Introducción

El Agave wocomahi se distribuye en la parte norte de la Sierra Madre Occidental en México y ha sido aprovechado por los grupos humanos nativos como Guarijíos y Rarámuris ^{(Gentry, 1972)}. Las cualidades que le han dado un valor etnobotánico son la presencia de cantidades bajas de sapogeninas y su alto contenido de azúcares, por lo que es utilizado en la elaboración de alimentos y bebidas ^{(Klopper et al., 2010)}. También se usa en la medicina tradicional, en la elaboración de herramientas y en la obtención de fibras ^{(Gentry, 1972)}. Si bien estos usos son locales, las características de la especie sugieren que puede ser aprovechada de manera más intensiva; sin embargo, se ha observado una disminución preocupante en algunas de sus poblaciones ^{(González et al., 2009)}; ésto puede agravarse con la destrucción de su hábitat, sobreexplotación y con el hecho de que su reproducción depende exclusivamente de la producción de semillas, ya que A. wocomahi no produce hijuelos ^{(Gentry, 1972)}.

Las técnicas de cultivo y propagación in vitro han ampliado las posibilidades de aprovechamiento de las especies de Agave, al garantizar un suministro constante de plantas sin depender de la disponibilidad de hijuelos o semillas ^{(Domínguez et al., 2008a)}; sin embargo, aún es necesario desarrollar estos procesos para especies de Agave poco estudiadas, y hoy ajenas a la explotación intensiva, como es el caso de A. wocomahi. La regeneración permite la obtención de plantas completas y viables a partir de los tejidos cultivados in vitro. La organogénesis y la embriogénesis somática son dos vías que llevan a la regeneración de plantas en estos sistemas; con la primera es posible regenerar brotes sobre los tejidos cultivados, los que al ser posteriormente enraizados se convierten en plántulas, mientras que la segunda genera embriones a partir de células somáticas, mismos que al germinar se convierten en plantas completas con los polos apical y radical ya formados; tanto la organogénesis como la embriogénesis somática pueden ocurrir directamente sobre el explante inoculado in vitro, o bien, a partir de tejido calloso previamente generado; en el primer caso se les llama directas, y en el segundo indirectas ^{(Nuñez-Palenius et al., 2006)}.

En cuanto al tejido calloso (TC), éste puede generarse a partir de explantes cultivados en presencia de auxinas, en algunos casos combinadas con citocininas; este tejido, además de mantener un crecimiento indiferenciado, presenta características distintivas como consistencia, textura, color, tasa de crecimiento y potencial morfogenético; éstas varían dependiendo de la especie de planta, tipo de explante, así como del tratamiento con reguladores del crecimiento con que se generó. El TC es una herramienta valiosa para diferentes aplicaciones biotecnológicas como la producción de metabolitos de alto valor y la regeneración de plantas completas por las vías antes mencionadas ^{(Huang et al., 2012}; ^{Ikeuchi et al., 2013)}.

En el género Agave hay antecedentes de cultivo y regeneración in vitro con fines de propagación masiva en varias especies, sobre todo en aquellas cultivadas para la producción de bebidas alcohólicas o fibras. Se ha reportado tanto la producción de brotes directamente sobre los explantes inoculados ^{(Domínguez et al., 2008b}; ^{Ramírez-Malagón et al., 2008)}, como la regeneración indirecta por embriogénesis somática a partir de tejido calloso, esto último en A. victoria-reginae ^{(Martínez-Palacios et al., 2003)}, A. fourcroydes ^{(Monja-Mio y Robert, 2013)}, A. angustifolia ^{(Arzate-Fernández et al., 2016)}, A. marmorata ^{(Álvarez-Aragón et al., 2020)} y A. tequilana ^{(Delgado-Aceves et al., 2021)}. En este estudio se reporta el cultivo y la regeneración in vitro de A. wocomahi, especie para la cual no existían antecedentes al respecto.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Las semillas desinfectadas e inoculadas in vitro mostraron un 76 % de germinación. Las plántulas generadas fueron multiplicadas en medio con 1 mg L^-1 de BA con el fin de estimular la brotación de los meristemos laterales. En esta etapa se observó, en promedio, la generación de 11.7 ± 4.8 brotes por explante. Este valor está por encima del intervalo de entre 4.7 y 6.9 brotes por explante reportado por ^{Domínguez et al. (2008b)} para otras cinco especies de Agave tratadas con la misma concentración de BA.

En cuanto a los experimentos con auxinas y citocininas, la respuesta morfogénica observada con mayor frecuencia fue la generación de tejido calloso (Cuadro 1). Con respecto a los tipos de explante evaluados, el tallo fue el que mostró la mayor inducción de callo (IC), con 73.2 %, mientras que la raíz presentó la menor con 52.1 %. En cuanto a las auxinas, el PIC y el ANA fueron los que generaron mayor IC, seguidos del 2,4-D y AIA. Se observo generación de callo tanto en tratamientos con las auxinas solas, como combinadas con BA. En otras especies, como A. angustifolia, se ha reportado que la generación de callo requiere de la combinación de una auxina con bajas concentraciones de una citocinina, en concreto BA ^{(Arzate-Fernández y Mejía-Franco, 2011)}.

Con respecto al tipo de tejido calloso generado, considerando el total de los diferentes tratamientos y tipos de explante, se obtuvo una IC global de 66 %. El TC de tipo nodular (Figura 1A) fue el más observado, con 44.7 %, seguido del TC con raíz (Figura 1B), compacto (Figura 1C), friable (Figura 1D) y con presencia de brotes (Figura 1E). La anterior clasificación del TC fue propuesta por ^{Ikeuchi et al., (2013)}, y sólo se añadió el TC tipo “nodular” con el objeto de describir a un callo con presencia de formas semiesféricas, de consistencia blanda, que ya ha sido reportado en estudios previos con especies de agave ^{(Álvarez-Aragón et al., 2020)}. Con respecto a las auxinas probadas, con el uso del ANA se obtuvo un TC abundante de color predominantemente blanco, con generación de raíces en prácticamente todos los explantes. Este resultado sugiere que en al género Agave existe una fuerte influencia de ANA en el desarrollo de este tipo de TC, ya que también ha sido reportado en A. fourcroydes ^{(Monja-Mio y Robert, 2013)} y en A. sisalana ^{(Nikam, 1997)}. Los tratamientos con PIC generaron abundante tejido calloso, en su mayoría de aspecto nodular, respuesta similar a la observada en los tratamientos con 2,4-D en explantes de tallo, hoja y raíz. En este caso el TC mostró un color amarillo, lo que difiere parcialmente con lo obtenido por ^{Arzate-Fernández y Mejía-Franco (2011)}, quienes obtuvieron TC “duro” en color blanco-amarillo perlado y otros “suaves y friables” en color blanco cremoso en A. angustifolia, al utilizar distintas concentraciones de 2,4-D; posiblemente, estas diferencias se deben a los distintos genotipos, así como en los explantes utilizados, ya que estos autores utilizaron embriones cigóticos como explantes. A pesar de que el AIA es la auxina más estudiada en plantas, ésta ha sido escasamente utilizada en la inducción de TC en especies de Agave, sólo ^{Nikam (1997)} ha reportado la obtención de TC y posterior organogénesis con AIA en A. sisalana.

Figura 1 Tipos de tejido calloso en Agave wocomahi. A) nodular en explante de hoja, B) con raíz en explante de tallo, C) compacto en explante de raíz, D) friable en explante de tallo, E) con brotes en explante de tallo. 

En el presente estudio, el uso de la auxina natural AIA mostró una IC de 40 % en explantes de hoja, 30 % en tallo y 10 % en raíz, valores menores que los obtenidos con las auxinas sintéticas. El TC generado con AIA fue también más heterogéneo en cuanto a morfología y color con respecto al obtenido con las otras auxinas. En la mayoría de los tratamientos con AIA se obtuvo un TC de consistencia friable. Sobre este tejido se observaron respuestas morfogénicas como la generación de estructuras similares a brotes adventicios (Figura 2A) y a embriones somáticos en diferentes etapas de desarrollo (Figura 2B). Estos presuntos embriones se separan fácilmente del tejido calloso que generaron (Figura 2C); lo anterior resulta de interés, ya que pone de manifiesto que una misma auxina genera diferentes respuestas, tanto organogénicas como embriogénicas en explantes de tallo, hoja y raíz de A. wocomahi. Lo anterior sugiere la existencia de distintos mecanismos morfogénicos presentes no sólo en especies distintas pertenecientes a un mismo género, sino incluso a distintos tejidos de una misma planta, lo que coincide con ^{Cancino-García et al. (2020)}, quienes mencionaron que deben existir diferentes mecanismos de inducción de TC entre especies de agaves, lo cual puede estar relacionado también con variaciones en los niveles endógenos de auxinas y citocininas. Los tratamientos que sólo incluían BA mostraron una baja IC, 32 % en tallo y 8 % en hoja, no habiendo respuesta en explantes de raíz. Se observó la generación de TC tanto friable como compacto. El tejido friable fue capaz de generar estructuras similares a embriones somáticos (Figura 2D).

Figura 2 Respuestas morfogénicas en Agave wocomahi. A) organogénesis indirecta (brotes) inducida con 1.5 mg L^-1 de AIA en tallo, B) presuntos embriones somáticos visualizados entre el tejido calloso, C) embriones ya separados del tejido calloso, obtenidos con 1.5 mg L^-1 de AIA con 1.5 mg L^-1 de BA en tallo, D) estructuras similares a embriones somáticos obtenidos con 3.0 mg L^-1 de BA en tallo incubado en la oscuridad, E) presunta embriogénesis somática indirecta inducida con 1.5 mg L^-1 de AIA con 1.5 mg L^-1 de BA en hoja, F) imagen de microscopía electrónica de barrido en tejido calloso con presencia de un posible embrión somático inducido con 4.0 mg L^-1 de 2,4-D con 1.5 mg L^-1 de BA en hoja, G) plantas generadas a partir de presuntos embriones somáticos obtenidos en tallo inducido con 3.0 mg L^-1 de BA, H) estructuras similares a las etapas de la embriogénesis somática (de izquierda a derecha): callo embriogénico, embrión globular, embrión coleoptilar, embrión escutelar y embrión maduro, obtenidas a partir de tejido incubado en condiciones de oscuridad. 

Además de las respuestas descritas, en varios de los tratamientos se observó producción de brotes a través de organogénesis, tanto directa como indirecta, predominantemente en explantes de tallo y hoja; ésto ocurrió en tratamientos con BA sola o combinada con AIA y ANA (Cuadro 2). En general, la eficiencia de esta vía de regeneración fue baja (máximo 2.1 brotes por explante), pero el hecho de que se presente en esta especie es de interés, ya que en el género predominan los reportes de regeneración a partir de yemas laterales o por embriogénesis somática ^{(Domínguez et al., 2008a)}.

En los experimentos con auxinas y citocininas se observaron estructuras similares a embriones somáticos en diferentes etapas de desarrollo, ésto en callo generado a partir de explantes de tallo y hoja tratados con BA, sola o combinada con 2,4-D y AIA. Al transferir estas estructuras a medio basal carente de reguladores del crecimiento, sólo o adicionado con carbón activado, se observó su desarrollo hasta convertirse en plantas completas, con un polo apical y uno radical bien definidos (Cuadro 3 y Figura 2E). El 2,4-D, que indujo esta respuesta en A. wocomahi (Figura 2F) es la auxina más utilizada para inducir TC embriogénico en el género Agave ^{(Cancino-García et al., 2020)}, aun cuando ^{García et al., (2019)} recomiendan el uso de PIC como inductor de callo embriogénico en sustitución del 2,4-D, con la finalidad de evitar los problemas que se presentan con esta auxina, principalmente anormalidades en los embriones somáticos. Cabe señalar que el efecto del PIC ha sido poco estudiado en agaves, sólo ^{Monja-Mio y Robert (2013)} han reportado su uso para la generación de embriogénesis directa en A. fourcroydes; sin embargo, en A. wocomahi los tratamientos con PIC no generaron tejido calloso con potencial embriogénico, lo que sí se observó fue la inducción de estructuras similares a embriones somáticos a partir de un TC suave-friable inducido con 3.0 mg L^-1 de BA procedente de explantes de tallo. En este caso también se obtuvieron plantas completas al eliminar los reguladores de crecimiento del medio (Figura 2G). El efecto positivo de la BA en la generación de embriones somáticos se ha reportado previamente en A. marmorata ^{(Álvarez-Aragón et al., 2020)} y A. sisalana ^{(Nikam et al., 2003)}. Finalmente, la combinación de 1.5 mg L^-1 de AIA con 1.5 y 3.0 mg L^-1 de BA generó el mayor número de estructuras similares a embriones somáticos. Su desarrollo hasta plantas completas también fue favorecido al retirarse los reguladores de crecimiento y adicionarse carbón activado al medio basal (Cuadro 3).

La mayor eficiencia observada en esta vía de regeneración fue cuando fragmentos de callo generado en explantes de tallo sometidos a 1.5 mg L^-1 de AIA con 3.0 mg L^-1 de BA fueron transferidos a medio basal con carbón activado. En este caso se obtuvo un promedio de 16.4 ± 1.89 plantas por fragmento de callo. ^{Reyes-Díaz et al. (2017)} reportaron la obtención de hasta 34 embriones somáticos por explante en A. angustifolia; también, en esta misma especie, ^{Arzate-Fernández y Mejía-Franco (2011)} mencionaron la generación de un total de 216 embriones somáticos mediante el uso de 3.0 mg L^-1 de 2,4-D en combinación de 1.0 mg L^-1 de BA; sin embargo, estos últimos autores no precisan el número promedio de plantas obtenidas por porción de tejido calloso, por lo que sus valores no son comparables de forma directa con la eficiencia reportada para A. wocomahi. Finalmente, la aparición de estructuras similares a embriones en diferentes etapas de desarrollo (Figura 2H), fácilmente disgregables del tejido calloso (Figuras 2B y 2C), y con capacidad de desarrollarse en plantas completas con sus polos apical y radical bien diferenciados (Figura 2G) parecen indicar que ocurrió embriogénesis somática; de tratarse de brotes generados por organogénesis, carecerían del polo radical y tendrían que haber sido enraizados antes de transferirlos a substrato; sin embargo, para demostrar sin lugar a duda que lo que se observó fue embriogénesis somática se requeriría de estudios histológicos completos a lo largo de todas las etapas de desarrollo antes mencionadas.

Las plantas generadas a partir de presuntos embriones somáticos alcanzaron una supervivencia de 97.3 % ex vitro. La totalidad de estas plantas mostraron un desarrollo normal, similar al de las plantas generadas a partir de meristemos basales, cuya tasa de supervivencia fue de 100 % (Figura 3). Estos resultados reflejan que dicha tasa no limita la posibilidad de supervivencia ex vitro y desarrollo inicial normal de las plantas generadas, lo cual coincide con lo observado en otras especies de agave ^{(Arzate-Fernández et al., 2016)}.

Figura 3 Plantas de Agave wocomahi adaptadas a condiciones ex vitro. A) plantas procedentes de brotes enraizados, B) plantas regeneradas por embriogénesis somática. 

Conclusiones

Se reporta por vez primera la regeneración in vitro de Agave wocomahi. Esto se logró a través de la brotación de meristemos laterales en explantes de tallo a través de organogénesis y por medio de estructuras similares a embriones somáticos generadas en tejido calloso, que se convirtieron en plantas completas al transferirlas a un medio sin reguladores de crecimiento. Las plantas generadas in vitro procedentes de brotes enraizados y las presuntamente originadas por embriogénesis somática fueron capaces de adaptarse a las condiciones externas y desarrollarse en suelo de manera normal. Estos protocolos permitirían la generación de plantas en número suficiente para que esta especie pueda ser aprovechada sin poner en riesgo a sus poblaciones silvestres.