Toma de muestras en campo y determinación de razas

Durante la temporada de cultivo 2014, en las siembras comerciales de trigo de temporal en los Valles Altos de México se observó una epidemia de roya amarilla, de donde se colectaron al menos 500 muestras de hojas infectadas con dicha roya en diferentes campos de trigo harinero de varias localidades de Tlaxcala, Puebla, Hidalgo y el Estado de México; además, se tomaron muestras de hojas enfermas de genotipos de trigo incluidos en los viveros de observación y ensayos de rendimiento establecidos por el INIFAP. Las muestras obtenidas de todos los sitios se caracterizaron en las líneas diferenciales (las provenientes de Nana F2007). El resto de las muestras, después de multiplicarse se mantuvo en un refrigerador a -70 ^oC. para su caracterización posterior.

En los invernaderos del CIMMYT el Batán, México, se sembraron semillas de la variedad Moroco-Lr19 en vasos de unicel, cuando éstas germinaron fueron tratadas con ácido maleico (MH30) a una concentración de 500 mg L^-1 de agua. El tratamiento con MH30 restringe el crecimiento de las plántulas, con lo que se incrementa la producción de esporas. Las plántulas de ocho días de edad fueron inoculadas con esporas recolectadas de cada muestra de campo, se colocaron en una cámara de rocío (100 % HR) durante 16 h a 7 °C, luego se colocaron en cámaras de plástico transparente en un invernadero con temperaturas entre 17 y 20 °C. Una uredínea (pústula) de cada muestra de campo que resultó viable se volvió a multiplicar en la misma variedad Moroco-Lr19 siguiendo el procedimiento descrito. Las plántulas que se incrementaron inoculadas con cada aislamiento se colocaron en cámaras individuales de plástico transparente para evitar contaminación entre los aislamientos y obtener suficiente inóculo para inocular las líneas diferenciales (Cuadro 1). La mayoría de las cuasi-isolíneas o diferenciales para los genes conocidos de resistencia a roya amarilla (genes Yr) fueron desarrolladas en Australia y se les conoce como Avocet (^{Wellings et al., 2009}). Las variedades de trigo harinero Seri M82, Pavón F76, Ópata M85, Bacanora T88 (Kauz), TAM 200, Rebeca F2000, Pastor F2000, la línea Reedling y el triticale Pollmer también se incluyeron en la serie de diferenciales.

Las plántulas de 12 días de las diferenciales fueron inoculadas mediante aspersión con urediniosporas suspendidas en aceite mineral ligero (Soltrol 170, Chevron Phillips Chemical Co., Woodlands, Texas, EUA) a una concentración de 1 × 10⁶ urediniosporas mL^-1 y luego colocadas en una cámara de rocío, como se describió anteriormente, antes de transferirse a un invernadero a temperaturas entre 17 y 20 °C. El tipo de infección se evaluó aproximadamente ١5 días después de la inoculación utilizando la escala de ٠ a 9 descrita por ^{McNeal et al. (1971)}. Los aislamientos fueron designados con el acrónimo MEX (México), seguido del año y el número de aislamiento; por ejemplo, MEX14.191, que significa aislamiento 191 registrado en México en el año 2014.

Identificación de fuentes de resistencia

Las líneas designadas como 48 Vivero Internacional de Trigos Harineros (IBWSN) fueron evaluadas el 8 de septiembre y 1 de diciembre de 2014 en plántula en el invernadero en contra de las razas MEX96.11, MEX08.13 y MEX14.191 siguiendo el mismo procedimiento que en la inoculación de las diferenciales.

Para la evaluación en planta adulta se sembraron los 653 genotipos de trigo harinero candidatos al IBWSN del CIMMYT en el Campo Experimental Bajío del INIFAP en Roque, Guanajuato, México durante el ciclo 2014-2015 con el fin de determinar los niveles de resistencia a esta nueva raza. Se sembraron bordos con semillas en partes iguales de Luminaria F2012 y Nana F2007 que sirvieron como dispersores de inoculo. Los 653 genotipos y los testigos Nana F2007 y PBW343 se sembraron en un ensayo de campo siguiendo un diseño completamente al azar sin repeticiones, en surcos dobles de 1.0 m de longitud y 0.3 m de separación. La densidad de siembra fue de aproximadamente 100 semillas por parcela. Los bordos susceptibles se inocularon con urediniosporas de la raza MEX14.191 mediante una suspensión de 5 mg de esporas del hongo por mL^-1 de aceite mineral Soltrol 170 y se inocularon alrededor de la etapa de encañe de las plantas. La severidad de la enfermedad se evaluó el 23 de marzo, 3 y 13 de abril del 2015 la cual se estimó por el porcentaje de área de la hoja cubierta por las colonias o pústulas del patógeno (^{Kishii et al., 2019}).

Al mismo tiempo, la reacción de la planta se evaluó según el método de ^{Roelfs (1992)}, cuando las hojas no presentaron lesiones o sólo mostraron clorosis se registraron como resistentes (R); cuando las hojas mostraron uredíneas rodeadas de necrosis o clorosis se registraron como moderadamente resistentes (MR). Una reacción de susceptibilidad moderada (MS) se registró cuando las hojas presentaron uredíneas con ausencia de necrosis y clorosis. Cuando las hojas mostraron respuestas de MRMS o la combinación de MR y MS y presentaron uredíneas rodeadas de necrosis y un nivel de infección moderada o clorosis, se registraron como M, y S se registró cuando las hojas mostraron grandes áreas cubiertas de uredíneas o lesiones sin tejido necrótico o clorosis (^{Kishii et al., 2019}). Los genotipos se agruparon de acuerdo con la severidad final de la enfermedad y se clasificaron en grupos con intervalos del 10 % de infección.

Identificación de razas

De los 28 genotipos usados como diferenciales, se observó variación en ocho de ellos como respuesta a las inoculaciones del hongo causante de roya amarilla de las muestras colectadas durante 2014. La combinación de virulencia para Yr2, Yr3, Yr6, Yr7, Yr8, Yr9, Yr17, Yr27 y Yr31, que fue identificada por primera vez y representada en las razas MEX 14.191, y otra similar, MEX14.146 virulenta a Yr1 (Cuadro 2).

Considerando la respuesta de Yr1 a las diferentes razas, se discriminaron tres grupos entre las 25 identificadas; 10 fueron virulentas, ocho avirulentas y en siete de ellas hubo respuesta diferencial heterocigota con plantas resistentes y susceptibles (Cuadro 2). En la variedad Tatara, que inicialmente fue usada como diferencial para Yr3, se postuló la presencia de otros genes de resistencia (Yr3, Yr9, Yr27+); además, por su comportamiento, es posible que adicionalmente posea Yr8, ya que se observó que las razas avirulentas (15) o virulentas (ocho) en Tatara también fueron avirulentas o virulentas en Yr8 (Cuadro 3), con excepción de la raza MEX14.115. Lo anterior indicaría la presencia en Tatara de un gen de resistencia adicional (+) a los ya mencionados, pero inefectivo a la raza MEX14.160, y que puede ser similar al identificado en Ópata M85 (Cuadro 2). Las variedades Ópata M85 (Yr27, +) y Kauz (Yr9, 27, +) usadas para verificar el comportamiento de Yr27 cuando existe virulencia para Yr9, tuvieron un comportamiento diferente. Once de las 25 razas identificadas fueron virulentas tanto en Ópata M85 como en Kauz, mientras que cinco fueron avirulentas en ambos genotipos (Cuadro 2); sin embargo, ocho de ellas, fueron virulentas en Kauz, pero avirulentas en Ópata M85, lo que indicaría que Ópata M85 posee un gene de resistencia adicional a Yr27 (+).

En el presente estudio se usaron dos fuentes de Yr31, Avocet Yr31 y la variedad Pastor F2000 (Yr31+) (Cuadro 1), ambas con un comportamiento similar, pero sólo la respuesta de Pastor F2000 se presenta en el Cuadro 3. De las 25 razas identificadas, 18 fueron virulentas y siete avirulentas, entre las cuales cuatro de estas últimas también fueron avirulentas en Kauz. La raza MEX14.114, proveniente de una muestra obtenida de Rebeca F2000 (Yr31+), fue virulenta en Pastor F2000, pero avirulenta en Kauz y sólo los aislamientos MEX14.202 y MEX14.206 fueron avirulentos en Pastor F2000, pero virulentos en Kauz (Cuadro 2). En plántula, las razas identificadas en la presente investigación fueron virulentas a Yr17. Dos fuentes adicionales de Yr17 fueron incluidas como diferenciales, Trident y Reedling (Borlaug 100 Yr17+). Avocet Yr17 y Trident tuvieron el mismo comportamiento, pero Reedling se comportó diferencialmente, aunque la mayoría de las razas fueron avirulentas y sólo MEX14.114, MEX14.122, MEX14.202, MEX14.187 y MEX14.160 fueron virulentas (Cuadro 2), lo que indicó que Reedling puede poseer resistencia adicional a Yr17 en plántula.

Estas nuevas combinaciones de virulencia (Yr27+Yr31) vencieron la resistencia de la variedad Nana F2007 sembrada en los Valles Altos de México, y de Luminaria F2012 liberada para las zonas de riego de El Bajío. Estos resultados indican una continua evolución y acumulación de virulencias que dan lugar a razas más agresivas de P. striiformis. Cuando se comparó el comportamiento de ciertos genotipos y diferenciales a la raza MEX14.191 con las dos razas identificadas anteriormente, una virulenta a Yr27, pero avirulenta a Yr31 (MEX96.11) y una segunda que fue virulenta a Yr31 pero avirulenta a Yr27 (MEX08.13), es claro que la combinación de virulencia sobre Yr27+Yr31 fue capaz de causar la enfermedad en plántula en genotipos resistentes a las dos razas anteriores como Don Carlos M2015, Francolín, Luminaria F2012, Kronstad F2004 y Nana F2007, entre otros (Cuadro 3).

Entre las muestras analizadas durante 2014, y las pruebas de plántula, se observó que los aislamientos fueron virulentos a Yr2, Yr3, Yr6, Yr7, Yr9 y Yr17, además de los ya mencionados en los Cuadros 2 y 3; así mismo, entre los aislamientos evaluados en estado de plántula no se observó virulencia para los genes Yr5a, Yr5b, Yr10, Yr15, y Yr24 (=Yr26). La fórmula de avirulencia/virulencia de MEX14.191 es: Yr1, Yr5a, Yr5b, Yr15, YrPoll/Yr2, Yr6, Yr7, Yr8, Yr9, Yr17, Yr27, Yr31 y Yr32. Del 2014 al 2023 la raza predominante continuó siendo MEX14.191. Se han detectado nuevas razas, incluyendo MEX16.04, virulenta para Yr10 y Yr24 (^{Huerta-Espino y Singh, 2017}) sin llegar a causar epidemias en las variedades actualmente cultivadas. A partir del año 2015, MEX14.191 se ha utilizado para hacer selección en contra de roya amarilla, tanto en generaciones segregantes como en líneas avanzadas.

Las epidemias de roya amarilla con frecuencia son causadas por razas que existen en baja frecuencia y luego de que una variedad se siembra en superficie mayor, como en el caso de Nana F2007, estas razas también tienden a incrementar su frecuencia, por lo que la enfermedad se presenta a un nivel epidémico; en otras palabras, una variedad resistente al momento de liberarse, en pocos años uede hacerse susceptible debido a la presencia de una nueva raza. Esta nueva raza puede presentarse por evolución local, como es el caso de la evolución que combinó virulencia para Yr27 y Yr31 en los Valles Altos (García et al., 2015; Com. Pers.)² o por incursión de razas provenientes de otras regiones del país, del continente o de otras partes del mundo, sin excluir el origen de recombinación sexual en el hospedante alterno.

En Europa, por ejemplo, las epidemias de roya amarilla en 12 países entre 2002 y 2014 fueron causadas por tres razas denominadas por la variedad donde se encontró virulencia (Guerrero, Kranich y Triticale agresivo) y las razas que aparecieron después de 2011 fueron de origen exótico (^{Hovmøller et al., 2016}). En general, las epidemias de roya amarilla del trigo han sido causadas por un número reducido de razas, como es el caso de MEX14.191 en la variedad Nana F2007 en México (García et al., 2015; Com. Pers.)². Otro ejemplo se basa en datos de 35 países que de 2009 a 2015 revelaron variación en las razas de acuerdo con las regiones productoras de trigo; así, mientras algunas fueron dominantes en América del Norte, otras los fueron en Asia Occidental, África del Norte y África Oriental, y distintas de las que prevalecieron en Asia Central y Europa (^{Ali et al., 2017}).

En términos de virulencia, las razas prevalentes o causantes de las epidemias de roya amarilla han aparecido a causa de la evolución hacia nuevas formas de virulencia influenciadas en parte por los genes presentes en las variedades cultivadas en grandes extensiones, sin descartar el movimiento global de razas cuyo origen puede ser el producto de la recombinación sexual en regiones donde se encuentran los hospedantes alternos. En Turquía y parte de Europa, por ejemplo, la mayoría de los aislamientos caracterizados fueron virulentos en diversas frecuencias para los genes de resistencia Yr1, Yr6, Yr7, Yr8, Yr9, Yr10, Yr17, Yr24, Yr27, Yr32, Yr43, Yr44, YrSp (=Yr5b) y YrTr1, pero avirulentos en Yr5 y Yr15 (^{Cat et al., 2021}). La virulencia para Yr9 y Yr27 fue común en epidemias en África y Asia, mientras que la virulencia a Yr17 y Yr32 prevaleció en Europa, lo que corresponde a genes de resistencia ampliamente desplegados en las variedades comerciales (^{Ali et al., 2017}). Al comparar la situación global de la roya amarilla en varios países, se concluyó que las razas prevalentes y su variación ha dependido de las variedades cultivadas y otros factores presentes en las regiones productoras de trigo (^{Sharma-Poudyal et al., 2013}), aunque las frecuencias de los factores de virulencia fueron diferentes, la mayoría de los aislamientos (razas) de P. striiformis de estos países compartían factores de virulencia comunes (^{Sharma-Poudyal et al., 2013}).

Identificación de fuentes de resistencia

Con la evolución de virulencia para Yr27 y Yr31 en Nana F2007, Luminaria F2012 y otras variedades, se planteó la necesidad de identificar fuentes de resistencia efectiva a MEX14.191, entre otras. Con los datos de la evaluación en plántula en contra de las razas MEX96.11, MEX08.13 y MEX14.191 (Cuadro 3) en planta adulta en el campo se formaron seis grupos (Cuadro 4): A) resistentes en plántula a las tres razas, B) líneas resistentes en plántula a MEX96.11 pero susceptibles a MEX08.13 y MEX14.191, C) líneas susceptibles en plántula a MEX96.11 y MEX14.191 pero resistentes a MEX08.13, D) líneas susceptibles en plántula a las tres razas, E) líneas resistentes en plántula a MEX96.11 y MEX08.13 pero susceptibles a MEX14.191 y F) líneas con comportamiento en planta adulta independiente del comportamiento en plántula. La evaluación de estos seis grupos en planta adulta en el campo mostró que existen altos niveles de resistencia en las líneas evaluadas.

Más del 65 % de las líneas evaluadas tuvieron niveles de infección iguales o menores de 5 %, que son las que se consideraron con niveles de resistencia altos, siendo el mayor grupo casi inmune (0 % de infección) y representaron el 36 % del total de las líneas evaluadas, seguidas de líneas que mostraron el 5 % de infección (19.13 %) y líneas con el 1 % de infección (11.11 %). Los datos no se muestran en el Cuadro 4, pero están incluidas en el intervalo de clasificación (10 en 10) de los genotipos de acuerdo con el porcentaje de infección en los diferentes grupos del Cuadro 4.

La identificación de fuentes de resistencia sigue siendo un reto para fitopatólogos y mejoradores; afortunadamente, en México se han identificado fuentes con genes de resistencia de raza específica a roya amarilla y se han incorporado a variedades con alto potencial de rendimiento, como es el caso de los genes Yr5, Yr15 y Yr17 en la variedad Borlaug 100 (^{Valdez-Rodríguez et al., 2020}) o se han desarrollado genotipos con resistencia en planta adulta, como en el presente estudio, donde se observó que al menos 70 % de las líneas tuvieron niveles aceptables de resistencia. En países como Pakistán, India y Egipto (^{Badoni et al., 2017}; ^{Elbasyoni et al., 2019}; ^{Rehman et al., 2019}; ^{Sood et al., 2020}) se han identificado fuentes de resistencia a las razas prevalentes en esos países. Estas líneas incluyen resistencia de raza específica y resistencia parcial de planta adulta, como es el caso de las líneas evaluadas en el presente estudio. Los resultados indicaron que los genes Yr18, Yr29, Yr46 y Yr30, solos o en diferentes combinaciones, estuvieron presentes entre las variedades de trigo evaluadas y continúan siendo la columna vertebral de la resistencia en el germoplasma mexicano actual (^{Huerta-Espino et al., 2020}).

Otra forma de identificar fuentes de resistencia es mediante mapeo por asociación utilizando datos genómicos (GWAS); por ejemplo, de una colección mundial de 1000 accesiones de trigo de primavera en condiciones de campo se evaluaron cuatro razas de P. striiformis en seis ambientes en el oeste de los Estados Unidos, en estado de plántula; se observaron mayores niveles de resistencia en una subpoblación del sur de Asia, GWAS identificó 97 loci que fueron significativos; pero sólo tres de 10 QTL representan nuevos loci de resistencia (^{Maccaferri et al., 2015}). Por otro lado, en una colección de 1175 accesiones de germoplasma de trigo de invierno de la Colección Nacional de Granos Pequeños de los Estados Unidos, el análisis por GWAS identificó 127 loci de resistencia (^{Bulli et al., 2016}). En otro estudio de asociación de todo el genoma del trigo se evaluaron 23,346 líneas de trigo del CIMMYT en India, Kenia y México contra razas predominantes en esos países. Se identificaron 114 marcadores repetibles que marcan 20 loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados con YR en 10 cromosomas, incluyendo 1D, 2A, 2B, 2D, 3A, 4A, 4D, 5A, 5B y 6B, entre los cuales cuatro QTL, QYr.cim-2DL.2, QYr.cim-2AS.1, QYr.cim-2BS.2 y QYr.cim-2BS.3 fueron significativos en más de diez conjuntos de datos (^{Juliana et al., 2020}).

Las líneas de trigo harinero identificadas como resistentes en el presente estudio son el producto de cruzamientos y selección en contra de las razas en México previas a 2014, donde se ha hecho énfasis en la resistencia de planta adulta. Estas líneas tienen, además de resistencia a roya amarilla, resistencia a la roya de la hoja e inclusive a la roya del tallo, potencial de rendimiento alto y buena calidad industrial. De este vivero, las líneas resistentes se pueden seleccionar de acuerdo con su adaptación para condiciones de temporal o de riego y liberarse como variedades para cada uno de estos ciclos.