Material vegetal

Se utilizaron frutos de nanche (Byrsonima crassifolia) Amarillo dulce, provenientes de árboles propagados mediante semilla en Tepic, Nayarit, México (21° 30′ 14″ N, 104° 53′ 42″ O, 930 msnm). La cosecha se realizó en madurez de consumo, con peso promedio de 4.93 g, contenido de sólidos solubles totales de 11.5 ºBrix y tonalidad amarilla.

Organización experimental

Los frutos se almacenaron a 20 ± 2 °C con 50-60 % de humedad relativa (HR), 8 ± 2 °C con 85 % HR y 4 ± 2 °C con 85 % HR. En los tres casos se utilizaron cuartos aislados térmicamente y las condiciones de 4 y 8 °C se establecieron con sistemas controlados de refrigeración mecánica. En los días 2 a 7 y 20 se retiraron frutos de cada condición para evaluar pérdida acumulada de peso, firmeza, color, tasas de respiración, producción de etileno, contenidos de sólidos solubles totales, fenoles solubles totales y flavonoides, así como fuga de electrolitos y actividad de la enzima peroxidasa (POD).

Los frutos manejados a 20 °C se evaluaron el día del retiro y constituyeron el tratamiento testigo. Los frutos manejados a 4 y 8 °C se trasladaron a 20 °C y se evaluaron 1 y 2 d después de permanecer en esa condición, con lo cual se formaron los tratamientos T₄₁, T₄₂, T₈₁ y T₈₂, respectivamente.

Variables respuesta

Las unidades experimentales se pesaron al inicio y al momento de su retiro del almacenamiento mediante una balanza granataria (Ohaus, Parsippany, New Jersey, EUA) con precisión de 0.01 g. Con base en la condición inicial, se determinó la pérdida acumulada de peso en g. La firmeza se expresó en Newtons (N) y se determinó con un analizador de textura (Stable Micro Systems^® Texture Analyzer Model XT2i, Godalming, Reino Unido), con sonda esférica de 5 mm de diámetro que deformó los frutos hasta 5 mm a velocidad de 2 mm s^-1 en una rutina de compresión. El color se midió en el epicarpio de cinco frutos con un colorímetro Hunter Lab (Miniscan XE Plus, Hunter Lab^®, Reston, Virginia, EUA) y se expresó como luminosidad (L*), ángulo de tono (H*) y cromaticidad (C*) (^{McGuire, 1992}). Las tasas de respiración y producción de etileno se determinaron con un método estático (^{Bolívar-Fernández et al., 2011}); para ello, los frutos de cada unidad experimental se colocaron en recipientes herméticos de 475 mL durante 1 h, se tomó una muestra del espacio de cabeza de cada recipiente y se analizó en términos de concentración de CO₂ y C₂H₄; con base en la masa de los frutos (m), el volumen libre del espacio de cabeza (V _L ), el cambio de concentración gaseosa (∆y) y el tiempo de evaluación (t), se determinó la respiración en mL kg^-1 h^-1 y la producción de etileno en μL kg^-1 h^-1 a través del cálculo [R = (∆y V _L )/(m t)]. Aunque los tratamientos de baja temperatura permanecieron a 4 y 8 °C, las determinaciones de respiración y producción de etileno se realizaron a 20 °C, después de 1 y 2 d de exponer los frutos a esta condición. Las concentraciones gaseosas se midieron con un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies^® 7890A, Santa Clara, California, EUA), que operó con N₂ como gas de arrastre y temperaturas de 150, 80 y 170 °C, en el inyector, el horno y los detectores de conductividad térmica (TCD) y de ionización de flama (FID), respectivamente.

Los sólidos solubles totales (SST) se expresaron en °Brix y se determinaron con un refractómetro ( CVQ-4012, VelaQuin^®, México) en jugo de los frutos obtenido mediante compresión. La fuga de electrolitos (FE) se determinó con la metodología descrita por ^{Quiroz-González et al. (2017)} con modificaciones. Se colocaron mitades de frutos de peso de 1.0 g en 20 mL de agua destilada y se mantuvieron así durante 24 h. El líquido de una muestra se sometió a evaluación de conductividad eléctrica (CE₁, mS m^-1), mediante un conductímetro (YSI Professional Series Pro 30^®, Yellow Springs, Ohio, EUA); después, otra muestra se trató por 50 min en autoclave para obtener la máxima FE, de donde se obtuvo el líquido y se evaluó en términos de conductividad eléctrica (CE ₂ , mS m^-1). Se calculó FE como [%FE = 100× CE ₁ / CE ₂ ].

Para evaluar contenido total de fenoles solubles y flavonoides se prepararon extractos con muestras de 1.0 g de pulpa de los frutos sumergidas en 10 mL de metanol 80 % y agitadas en vórtex (Symphony VWR, Shanghai, China) por 1 min a 1500 rpm; se ajustó el pH a 4.0 y cada muestra se agitó nuevamente a 1500 rpm durante 3 min (^{Dudonné et al., 2009}); después, se aplicó sonicación en equipo Cole-Parmer 8890 (Vernon Hills, Illinois, USA) por 30 min en oscuridad y se agitó en oscuridad en incubación (INO-650M, Prendo^®, México) a 150 rpm y 30 °C por 30 min. La mezcla se centrifugó con equipo J-600 (SolBat, Mexico) a 3400 × g por 14 min, se recuperó el sobrenadante y se aforó a 10 mL con metanol 80 %.

El contenido de fenoles solubles totales (FST) se determinó con el método del reactivo de Folin-Ciocalteu (FC) (^{Singleton y Rossi, 1965}). Se hicieron diluciones del extracto con agua destilada en proporción 1:6, se tomaron 100 μL de la dilución y se hicieron reaccionar con 250 μL de FC en tubos de ensayo durante 6 min; después, la mezcla se neutralizó con 1.25 mL de Na₂CO₃ 19 % y el volumen se ajustó a 3.0 mL con agua destilada. Las mezclas se agitaron en vórtex y se colocaron en oscuridad durante 90 min. Se aplicó centrifugación (equipo Hermle Z200, LTF-Labortechnik, Wasserburg, Alemania) a 13,000 × g durante 10 min para eliminar turbidez y se determinó absorbancia en un espectrofotómetro UV-Vis (DR 500 UV-vis HACH, Loveland, Colorado, USA) a 760 nm. La determinación se apoyó con una curva estándar de ácido gálico preparada en el rango de 0 a 90 mg mL^-1. Lo resultados se expresaron como μg equivalentes de ácido gálico por g de pulpa fresca de fruto (μg g^-1).

Para evaluar el contenido total de flavonoides se usó el método descrito por ^{Chang et al. (2002)} con modificaciones. Se realizaron diluciones del extracto en proporción 1:7 con agua destilada, se mezclaron 0.5 mL del extracto con 2.0 mL de agua destilada y con 0.15 mL de NaNO₂ 5 % y se aplicó reposo por 6 min en oscuridad; después, se agregaron 0.15 mL de AlCl₃ 10 % y la mezcla se colocó nuevamente en reposo por 6 min en oscuridad; posteriormente, se agregaron 2 mL de NaOH 4 % y se aforó a 5 mL con agua destilada. Se midió absorbancia a 510 nm con un espectrofotómetro DR 500 UV-vis y se evaluó el contenido de flavonoides totales en µg de catequina por g de pulpa fresca de fruto (µg g^-1) con el apoyo de una curva estándar de (+)-catequina en el intervalo de 0 a 290 μg mL^-1.

Se determinó actividad de la enzima peroxidasa (EC. 1.11.1.7; POD) usando polvo de acetona preparado a partir de frutos molidos con el disolvente frío (^{Balois-Morales et al., 2019}). Para medir la actividad de POD se utilizó el método descrito por ^{Alia-Tejacal et al. (2002)}, basado en un proceso de extracción con 0.1 g de polvo de acetona, 5 mL de Tris-HCl frío (100 mM, pH 7.1), 1 % de polivinilpirrolidona (PVP) y centrifugación por 30 min a 3400 × g a 4 °C. Se mezclaron 2.6 mL de buffer Tris-HCl (100 mM, pH 7.1) con 0.25 mL de guayacol (0.1 M), 0.1 mL de peróxido de hidrógeno (0.25 %) y 0.05 mL del sobrenadante. Se midió el cambio de absorbancia a 460 nm durante 3 min y se reportó actividad enzimática en unidades por miligramo (U mg^-1) de proteína, donde una unidad de actividad enzimática fue igual a 1 µmol de tetraguaiacol formado por minuto. Los ensayos se hicieron entre 22 y 24 °C.

Análisis de datos

Se realizó análisis de varianza considerando a las modalidades de almacenamiento (testigo, T₈₁, T₈₂, T₄₁ y T₄₂) y al tiempo de almacenamiento como fuentes de variación, de acuerdo con el modelo correspondiente a un diseño experimental completamente al azar. Cada unidad experimental constó de 100 g de frutos y todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Se realizó comparación de medias con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) para cada día de almacenamiento y también al interior de cada tratamiento entre distintos tiempos. El análisis se hizo con el programa SAS Ver. 8 (^{SAS Institute, 1999}).

Variables físicas

Todos los frutos perdieron peso a lo largo del almacenamiento, pero los mayores valores ocurrieron en el tratamiento testigo, con 4.31 % d^-1 en promedio, que contrastó con el material de los tratamientos T₈₁, T₈₂, T₄₁ y T₄₂, donde la pérdida fue de 1.62, 2.26, 0.72 y 0.37 % d^-1, respectivamente, durante los primeros 7 d. El comportamiento fue lineal en todos los casos, con coeficientes de determinación (R²) entre 0.88 y 0.99. La pérdida fue superior a 76 % en el testigo al completarse 20 d; además, se observó desarrollo fúngico, lo que causó pérdida total del valor comercializable. En contraste, la pérdida fue entre 30.1 y 33.2 % a 8 °C y entre 17.1 y 19.9 % a 4 °C al cumplirse 21-22 d de manejo (Cuadro 1), lo que indicó que el uso de temperatura baja permitió reducirla. La pérdida fisiológica de peso está asociada principalmente con un gradiente de presión de vapor entre los ambientes externo e interno del fruto (^{Hübert y Lang, 2012}), por lo que los resultados se explicaron por la presencia de humedad relativa de 85 % en las condiciones de refrigeración y de 60 % en el ambiente del testigo.

Los frutos presentaron firmeza de 4.89 ± 0.28 N en la etapa inmediata posterior a la cosecha. El material del testigo exhibió reducción gradual en esta propiedad durante los primeros días y alcanzó un valor de 1.44 N en el día 7. Este comportamiento se consideró normal, pues el ablandamiento está reportado como una característica que ocurre de manera natural en los tejidos vegetales durante las etapas de maduración o senescencia, por la acción de enzimas pectolíticas que causan la degradación de la pared celular (^{Wang et al., 2018}); sin embargo, la firmeza se incrementó en los frutos del tratamiento testigo hasta 6.82 N al completarse 20 d de almacenamiento y ello correspondió más bien a un endurecimiento derivado de un fenómeno de deshidratación. En contraste, los frutos de los tratamientos refrigerados exhibieron firmeza en el intervalo de 2.2 a 2.9 N (Cuadro 1) y los valores fueron mayores a los del testigo en las mediciones de todos los días (Cuadro 1), lo que indicó que la condición térmica menor causó reducción de los procesos enzimáticos; sin embargo, cuando los frutos tratados con refrigeración se transfirieron a 20 °C experimentaron velocidades de ablandamiento que variaron entre 3.2-17.8, 1.1-16.7, 10.7-16.1 y 13.4-45.0 % d^-1 en T₈₁, T₈₂, T₄₁ y T₄₂, respectivamente, en el periodo del cuarto al séptimo día, en tanto que la tasa de ablandamiento varió en el testigo entre 4.1 y 30.1 % d^-1 en el mismo periodo, donde los valores mayores en el tratamiento T₄₂ sugirieron una alteración del comportamiento en la variación de la firmeza. Al respecto, el aumento de la velocidad de ablandamiento tras una exposición a temperatura baja no adecuada está tipificada como un signo de daño por frío en frutos (^{Valenzuela et al., 2017}).

Con respecto al color, los frutos presentaron luminosidad (L*) de 66.4 %, ángulo de tono (H*) de 80.6° y cromaticidad (C*) de 59.5 en la etapa inmediata posterior a la cosecha (Cuadro 2). Con el paso del tiempo, estos atributos se redujeron en el testigo, a razón de 1.36 % d^-1, 0.80° d^-1 y 1.93 d^-1, respectivamente. El color de un material depende de la presencia de sustancias cromóforas; el valor del ángulo de matiz indicó que la tonalidad de los frutos fue cercana al amarillo, lo cual fue dado principalmente por la presencia de carotenoides (Rivera-Correa et al., 2022; Com. Pers.). Al respecto, aunque estos compuestos son relativamente estables durante el almacenamiento, la deshidratación los hace susceptibles a descomposición por oxidación (^{Rodríguez-Amaya, 1999}), con lo que se puede alterar la capacidad para reflejar o absorber la luz. Por otro lado, se identificaron algunas modificaciones en el color de los frutos de los tratamientos refrigerados, pero las diferencias, tanto a lo largo del tiempo, como entre tratamientos, fueron poco evidentes en los primeros 7 d de almacenamiento, lo que indicó que el uso de temperatura baja redujo la velocidad de cambio de estos atributos.

Variables fisiológicas

La actividad respiratoria en el testigo varió entre 1.21 y 1.93 mL kg^-1h^-1 en los primeros 7 d de almacenamiento y mostró una tendencia ascendente (Cuadro 3). Este comportamiento fue más evidente al completarse 20 d de almacenamiento, cuando alcanzó un valor de 6.8 mL kg^-1h^-1 y fue debido, probablemente, a proliferación fúngica y a un estado de senescencia avanzada. Otros estudios revelaron valores entre 0.6 y 2.2 mL kg^-1h^-1, medidos a 20 °C en frutos de similar estado de madurez en Tabasco, México (^{Rivas-Castro et al., 2019}) y entre 1.6 y 3.2 mL kg^-1h^-1, a 15 °C, para frutos en Roraima, Brasil (^{Neves et al., 2015}), los cuales fueron similares a los valores obtenidos en el presente trabajo. En los frutos sometidos a 4 y 8 °C se encontraron valores entre 1.4 y 2.3 mL kg^-1h^-1 después del traslado a la condición de 20 °C y la diferencia respecto del tratamiento testigo no fue significativa (P > 0.05), por lo que esta variable no indicó daño por frío en los materiales de esos tratamientos, pues este desorden fisiológico se acompaña de un incremento temporal de la actividad respiratoria (^{Alia et al., 2005}). Los frutos del tratamiento testigo exhibieron producción de etileno promedio de 42.51 ± 9.77 µL kg^-1h^-1 en el primer periodo de 7 d de almacenamiento, sin una tendencia clara, pero en forma congruente con la respiración se observó un incremento súbito en la producción del gas al cumplirse 20 d de almacenamiento (Cuadro 3). En el caso de los tratamientos con refrigeración, se observó un incrementó súbito (P ≤ 0.05) en ambas temperaturas (T₈₁ y T₄₁) después de 24 h a 20 °C en el día 3 de almacenamiento, pero tal comportamiento no fue consistente, pues ocurrió sólo en algunos días de muestreo y en menor magnitud, lo cual sugirió que los frutos expuestos a baja temperatura pueden experimentar daño por frío en un estado de senescencia poco avanzado.

La fuga de electrolitos (FE) tuvo un comportamiento sin cambios significativos (P > 0.05) en el material del tratamiento testigo, donde varió entre 72.8 y 75.8 % en el periodo inicial de 7 d (Cuadro 3). Esta situación fue similar en T₈₁ y T₄₁, con valores entre 62.8 y 74.8 %. En el caso de T₈₂, durante la transición de 1 a 2 d a 20 °C, el valor de FE pasó de 71.99 a 69.99 % entre los días 3 y 4, de 73.46 a 73.49 % entre los días 4 y 5, y de 67.53 a 72.45 % entre los días 5 y 6, lo que indicó que en estos frutos no se alteró la estructura física; sin embargo, el material de T₄₂ pasó de 62.81 a 88.55 % entre los días 3 y 4, de 74.31 a 80.66 % entre los días 4 y 5 y de 71.40 a 71.02 % entre los días 5 y 6 (Cuadro 3), lo que sugirió una alteración en la estructura física del tejido de los frutos en etapas tempranas de senescencia por la exposición a 4 °C, pues el daño en membranas, que constituye el evento primario de este desorden fisiológico, se identifica con un incremento en FE (^{Toivonen, 2004}).

Variables químicas

El contenido de sólidos solubles totales (SST) fue de 11.5 ± 0.5 °Brix al inicio del almacenamiento y aumentó gradualmente hasta 15.00 ± 0.58 °Brix en el tratamiento testigo durante los primeros 7 d (Cuadro 4). Al respecto, se ha reportado que los SST se incrementan con la maduración, pero el contenido ya no se modifica una vez que el fruto se separa del árbol (Rivera-Correa et al., 2022; Com. Pers.)¹, por lo que el comportamiento observado pudo más bien ser causado por un fenómeno de deshidratación. Por otro lado, el manejo refrigerado a 4 u 8 °C no alteró el contenido de SST con relación al testigo, pues las diferencias en los distintos días no fueron significativas y, aunque en el tratamiento T₄₂ se incrementó la fuga de electrolitos, ello no afectó el contenido total de sólidos solubles.

El contenido de fenoles solubles totales (FST) y flavonoides totales (FT) fue de 14.3 y 2.85 μg g^-1 en la etapa inmediata posterior a la cosecha, y en ambos casos se tuvo un incremento gradual con el tiempo, hasta alcanzar valores de 22.65 y 3.98 μg g^-1, respectivamente, al cumplirse 7 d de almacenamiento (Cuadro 4). Este comportamiento fue congruente con el reporte de ^{Neves et al. (2015)}, quienes encontraron que, tras un almacenamiento por 12 d a 15 °C, se incrementó el contenido de compuestos fenólicos de frutos de nanche en 34.8 %; los autores propusieron que ésto ocurrió en respuesta al incremento de especies reactivas del oxígeno (ROS) que acompañan el proceso de senescencia, de manera que este comportamiento puede ser usado como una estrategia para evaluar la vida de anaquel de los frutos. Por otro lado, el contenido de FST y FT se mantuvo sin cambios significativos en los materiales de T₈₁ y T₄₁, pero presentó un comportamiento errático en T₈₂ y T₄₂, donde los valores fueron significativamente mayores a los del testigo en la mayoría de los días de evaluación. Al respecto, el incremento de compuestos fenólicos en general (^{López-Martínez et al., 2020}) y de flavonoides en particular (^{Valenzuela et al., 2017}) ha sido reportado como una respuesta al estrés que experimenta un fruto por causa de un daño por frío (^{Chaudhary et al., 2017}), lo cual puede ocurrir como un aumento en una etapa temprana de afectación por frío y después disminuir (^{Bal, 2021}), y actuar como una estrategia de secuestro de ROS (^{Aghdam, 2013}). La afectación por baja temperatura no sólo incluye la modificación negativa en las membranas celulares, sino que también induce estrés oxidativo caracterizado por la producción de ROS y, en tal sentido, las enzimas antioxidantes como peroxidasa pueden reducir la concentración de ese grupo de radicales libres y contribuir a un mecanismo de defensa (^{Wang et al., 2019}). Al respecto, la actividad de la enzima peroxidasa (POD) varió entre 0.80 y 3.38 U mg^-1 en los frutos del tratamiento testigo, en tanto que fluctuó entre 0 y 4.17 U mg^-1 en los frutos de los tratamientos manejados a 4 y 8 °C y colocados a 20 °C por 1 o 2 d. En ninguno de los tratamientos se encontraron variaciones significativas a lo largo del almacenamiento de 7 d (Cuadro 5); sin embargo, la comparación en días específicos mostró que los tratamientos T₈₁ y T₄₁ exhibieron los mayores valores, pero éstos no se confirmaron en los tratamientos T₈₂ y T₄₂; es decir, en la evaluación realizada dos días después del retiro del almacenamiento refrigerado. En tal sentido, la mayor actividad de la enzima peroxidasa con relación al testigo después de 24 h del retiro de la condición de baja temperatura y el posterior decremento a 48 h del retiro, principalmente en los tratamientos a 4 °C y en menor grado en los de 8 °C, fue indicativa de la presencia de un estrés oxidativo en los tratamientos.

Factibilidad de uso de refrigeración

Los frutos evaluados en el presente estudio presentaron estado de madurez de consumo. El uso de refrigeración a 4 u 8 °C permitió reducir la pérdida de peso y provocó menor pérdida de firmeza, pero los materiales manejados a 4 °C exhibieron mayor velocidad de ablandamiento cuando se transfirieron a 20 °C. Los atributos de color no se alteraron por el manejo refrigerado y la actividad respiratoria no exhibió un incremento temporal en dichos tratamientos después del traslado a la condición de 20 °C; sin embargo, en algunos días se observó un incremento súbito en la producción de etileno después del retiro de la condición de baja temperatura, lo cual, aunque no fue consistente, sugiere la presencia de una alteración fisiológica. Por otro lado, los tratamientos a 8 °C no experimentaron una variación en la fuga de electrolitos después del traslado a 20 °C, pero sí lo hicieron los tratamientos a 4 °C, donde con la transición de 1 a 2 d a 20 °C se observó un incremento significativo en esta variable; asimismo, se observó un incremento en el contenido de fenoles solubles totales y flavonoides totales con la transición de 1 a 2 d en los materiales tratados con refrigeración después del traslado a 20 °C. La actividad de la enzima peroxidasa se incrementó temporalmente durante el traslado a la condición térmica mayor, principalmente después de un manejo a 4 °C y en menor grado a 8 °C, lo cual, junto con comportamiento de compuestos fenólicos, sugirió el desarrollo de estrés oxidativo derivado de la exposición previa a baja temperatura. Con esta base, se encontró que el manejo de frutos de nanche a 4 °C causó síntomas de daño por frío. Es factible el uso de una temperatura de 8 °C, pero algunas manifestaciones de daño por frío pueden también desarrollarse, por lo que es recomendable la exploración de una temperatura mayor que evite completamente tal sintomatología.