d de incubación, la riqueza de sustratos utilizados por la comunidad de SF es menor (Cuadro V). Se destaca la ausencia de uso de sustratos tales como ácido-2-hidroxibenzoico, ácido α-ketobutírico y α-ciclodextrina (Fig. 3). En ese sentido, se determinó que la comunidad mostró un consumo de sustratos diferente. En particular: carbohidratos (D-xilosa, β-metil-D-glucósido), ácidos carboxílicos (ácido 4-hidroxibenzoico, D-ácido galacturónico, ácido itacónico, ácido D-galactónico-γ-lactona) y aminoácidos (L-serina y L-asparagina). Este cambio temporal del perfil fisiológico indica un cambio en la estructura funcional de la comunidad, que se reflejó en una menor diversidad funcional (Cuadro V).
CUADRO V ANÁLISIS FUNCIONAL DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS EN CADA TRATAMIENTO
Letras distintas para el mismo parámetro indican diferencias significativas. Se presentan las medias ± desviación estándar
Por su parte, la comunidad microbiana en F al inicio del experimento mostró un perfil fisiológico representado por una riqueza de sustratos menor a la ofertada en la ecoplaca (Cuadro V) y que estuvo asociado con la no utilización de ácido-2-hidroxibenzoico y con una baja intensidad en el uso de ácido α-ketobutírico y de α-ciclodextrina (Fig. 3). El perfil fisiológico de esta comunidad se caracterizó por el uso de carbohidratos (α-D-lactosa), aminoácidos (ácido glicil-L-glutánico, L-asparagina), polímeros (glicógeno, tween 80 y tween 40) y ácidos carboxílicos (ácido D-málico) (Fig. 4). Luego de 120 d, el perfil fisiológico fue diferente. Se caracterizó por el uso de carbohidratos (D,L-α-glicerolfosfato, i-eritritol), aminoácidos (L-treonina), polímeros (α-ciclodextrina), aminas (feniletilamina), y ácidos carboxílicos (ácido γ-hidroxibutírico, ácido D-glucosamínico). Destaca el uso de ácido α-ketobutírico y de α-ciclodextrina (Fig. 3).
Aún cuando el perfil fisiológico fue diferente en F, con un evidente cambio en la estructura funcional de la comunidad (Figs. 3y 4), el valor del índice de diversidad funcional no mostró variaciones significativas (Cuadro V). De hecho, los resultados de la H’ y de la E, muestran que en SF, ambas estimaciones disminuyen significativamente luego de 120 d de incubación (p < 0.05). Lo anterior se atribuye al efecto tóxico de los hidrocarburos sobre la microbiota (Atlas 1981), que promueve la selectividad de algunas poblaciones capaces de tolerar la presencia del hidrocarburo y se modifica la estructura de la comunidad. Resultados similares fueron citados por Zamora et al. (2012a) quienes encontraron que la generación de compuestos tóxicos provenientes de los hidrocarburos, producen cambios en la estructura funcional de la comunidad bacteriana. La comunidad es menos diversa desde el punto de vista funcional, ya que los grupos funcionales son más parecidos entre sí.
Por otro lado en F, la H’ y la E no presentaron diferencias significativas entre el inicio y el final del experimento (Cuadro V; p > 0.05). La diferencia con SF radica en que la fertilización podría favorecer la estabilidad de la comunidad microbiana del suelo. A pesar de que en F el suelo está contaminado con hidrocarburos al igual que en SF, la adición de hojarasca como fertilizante implica una fuente alternativa y no tóxica de sustratos orgánicos para los microorganismos. Esta hojarasca permite la permanencia de un mayor número de grupos funcionales y mitiga el impacto del crudo sobre la actividad microbiana (Nyman 1999). Esto se refleja se refleja en una H’ y E similar al inicio y al final del experimento. Aunque las figuras 3 y 4 muestran que los patrones de utilización de sustratos son diferentes en todos los casos, el cuadro V indica que la H’ tiende a ser menos variable en presencia de hojarasca. Adicionalmente, el análisis de ordenación (Fig. 4) muestra que F(f) es más parecido a SF(i), lo cual podría sugerir que la fertilización propicia la resiliencia funcional de la comunidad microbiana del suelo.
Estos resultados muestran que la contaminación con hidrocarburos, así como la biodegradación del contaminante, afectan la dinámica de la comunidad microbiana del suelo. Se propician cambios en el tiempo en estas comunidades como respuesta a los cambios en la composición del contaminante debido a la degradación o a fenómenos de transporte (Hamamura et al. 2013). Sobre este aspecto, autores como Kaufmann et al. (2004) y Zamora et al. (2012a), indican que después de la contaminación con hidrocarburos se produce un incremento de la comunidad microbiana y una disminución en la diversidad. Lo anterior dado por la selectividad de algunos organismos capaces de adaptarse y utilizar los nuevos sustratos. Los componentes tóxicos de los hidrocarburos podrían inhibir la expresión de algunos miembros de la comunidad bacteriana al favorecer la dominancia de otros grupos (Yu et al. 2011), lo que se refleja en la diversidad funcional (Zamora et al. 2012a).
CONCLUSIONES
La fertilización favorece la actividad microbiana y en consecuencia la descontaminación del suelo con un crudo mediano. Los microorganismos contribuyen con el 37 % de la disminución del contenido de aceites y grasas en los suelos fertilizados y en un 32 % en lo suelos sin fertilizar. Por su parte, la evaporación de componentes volátiles es mayor en ausencia de actividad microbiológica. La contaminación tuvo un efecto negativo sobre la diversidad funcional de la comunidad microbiana luego de 120 d. Sin embargo, aún cuando los resultados encontrados muestran diferencias en la estructura funcional de las comunidades microbianas, la combinación de fertilizantes inorgánicos y orgánicos atenuó los cambios en la diversidad funcional, al propiciar la resiliencia funcional de la comunidad microbiana del suelo.
