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Introducción
Entre los diversos avances científicos, la nanotecnología (NT) se ha identificado como una tecnología potencial para reactivar la agricultura, industria alimentaria, purificación del agua, remediación ambiental, mejora de cultivos y la protección de las plantas (Pramanik et al., 2020). Su aplicación en diferentes cultivos ha incrementado la germinación y crecimiento de plántulas, actividad fisiológica, la expresión de los genes y la actividad bioquímica de proteínas y enzimas en las plantas, indicando su potencial para mejorar de manera sustentable el rendimiento de cultivos agrícolas (Lira et al., 2018).
La propagación in vitro de gladiolo es una alternativa a los métodos convencionales de propagación, pues aumenta la tasa de multiplicación y genera material libre de patógenos. Sin embargo, ésta se ve limitada por la contaminación causada por microrganismos (hongos, bacterias, entre otros), ya que estos, en el medio aséptico, provocan competencia por nutrientes, modificación del medio de cultivo, producción de compuestos tóxicos, reducción en la tasa de inducción de brotes y raíces o la destrucción del explante (Levitus et al., 2010; Al-Ani, 2011; Memon et al., 2012; Arab et al., 2014; Bernard et al., 2015).
La aplicación de nanopartículas (NPs) en el cultivo de tejidos vegetales se ha usado con éxito en la eliminación de contaminantes microbianos de los explantes y ha mostrado efecto positivo en la inducción de callos, organogénesis, embriogénesis somática, variación somaclonal, transformación genética y producción de metabolitos secundarios. Su efectividad depende de las dimensiones, tamaño, distribución y tipo de partíacula. La adición de NPs al medio de cultivo afecta la proliferación de callos, la multiplicación de brotes, la embriogénesis somática y el enraizamiento, al alterar la actividad de las enzimas antioxidantes, la expresión génica, la inhibición de la producción de etileno, metabolismo antioxidante y la producción de especies de oxigeno reactivo (Castro-González et al., 2019).
Recientemente, se ha impulsado el uso de NPsAg como una alternativa a los procedimientos químicos comunes para el control de contaminantes in vitro durante la producción de brotes, con menor probabilidad de que los microorganismos generen resistencia, en comparación con los antibióticos, ya que la plata ataca a una amplia gama de objetivos en los microbios; además, no causa fitotoxicidad (Rai et al., 2009; Rostami y Shahsavar, 2009; Taghizadeh y Solgi, 2014). Las NPsAg tienen gran aplicación en la biotecnología de plantas, debido a su potencial microbicida y como inductor del crecimiento de las plantas, afectando de manera positiva cuando se usa en la dosis correcta (Ku-Puch et al., 2018; Castro-González et al., 2019).
El mecanismo de la fuerte actividad antimicrobiana de las NPsAg está relacionado con el tamaño de la partícula y la superficie de contacto, con los cambios estructurales que provoca en la membrana bacteriana, con su interacción con los grupos fosforilados y azufrados de varios compuestos y con la disrupción en la producción de adenosín trifosfato y replicación del ADN (Pal et al., 2007; Monge, 2009; Durán et al., 2010). La actividad biocida de las NPsAg se ha probado en más de 600 microorganismos (Bernard et al., 2015).
Entre los métodos físicos más comunes para la desinfección está la aplicación de calor húmedo mediante el uso de la autoclave. La desinfección química se realiza generalmente con agentes químicos, que pueden ser desinfectantes o antisépticos compatibles con los tejidos biológicos (Pérez-Uz y Vázquez, 2010). Existen algunos métodos y productos químicos disponibles para controlar estas contaminaciones; sin embargo, la eficiencia de su uso es todavía limitada o son tóxicos. También se usan antibióticos para controlar las contaminaciones por bacterias, aunque pueden afectar el desarrollo y la respuesta de los explantes induciendo resistencia en las bacterias (Rostami y Shahsavar, 2009; Al-Ani, 2011; Safavi, 2012).
Con el progreso de la nanotecnología y el desarrollo de nuevas nanopartículas metálicas de plata se abre la posibilidad de utilizar estas modernas alternativas en el control de patógenos. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto antimicrobial de las NPsAg en el establecimiento de explantes de gladiolo in vitro, así como evaluar el efecto de cinco concentraciones de NPsAg como agente desinfectante del medio de cultivo.
Materiales y métodos
El trabajo se realizó en el Centro de Desarrollo Tecnológico “Tezoyuca” del FIRA (Fideicomiso Instituido en Relación a la Agricultura), en Tezoyuca, Morelos, México. La investigación constó de dos experimentos.
Se usaron cormos de gladiolo var. ‘Ámsterdam’ de un lote comercial para producción de flor de corte de un productor de la zona poniente del estado de Morelos. Se utilizaron macetas de 15.2 cm de diámetro en donde se colocó tepojal como sustrato, con granulometría de 5 mm; se plantaron los cormos y se aplicó riego diariamente por 25 d. Cuando brotaron las yemas y tuvieron de 1.5 a 2.0 cm de altura se lavaron los cormos y se aislaron los ápices cortando desde la base (con parte del tallo madre) y se obtuvieron explantes de 7 mm de diámetro de base y 1.5 cm de altura. Los explantes se sumergieron en una solución de agua desmineralizada con hipoclorito de sodio al 3 %, más 0.5 g L-1 de detergente. Los explantes se mantuvieron en agitación constante por 5 min, en condiciones de asepsia. Los ápices fueron colocados por 18 min en una solución de agua destilada estéril con hipoclorito de sodio comercial al 0.6 %, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se usaron para evaluar el efecto de las NPsAg.
Nanopartículas de plata como agente desinfectante de explantes de gladiolo in vitro
La adición de NPsAg se utilizó como auxiliar en el método de desinfección de ápices de gladiolo durante el establecimiento in vitro. El producto utilizado en esta investigación fue AgROVIT-CP, que son nanopartículas de plata esféricas de 35 ± 15 nm, funcionalizadas con polivinilpirrolidona (PVP, 10-30 kD). La solución madre original AgROVIT-CP al 20 % corresponde a una concentración de 1.2 % (peso) de plata metálica (COLPOS-Córdoba, 2014). Las NPsAg se prepararon con agua desmineralizada estéril.
Después de la desinfección con hipoclorito de sodio se formaron 16 grupos de ápices para evaluar el efecto de cuatro concentraciones de NPsAg (25, 50, 100 y 200 mg L-1), en combinación con cuatro tiempos de inmersión de los explantes (5, 10, 15, y 20 min) en la asepsia de los explantes de gladiolo. Al finalizar cada tratamiento se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril.
El medio de cultivo usado fue Murashige y Skoog (1962), suplementado con vitaminas: tiamina, piridoxina, glicina y ácido nicotínico (1 mg L-1), 120 mg L-1 de inositol, 2 mg L-1 de BA, 3 % de sacarosa, 0.75 % de agar; el pH se ajustó a 5.7. Como recipiente de cultivo se usaron tubos de ensayo (150 x 25 mm, capacidad de 55 mL) y se dosificaron 20 mL de medio de cultivo en cada uno; el medio de cultivo se esterilizó a 120 °C durante 18 min.
Después de aplicados los tratamientos con NPsAg a los ápices, con ayuda de un microscopio estereoscópico, se eliminaron las hojas de cada explante hasta que se obtuvieron ápices de 4 mm aproximadamente y se estableció un ápice por tubo de cultivo. Los tubos con los explantes se colocaron en incubación a 24 ± 2 °C de temperatura, 16 h de iluminación y 8 h de oscuridad; la irradiancia fue de 32 Em-2s-1.
El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial de tratamientos (4 x 4) y seis repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió en un tubo de ensayo con un explante.
Tres semanas después del establecimiento in vitro se evaluó la asepsia de los explantes y medio de cultivo. A las seis semanas se midió la longitud del brote (mm), número de brotes por explante y contenido de clorofila (unidades SPAD) (SPAD-502 Plus, Fledscout®).
Nanopartículas de plata como agentes antimicrobianos en el medio de cultivo
Se preparó medio de cultivo MS (1962) suplementado con vitaminas: tiamina, piridoxina, glicina, ácido nicotínico (1 mg L-1), 120 mg L-1 de inositol, 2 mg L-1 de BA, 3 % de sacarosa, 0.75 % de agar; el pH se ajustó a 5.7. El medio se colocó en matraces de 250 mL y se calentó hasta punto de ebullición, hasta que hirvió durante al menos 5 min. Las NPsAg se incorporaron al medio de cultivo en la concentración requerida para cada tratamiento (0, 25, 50, 100 y 200 mg L-1) cuando este tuvo una temperatura aproximada de 75 a 80 °C. Éste se agitó manualmente para homogeneizar las NPsAg e inmediatamente después se sirvieron alícuotas de 20 mL en tubos de ensayo (previamente esterilizados por 18 min a 120 °C); el proceso de dosificación del medio se realizó en la campana de flujo laminar. Una vez solidificado el medio de cultivo se estableció un explante por tubo. Los tubos fueron incubados en las condiciones descritas en el experimento anterior.
El experimento se estableció bajo un diseño experimental completamente al azar, con cinco tratamientos y 10 repeticiones. Tres semanas después se evaluó la asepsia de los explantes y medio de cultivo y a las seis semanas se midió la longitud del brote (mm), número de brotes por explante y contenido de clorofila (unidades SPAD) (SPAD-502 Plus, Fledscout®).
En los datos obtenidos en ambos experimentos se hicieron análisis de varianza y la prueba de comparación de medias LSD (DMS, P ≤ 0.05) mediante el paquete estadístico SAS (SAS, 2009).
Resultados y discusión
Nanopartículas de plata como agente desinfectante de explantes de gladiolo in vitro
La mayor incidencia de microorganismos se presentó cuando los explantes se desinfectaron con 25 mg L-1 de NPsAg; en tanto que el uso de 50 y 100 mg L-1 generó la mayor asepsia, misma que fue 20.74 % más alta que con 25 mg L-1. Sin embargo, al usar la mayor cantidad de NPsAg la asepsia fue 8.33 % menor que con 50 y 100 mg L-1 (Cuadro 1); esto indica que 50 y 100 mg L-1 son las mejores concentraciones de NPsAg para obtener la asepsia de explantes de gladiolo.
Cuadro 1 Efecto de la concentración de NPsAg como agente desinfectante en el establecimiento in vitro de gladiolo.
| Concentración de NPsAg (mg L-1) | Asepsia (%) | Brotes por explante (Núm.) | Diámetro de brote (mm) | Longitud de brote (mm) | Contenido de clorofila (Unidades SPAD) |
| 25 | 70.83 b | 3.25 | 9.93 | 20.68 b | 17.47 |
| 50 | 91.67 a | 3.43 | 9.62 | 28.62 a | 19.98 |
| 100 | 91.67 a | 2.68 | 9.25 | 18.18 b | 18.44 |
| 200 | 83.33 ab | 3.00 | 11.12 | 23.56 ab | 17.32 |
| DMS (P ≤ 0.05) | 14.77 | 0.76 | 2.01 | 5.73 | 4.78 |
En las columnas, medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (LSD, ≤ 0.05); DMS: Diferencia mínima significativa.
El número de brotes por explante, el diámetro de los brotes y el contenido de clorofila no presentaron diferencias por efecto de la concentración de NPsAg usada para la desinfección de los explantes.
La longitud del brote fue mayor al desinfectar los explantes con 50 mg L-1 de NPsAg; en contraste, la menor longitud de brotes se tuvo al usar 100 mg L-1; el número de brotes por explante y contenido de clorofila no presentaron diferencias estadísticas (P ≤ 0.05) (Cuadro 1, Figura 1). La asepsia y longitud de brote permiten señalar que 50 mg L-1 fue la concentración de NPsAg más adecuada para la desinfección de los explantes de gladiolo, así como para el crecimiento inicial de los ápices.
Figura 1 Efecto de la concentración de NPsAg como agente desinfectante en el establecimiento in vitro de ápices de gladiolo, seis semanas después del establecimiento (barra = 1.0 cm). A: 25 mg L-1, B: 50 mg L-1, C: 100 mg L-1, D: 200 mg L-1.
Con respecto al tiempo de exposición a las NPsAg, se observó que no hubo diferencias estadísticas entre tratamientos para la asepsia y contenido de clorofila de los explantes (Cuadro 2), lo que indica que cualquiera de los cuatro tiempos de inmersión de los explantes en NPsAg fue adecuado para una desinfección, aunque no se logró la asepsia total. Al respecto, Abdi et al. (2008), al realizar un experimento para evaluar el potencial de las nanopartículas de plata (25, 50 y 100 mg L-1) en tres tiempos de inmersión 30, 60 y 180 min para eliminar bacterias de explantes nodales de valeriana, observaron que 100 mg L-1 por 180 min de inmersión generó 89 % de explantes asépticos. Ellos señalan que las NPsAg no afectaron el crecimiento de los explantes, a pesar de utilizar un tiempo de inmersión nueve veces mayor al usado en la presente investigación. Lo anterior indica que para la desinfestación de explantes de gladiolo podría usarse mayor tiempo de exposición a las NPsAg. Por su parte, Pastelín-Solano et al. (2020) estudiaron los efectos de las NPsAg sobre la contaminación fúngica y bacteriana durante el establecimiento in vitro de la vainilla (Vanilla planifolia) en un medio semisólido, al evaluar 0, 25, 50 y 100 mg L-1 de NPsAg con 5, 10 y 20 min de exposición. Ellos reportan menor contaminación fúngica y bacteriana al usar 100 mg L-1 de NPsAg, independiente del tiempo de exposición del explante.
Cuadro 2 Efecto del tiempo de exposición de NPsAg como agente desinfectante en el establecimiento in vitro de gladiolo.
| Tiempo de inmersión (min) | Asepsia (%) | Brotes por explante (Núm.) | Diámetro de brote (mm) | Longitud de brote (mm) | Contenido de clorofila (Unidades SPAD) |
| 5 | 91.67 | 3.25 ab | 9.56 ab | 23.31 ab | 19.47 |
| 10 | 79.17 | 3.25 ab | 11.43 a | 19.25 b | 18.43 |
| 15 | 83.33 | 3.37 a | 9.75 ab | 26.56 a | 18.93 |
| 20 | 83.33 | 2.50 b | 9.18 b | 21.93 ab | 16.39 |
| DMS (P ≤ 0.05) | 14.77 | 0.76 | 2.01 | 5.73 | 4.78 |
En las columnas, medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (LSD, ≤ 0.05); DMS: Diferencia mínima significativa.
El número de brotes fue similar al desinfectar por 5 ó 10 min, pero al hacerlo por 15 min se obtuvo el mayor número de brotes; sin embargo, al aumentar a 20 min el tiempo de inmersión de los explantes el número de brotes fue menor que con los otros tres tiempos de desinfección. La longitud del brote varió de 19.25 a 26.56 mm. El mayor valor correspondió a los brotes cuyos explantes fueron desinfectados por inmersión de NPsAg durante 15 min, mientras que el menor valor se obtuvo al desinfectar por 10 min. Considerando el número de brotes por explante y longitud del brote, el mejor tiempo de inmersión en NPsAg fue 15 min (Cuadro 2, Figura 2).
Figura 2 Efecto de la concentración de NPsAg en combinación con el tiempo de inmersión en el establecimiento in vitro de gladiolo (DMS = 9.57).
La interacción de la concentración de NPsAg y el tiempo de exposición mostraron efecto altamente significativo (P ≤ 0.01) solo para el contenido de clorofila (Figura 2), indicando que la concentración y el tiempo de exposición con mejor resultado fue 100 mg L-1 con 10 min (32.40 unidades SPAD). Castro-González et al. (2019) estudiaron el efecto de la aplicación de 0, 12.5, 25, 50, 100 y 200 mg L-1 de NPsAg sobre la regeneración in vitro de stevia (Stevia rebaudiana B.) y observaron que con 25 mg L-1 aumentó el contenido de clorofila, en tanto que, con 12.5 mg L-1 los valores fueron menores. También indican que el uso de 12.5, 25 y 50 mg promovieron la más alta producción de brotes y la longitud por explante, mientras que, el tratamiento control y 200 mg L-1 mostraron la menor producción de brotes y longitud.
El uso de NPsAg es conveniente al no presentar intoxicaciones a las plantas cultivadas in vitro y eliminar agentes contaminantes. Mahna et al. (2013) indican que el uso de NPsAg, en la concentración y tiempo de exposición adecuada, pueden ser una herramienta eficaz para la eliminación de contaminantes de los tejidos de la planta. Fakhrfeshani et al. (2012) investigaron la actividad antifúngica y antibacterial de las NPsAg en la micropropagación de gerbera en cuatro concentraciones (25, 50, 100 y 200 mg L-1) y cuatro tiempos de exposición del explante (15, 30, 60 y 180 min) y reportaron que 200 mg L-1 de NPsAg por 15 min de inmersión controló exitosamente la contaminación bacterial y fúngica, sin efectos negativos sobre la regeneración de plantas de gerbera. Bello-Bello et al. (2018) presentaron el primer estudio de los efectos citotóxicos y genotóxicos promovidos por las NPsAg en plántulas de Vanilla planifolia después de un tiempo de exposición de seis semanas e identificaron 25 y 50 mg L-1 (1.5 y 3 mg L-1 de plata metálica) como concentraciones seguras para el crecimiento de Vanilla planifolia en condiciones in vitro. Por lo anterior, se puede decir que la concentración de NPsAg y el tiempo de inmersión variarán en función de la especie, así como del tipo de explante desinfectado con este agente, para obtener una desinfección adecuada sin ocasionar toxicidad.
Nanopartículas de plata como agentes antimicrobianos en el medio de cultivo
La concentración de NPsAg en el medio de cultivo tuvo efecto significativo (P ≤ 0.05) en la longitud de los brotes y contenido de clorofila (Cuadro 3). El efecto de las cuatro concentraciones de NPsAg (25, 50,100 y 200 mg L-1) mostró 100 % de asepsia en el medio de cultivo; sin embargo, con la ausencia de NPsAg la contaminación microbiana fue del 80 % (Figura 3). Safavi (2012), al evaluar cinco concentraciones de NPsAg (5, 25, 50, 75 y 100 mg L-1) como parte del medio MS, reportó buenos resultados con 100 mg L-1 de NPsAg para eliminar contaminantes bacterianos en el medio de cultivo, obteniendo buen desarrollo de explantes. Por su parte, Ouda (2014) demostró que las NPsAg son una gran promesa como agente antimicrobial para el control efectivo de fitopatógenos como la Alternaria alaternata y Botrytis cinérea. Sarmast et al. (2011) demostraron que en Araucaria excelsa R. Br. var. glauca (Norfolk Island-pino) (syn: A. heterophylla) al adicionar las NPsAg al medio de cultivo eliminaron con éxito la contaminación, a diferencia de los descontaminantes convencionales.
Cuadro 3 Efecto de la concentración de NPsAg en el medio de cultivo para el establecimiento in vitro de gladiolo.
| Concentración de NPsAg (mg L-1) | Asepsia (%) | Brotes por explante (Núm.) | Diámetro de brote (mm) | Longitud de brote (mm) | Contenido de clorofila (Unidades SPAD) |
| 0 | 20 | 3.2 | 15.00 | 40.00 ab | 16.0 b |
| 25 | 100 | 3.6 | 12.80 | 50.00 ab | 29.2 a |
| 50 | 100 | 3.8 | 16.20 | 62.00 a | 18.1 b |
| 100 | 100 | 2.8 | 13.20 | 44.00 ab | 11.0 b |
| 200 | 100 | 2.4 | 13.80 | 26.00 b | 15.2 b |
| DMS (P ≤ 0.05) | 2.01 | 4.61 | 30.93 | 9.31 |
En las columnas, medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (LSD, ≤ 0.05); DMS: Diferencia mínima significativa.
Figura 3 Efecto de la concentración de NPsAg en el medio de cultivo para el establecimiento in vitro de gladiolo.
De manera similar a lo investigado en este trabajo, Shokri et al. (2014), en un experimento con rosal, adicionaron NPsAg al medio de cultivo (0, 50, 100 y 150 mg L-1) y en otro experimento los explantes se sumergieron por 20 min en diferentes soluciones de NPsAg (0, 100, 200 y 400 mg L-1). Ellos observaron que la concentración de 100 mg L-1 adicionada directamente al medio puede reducir la contaminación bacteriana y la tasa de exudación fenólica y que la desinfección con 200 mg L-1 por 20 min de inmersión fue el mejor tratamiento para controlar la incidencia de bacterias. También, Ku-Puch et al. (2018) evaluaron el efecto microbicida de las NPsAg en la micropropagación de tomate criollo (Solanum lycopersicum) con 50 mg L-1 en cultivo en medio semisólido, lo que se tradujo en una disminución significativa de la contaminación.
El uso de nanopartículas de plata como parte del medio de cultivo, para evitar el crecimiento de agentes microbianos, contribuirá a reducir el consumo de la energía eléctrica que normalmente se requiere para esterilizar los medios de cultivo a usar en la micropropagación de plantas y en particular de producción de microcormos de gladiolo.
La longitud del brote fue mayor conforme se incrementó la cantidad de NPsAg en el medio de cultivo hasta 50 mg L-1, pero cuando la concentración fue mayor los brotes fueron más pequeños. Con 50 mg L-1 se obtuvieron brotes 35.5 % más altos en comparación con el control sin NPsAg (Cuadro 3); sin embargo, el contenido de clorofila de los brotes fue mayor con 25 mg L-1 de NPsAg, 45 % más clorofila que cuando no se usaron NPsAg. En general, considerando 4 de 5 variables, la mejor concentración de NPsAg para desinfectar el medio de cultivo y para el crecimiento de los explantes fue 50 mg L-1.
Al igual que en esta investigación, Aghdaei et al. (2012) evaluaron el efecto de las NPsAg en la micropropagación de Tecomella undulata (Roxb) e indicaron que la adición de NPsAg al medio MS aumentó el número de brotes por explante, el porcentaje de explantes que producen brotes y también la supervivencia de la planta, debido a su acción sobre el bloqueo de etileno. Sarmast y Salehi (2016) sugieren que la principal ventaja del uso de NPsAg en la horticultura se centra en las propiedades antimicrobianas y nutritivas, así como en la mejora del crecimiento de las plantas en la concentración permisible.
Conclusiones
El uso de nanopartículas de plata como auxiliar en la desinfección de explantes resultó ser una herramienta eficaz en el control de la contaminación microbiana. Los resultados de esta investigación indican que con 50 y 100 mg L-1 de NPsAg y 15 ó 20 min de exposición se obtienen resultados adecuados para la asepsia y crecimiento de los ápices de gladiolo.
