Artículos

 

Metabolismo del azufre de aislados bacterianos provenientes de un humedal artificial empleado para el tratamiento de efluentes de la industria curtidora

 

Sulfur metabolism in bacterial isolates from a constructed wetland used for treating tannery industrial wastewater

 

Juan Ramiro PACHECO AGUILAR^1*, María MALDONADO VEGA² y Juan José PEÑA CABRIALES¹

 

¹ Laboratorio de Microbiología Ambiental. Departamento de Biotecnología y Bioquímica. Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN). Km. 9.6. Libramiento Norte, carretera Irapuato-León. Apdo. Postal 629, C.P. 36500. Irapuato, Gto. México *Autor responsable; juanramiro29@yahoo.com.mx

² Laboratorio de Investigación Ambiental. Centro de Innovación en Tecnologías Competitivas, CIATEC A.C. Omega 201, Fracc. Industrial Delta. C.P. 37545, León Gto. México

 

Recibido marzo 2011,
aceptado abril 2012

 

RESUMEN

Los humedales artificiales constituyen una alternativa para el tratamiento de efluentes, donde los procesos biológicos de oxidación originados por la rizósfera de las plantas y los microorganismos presentes in situ, contribuyen para la remoción de contaminantes. En el presente trabajo se caracterizó el metabolismo del azufre (S) de diez bacterias pertenecientes a los géneros Acinetobacter, Alcaligenes, Ochrobactrum y Pseudomonas, las cuales fueron aisladas de un humedal construido para el tratamiento de efluentes con alto contenido de materia orgánica (demanda bioquímica de oxígeno: DBO₅ 1320 mg/L) y sulfuros (54 mg/L) provenientes de la industria del curtido de piel. Los ensayos bioquímicos indican que todos los aislados pueden emplear alguna especie de S como azufre elemental (S⁰), tiosulfato (S₂O₆^2-) o sulfuro (S^2-) como única fuente de S. También se encontró que las cepas del género Pseudomonas fueron las más versátiles, ya que oxidan el S^2- (2 mM) y S₂O₆^2- (4 mM) transformándolos a S⁰ y tetrationato (S₄O₆^2-), respectivamente, mientras que las cepas de Acinetobacter sólo oxidan el S⁰ a S₂O₆^2-. También se observó que las cepas de los géneros Alcaligenes y Ochrobactrum oxidan el S₂O₆^2- (4 mM) a S₄O₆^2-. La actividad de estos microorganismos a través del sistema de tratamiento y la integración de sus metabolismos podrían participar activamente en la remoción de sulfuros.

Palabras clave: oxidación, sulfuro (S^2-), azufre elemental (S⁰), tiosulfato (S₂O₆²), tetrationato (S₄O₆^2-), Acinetobacter, Alcaligenes, Ochrobactrum, Pseudomonas.

 

ABSTRACT

Constructed wetlands are an alternative for the treatment of effluents where biological oxidation processes caused by the rhizosphere of plants and microorganisms present in situ, contribute to the removal of contaminants. In the present work, we characterized the sulfur (S) metabolism of ten bacteria belonging to the genera Acinetobacter,Alcaligenes, Ochrobactrum and Pseudomonas, which were isolated from a wetland constructed for the treatment of effluents with high organic matter content (biochemical oxygen demand: BOD₅ 1320 mg/L) and sulfides (54 mg/L) from the leather tanning industry. Biochemical assays indicate that all the isolates can use some sulfur species such as elemental sulfur (S⁰), thiosulfate (S₂O₆^2-) or sulfide (S^2-) as the sole source of S. We also found that strains of Pseudomonas genus were the most versatile base on the fact that they oxidize S^2- (2 mM) and S₂O₆^2- (4 mM) transforming them to S⁰ and tetrathionate (S₄O₆^2-), respectively, whereas Acinetobacter strains only oxidize S⁰ to S₂O₆^2-. We also found that the strains of the genera Alcaligenes and Ochrobactrum oxidize S₂O₆^2- (4 mM) to S₄O₆^2-. The activity of these microorganisms through the treatment system and the integration of their metabolism might actively participate in the removal of sulfur compounds.

Key words: Oxidation, sulfide (S^2-), elemental sulfur (S⁰), thiosulfate (S₂O₆^2-), tetrathionate (S₄O₆^2-), Acinetobacter, Alcaligenes, Ochrobactrum, Pseudomonas.

 

INTRODUCCIÓN

Los humedales artificiales son sistemas construidos con base en el principio de los humedales naturales, donde el agua y el suelo proveen las características principales para el desarrollo de las plantas y microorganismos, actuando como biofiltros, removiendo sedimentos y contaminantes de los efluentes a través de esta tecnología (Stottmeister et al. 2003). Estos sistemas biológicos son considerados versátiles debido a su alta eficiencia para tratar efluentes de la industria eléctrica y minera contaminados con metales como el selenio (Se), arsénico (As), boro (B), zinc (Zn), plomo (Pb) y fierro (Fe) (O'sullivan et al. 1999, Ye et al. 2003). También se ha reportado su empleo para la degradación de contaminantes orgánicos provenientes de efluentes domésticos, de la industria química y de los alimentos (Rivera et al. 1997, Philippi et al. 1999, Da Motta et al. 2001, Kao et al. 2001, Larsen et al. 2001, Haberl et al. 2003). Pacheco et al. (2008) reportan la construcción de un sistema de humedales para tratar los efluentes generados por la industria del curtido, observando que la demanda química de oxígeno (DQO: 17 520 mg/L), demanda bioquímica de oxígeno (DBO₅: 1320 mg/L), cromo total (Cr: 31 mg/L), nitrógeno total (NTK: 267 mg/L), sulfatos (SO4^2-: 2518 mg/L) y sulfuros (HS^-: 54 mg/L), fueron reducidos en un 98, 95, 99, 94, 92 y 99 %, respectivamente, en el efluente final.

La actividad de las poblaciones microbianas es determinante durante el tratamiento por humedales. Algunos procesos microbianos que han sido identificados incluyen la desnitrificación, sulfato-reducción, sulfoxidación y la oxido-reducción de metales (Da Motta et al. 2001, Stottmeister et al. 2003, Lloyd et al. 2004, Whitmire y Hamilton 2005). Particularmente la degradación anaerobia de la materia orgánica y la sulfato-reducción aunado a los sulfuros provenientes del proceso del curtido, generan efluentes con alto contenido de sulfuros de hasta 54 mg/L, los cuales resultan tóxicos para la vida acuática (Bagarinao y Vetter 1989). Sin embargo, dentro de la ecología microbiana también han sido identificadas poblaciones bacterianas sulfoxidantes (BSO), las cuales reoxidan el sulfuro formado. Algunas reacciones de oxidación del S identificadas en microorganismos, indican la transición de las siguientes especies químicas: S^2-(sulfuro) → S⁰ (S elemental) → SO₃^2- (sulfito) → SO₄^2- (sulfato), aunque los intermediarios pueden interaccionar químicamente, haciendo la ruta más compleja, tal es el caso de la formación del tiosulfato (S₂O₃^2-), el cual se forma por la combinación química del S⁰ y el SO₃^2-, este compuesto también puede ser oxidado por microorganismos a tetrationato (S₄O₆^2-) a través de la siguiente reacción general: S⁰ + SO₃^2-→ S₂O₃^2- → S₄O₆^2- (Suzuki 1999).

Los géneros microbianos sulfoxidantes más estudiados incluyen especies de los géneros de Thio-bacillus, Thiomicrospira, Thermothrix, Thiothrix y Beggiatoa (Greene et al. 2003, Beller et al. 2006, Syed et al. 2006). En el humedal construido para el tratamiento de efluentes provenientes de la industria del curtido, fueron obtenidos diez aislados bacterianos creciendo en el medio de cultivo Thiobacillus B para microorganismos sulfoxidantes, los cuales fueron identificados por análisis del gen 16S ribosomal, pertenecientes a los géneros Acinetobacter, Alcaligenes, Ochrobactrum y Pseudomonas. El objetivo del presente estudio fue determinar las capacidades de estos aislados bacterianos para metabolizar especies reducidas del S.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislados bacterianos

Los aislados de estudio (depositados en el cepario del Laboratorio de Microbiología Ambiental en el Departamento de Bioquímica y Biotecnología del CINVESTAV campus Guanajuato) fueron obtenidos del humedal construido en la tenería "La Europea" en León, Gto., e identificados por el análisis del gen ribosomal 16S. Cuatro aislados pertenecen al género Pseudomonas (A11, A12, A14 y B12), tres aislados al género Alcaligenes (C11, C14 y C15), dos al género Acinetobacter (E1 y E2) y uno al género Ochrobactrum (D11) (Pacheco et al. 2008).

Oxidación de compuestos reducidos de S

Para la caracterización bioquímica de oxidación de fuentes reducidas de S, se empleó el medio líquido de cultivo modificado Thiobacillus B reportado por Leduc (1999), el cual contiene (g/L): 2.9 citrato de sodio, 3.0 KH₂PO₄, 2.0 KNO₃, 0.1 NH₄Cl, 0.1 MgCl₂, 0.1 CaCl₂, 0.2 Fe(NH₄)(SO₄)₂.6H₂0 y 0.05 MgSO₄.7H₂O, ajustado a pH 7.0. Como fuente reducida de S se utilizó tiosulfato de sodio 20 mM, S elemental 1 % o sulfuro de sodio 2 mM. Todos los ensayos fueron inoculados a una densidad de 1 x 10⁶ células/mL (densidad óptica 0.01) e incubados en agitación a 150 rpm por 72 h, a 28 °C. Al término de la incubación, la densidad óptica fue medida y el S⁰, SO₃^2-, S₂O₃^2- y S₄O₆^2- fueron analizados. El ensayo de oxidación de S^2- fue llevado a cabo bajo condiciones anaerobias, cuantificando en el medio, la disminución del S^2- y la reducción de nitratos (NO₃–) a nitritos (NO₂–).

Fuentes reducidas de S

Para determinar la capacidad de los aislados para utilizar S⁰ o S₂O₃^2- como única fuente de S, se empleó el medio modificado Thiobacillus B, sustituyendo el MgSO₄ por MgCl₂, y utilizando S elemental (1 %) o tiosulfato de sodio (20 mM) (Rosseti et al. 2003).

 

TÉCNICAS DE ANÁLISIS

Sulfuros

La cuantificación de S^2- se llevó a cabo mediante la formación del complejo de azul de metileno con sulfato de N', N dimetil -p-fenilendiamina, en presencia de FeCl₃, el cual fue medido a 665 nm (Rodier 1981).

Tiosulfato y tetrationato

El S₂O₃^2- y S₄O₆^2- fueron cuantificados como tiocianato (SCN^-) por medio de la reacción de cia-nólisis con KCN en presencia de CuCl₂, el producto formado fue medido a 460 nm. Para discriminar el SCN^- formado a partir del S₄O₆^2-, la muestra fue incubada por 30 minutos con KCN y NH₄OH previo a la adición de CuCl₂ (Masau 1999).

Azufre elemental

El S⁰ fue extraído del medio de cultivo con éter de petróleo y posteriormente llevado a cianólisis con NaCN en acetona, el producto final fue medido a 460 nm (Masau 1999).

Sulfito

Este método está basado en la formación de un complejo colorido generado por la p-rosanilina y el formaldehído, en presencia de tetracloromercurato (II), el producto fue medido a 554 nm (Masau 1999).

 

RESULTADOS

Los resultados de los ensayos de oxidación se presentan en el cuadro I. La mayoría de los aislados mostraron crecimiento en el medio Thiobacillus B con S⁰. Sólo en el medio donde crecieron los aislados pertenecientes al género de Acinetobacter (E11 y E12) se encontró S₂O₃^2- como especie oxidada. La formación de SO3^2- y la combinación con S⁰ probablemente formaron S₂O₃^2-, el cual no fue oxidado, acumulándose en el medio de cultivo como ha sido reportado por Suzuki (1999). De la misma manera, todos los aislados crecieron en medio Thiobacillus B con tiosulfato de sodio (20 mM), detectándose en los medios de cultivo S₄O₆^2- como producto de oxidación, con excepción donde crecieron los aislados del género Acinetobacter. En ninguno de los ensayos de oxidación de especies reducidas de S se encontró SO₄^2-, ni hubo acidificación del medio. El pH final fluctuó entre 7.2 - 8.8, siempre más alcalino que el pH inicial, debido probablemente a la formación de hidróxido (OH^-) durante las reacciones de oxidación del tiosulfato: 4Na₂S₂O₃ + 2H₂O + O₂ → 2Na₂S₄O₆ + 4NaOH (Mason y Kelly 1988, Suzuki 1999).

En relación a la oxidación de S^2-, sólo fue detectada la disminución en la concentración en el medio de cultivo donde se inocularon los aislados A11, A12, A14 y B12 pertenecientes al género Pseudomonas (Cuadro II). No se detectó alguna especie oxidada del S, por lo que pudieron haber utilizado el S^2- como fuente de S (Okada et al. 1982) o haberlo oxidado a S⁰ intracelular (Chung et al. 1997). Este ensayo fue llevado en condiciones anaerobias por lo que se empleó NO₃^- como aceptor alterno de electrones durante el consumo de S^2-. La cinética de la disminución en la concentración de S^2- y NO₃^-, así como la producción de NO₂^- se muestra en la figura 1. Los resultados muestran que alrededor de las 70 h el sulfuro había sido completamente metabolizado por los aislados A11, A12 y A14.

 

El S⁰ y S₂O₃^2- fueron metabolizados como única fuente de S por todos los aislados, en términos de crecimiento bacteriano determinado por un aumento en la densidad óptica. Sin embargo, este aumento no estuvo correlacionado con el consumo de S₂O₃^2-, también pudo detectarse la acumulación de S₄O₆^2-como especie oxidada del S₂O₃^2- (Cuadro III). La diferencia en la producción de S₄O₆^2- entre los aislados pudo deberse a la presencia de SO₃^2-, producto de la acción enzimática de la rodanasa sobre el S₂O₃^2-, el SO₃^2- actúa como inhibidor del sistema enzimático (S-oxidante dependiente del citocromo c) que lleva a cabo la oxidación de S₂O₃^2- a S₄O₆^2- (Suzuki 1999, Sekowska et al. 2000). En los ensayos realizados con Acinetobacter (E11 y E12) creciendo en tiosulfato de sodio, no se detectó S₄O₆^2-, el crecimiento mínimo observado en el aislado E12 probablemente se debió por el consumo de S₂O₃^2- en cantidades no detectables por el método analítico.

 

DISCUSIÓN

La presencia de plantas en humedales construidos promueve procesos químicos y biológicos en la zona de la rizósfera que participan en la mejora de la calidad de los efluentes, mediante la oxidación de compuestos orgánicos e inorgánicos (Stubner et al. 1998, Baptista et al. 2003). La actividad microbiana aerobia sulfoxidante es dependiente de la rizósfera o de aceptores alternos de electrones como NO₃^-, Fe³+ o Mn⁴⁺ cuando ocurre en sedimentos bajo condiciones anaerobias (Stubner et al. 1998, Eckord etal. 2002, Leduc 1999).

La participación de los géneros bacterianos de los aislados de estudio en el ciclo del S ha sido previamente reportada, tal es el caso de Pseudomonas, género cosmopolita, el cual ha sido aislado de suelos, de reactores empleados en tratamiento de efluentes y hasta de respiraderos marinos. Su metabolismo incluye la oxidación de S^2- a S⁰ y de S₂O₃^2- a S₄O₆^2-, además del uso de dimetil sulfuro (DMS) como fuente de S al igual que Acinetobacter (Ruby et al. 1981, Chung et al. 1996, Fuse et al. 2000, Okabe et al. 2005).

La degradación de compuestos organosulfurados como los bencensulfonatos, ha sido ampliamente estudiada en bacterias del género Alcaligenes, debido a que pueden emplearlos como fuente de C y S (Cook et al. 1999). Ochrobactrum es un género que se ha encontrado presente en la ecología microbiana de lodos activados de reactores anaerobios sulfoxidantes, con capacidades de oxidación de S^2- a S⁰ o a SO4^2- (Mahmood et al. 2009).

Todos los aislados de este estudio pueden utilizar S^2-, S⁰ o S₂O₃^2- como fuente de S y como producto de la oxidación de S₂O₃^2-, acumulan S₄O₆^2- sin la producción de SO₄^2-. Las poblaciones sulfoxidantes formadoras de S₄O₆^2- están presentes en diversos ambientes como suelos, lagos sódicos, biorreactores y sedimentos marinos (Podgorsek e Imhoff 1999, Sorokin 2003).

El papel del S₄O₆^2- dentro del ciclo del S ha sido descrito por Sorokin et al. (1996) en la cepa Catenococcus thiocyclus LMD 92.12. Ensayos en medios de cultivo muestran que el S₄O₆^2- producido por la oxidación biológica del S₂O₃^2-, promueve la oxidación química de S^2- hacia S⁰ cuando se adiciona S^2- al medio. La cepa reoxida el S₂O₃² a S₄O₆^2-, y de esta manera se oxida más S^2-. Este mecanismo acopla reacciones químicas y biológicas que pudieran ocurrir también en el humedal en estudio. De esta manera, los géneros de Pseudomonas, Alcaligenes y Ochrobactrum pudieran estar llevando a cabo la oxidación indirecta de S^2- de la misma manera que Catenococcus thiocyclus, mientras que el S⁰ producido pudiera ser oxidado a S₂O₃^2- por Acinetobacter (Podgorsek et al. 2004). La figura 2 muestra el ciclo del S propuesto por Sorokin et al. (1996) adaptado con los aislados microbianos del presente estudio.

 

CONCLUSIONES

Los resultados en el presente trabajo indican que las poblaciones microbianas sulfoxidantes presentes en el humedal poseen capacidades diversas para metabolizar compuestos reducidos de azufre por asimilación y oxidación pudiendo participar en la mejora de la calidad de los efluentes. El conocimiento y mantenimiento de estas poblaciones es necesario para el adecuado funcionamiento del humedal.

 

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