Sitio experimental

La investigación se realizó en un invernadero de cristal en la Universidad Autónoma Chapingo, Estado de México (19º 20’ N y 98º 53’ O a 2240 m de altitud); durante todo el periodo de investigación (de noviembre de 2016 a junio de 2018) se registraron la temperatura y la humedad relativa con un data logger (HOBO® U12-012, Burlington, Vermont, EUA); la temperatura promedio durante el experimento fue de 22.7 °C, con una máxima de 42 °C y una mínima de 8.2 °C; la humedad relativa media fue de 52.14 %. Se utilizaron plántulas de zarzamora cultivar Tupy procedentes de Zamora, Michoacán, las cuales fueron establecidas en macetas de 19 L de capacidad con tezontle (2 a 3 mm de diámetro) colocadas a 45 cm de distancia entre macetas y de 90 cm entre hileras, en un sistema hidropónico abierto.

Tratamientos

Los tratamientos consistieron en niveles crecientes de salinidad, expresados en términos de conductividad eléctrica (CE): 2.0 (testigo), 2.2, 2.4, 2.6, 2.8 y 3.0 dS m^-1. En el Cuadro 1 se presenta la composición de las soluciones nutritivas; los micronutrimentos se abastecieron con 0.035 g L^-1 de la mezcla comercial TradeCorp^® AZ. A las cinco semanas después del trasplante (SDT) las plantas se regaron a diario y manualmente con 1800 mL de la solución nutritiva de CE de 2.0 dS m^-1 (testigo), a las 20 SDT el volumen subió a 2500 mL, a partir de las 40 SDT éste fue de 3000 mL, con drenaje del 25 al 30 %. Los tratamientos se aplicaron diariamente a partir de las 45 SDT hasta las 77 SDT (ocho meses de tratamiento).

Diseño y unidad experimental

El diseño experimental fue completamente al azar con 10 repeticiones; la unidad experimental consistió en una maceta con una planta; sin embargo, para las variables destructivas de planta se seleccionaron al azar cinco plantas por tratamiento, por lo que el número de repeticiones en diversas variables fue de cinco, como se indica posteriormente.

Variables morfológicas y químicas evaluadas

Al final del experimento, 77 SDT, se evaluaron las siguientes variables:

Peso seco de planta. Se seleccionaron al azar cinco plantas por tratamiento, cada planta se seccionó en parte aérea y raíz, se registró el peso seco con una balanza digital Ohaus^® modelo Scout Pro (Parsippany-Troy Hills, New Jersey, EUA); para secar el material se usó una estufa con aire forzado Binder^® (Tuttlingen, Alemania) a 65 °C por 72 h o hasta peso constante.

Rendimiento por planta. Se cosechó y pesó el total de frutos por planta (g) con una balanza digital Ohaus^® modelo Scout Pro (Parsippany-Troy Hills, New Jersey, EUA).

Número de frutos por planta. Se cuantificaron todos los frutos maduros completos (con todas las drupeolas formadas y que alcanzaron un color negro brillante).

Contenido de prolina en raíz. Se determinó con el método de ^{Bates et al. (1973)}; de cinco plantas por tratamiento se pesaron 0.5 g de muestra fresca de ápices de raíz. Se realizaron lecturas a 520 nm en un espectrofotómetro ThermoSpectronic^® modelo Genesys 10 UV (New York, EUA). La concentración de prolina se estimó a partir de una curva patrón de 0 a 39 μg mL^-1 de prolina Sigma Aldrich^®.

Contenido de pigmentos fotosintéticos (PF). Se determinaron las concentraciones de clorofila A (CA), clorofila B (CB) y carotenoides (CAR) como lo indica la ^{AOAC (1980)} y la técnica descrita por ^{Witham et al. (1971)}; para ello, se utilizaron dos hojas de reciente maduración, de cada una de cinco repeticiones por tratamiento. Los resultados se expresaron en mg g^-1 p.f.

Longitud y diámetro de la caña principal. La longitud se midió en cm desde la base hasta la punta de la caña principal con un flexómetro marca Truper^® modelo Gripper-5m (China); el diámetro se midió en mm en la base de la misma caña con un vernier digital General^® No. 143 (Suiza).

Azúcares solubles totales (AST). Se determinaron con el método de antrona descrito por ^{Witham et al. (1971)}, se pesaron 2 g de raíz de la parte media y de la mezcla de cinco hojas de reciente maduración por planta, ésto se hizo en cinco repeticiones por tratamiento. Se realizaron lecturas a 600 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic^® modelo Genesys 10 UV (New York, EUA). La concentración de azúcares se calculó a partir de una curva patrón que contenía hasta 250 µg de glucosa mL^-1.

Durante el periodo de fructificación se cosecharon todos los frutos de las 10 repeticiones de cada tratamiento cuyas drupeolas estuvieran bien desarrolladas, la cosecha se realizó cuando se alcanzó el 100 % del color negro brillante y se evaluaron las variables siguientes:

Peso fresco de fruto. Se registró el peso en g de la totalidad de frutos por repetición, con una balanza digital Ohaus® modelo Scout Pro (Parsippany-Troy Hills, New Jersey, EUA).

Índice de redondez. En los mismos frutos que se registró el peso, se midió la longitud y diámetro ecuatorial con un vernier digital General^® No. 143 (Suiza); con estos datos se calculó la relación longitud/diámetro, con lo que se obtuvo el índice de redondez, donde los valores menores a 1.0 fueron considerados como ovalados, mayores a 1.0 como alargados y valores de 1.0 como redondos ^{(Martínez-Bolaños et al., 2008)}.

Firmeza del fruto. Se evaluó en los mismos frutos utilizados para el índice de redondez, con un penetrómetro Qa Supplies® modelo FT O2 (Norfolk, Virginia, EUA) con punta de 2.3 mm de grosor a la altura del diámetro ecuatorial; los resultados se expresaron en Newtons (N).

Sólidos solubles totales (SST, %). Se registraron con un refractómetro digital Atago^® modelo PAL-1 (Saitama, Japón) en la totalidad de los frutos obtenidos de las 10 repeticiones por tratamiento.

Acidez titulable (AT). Se utilizó la técnica descrita por la ^{AOAC (1980)}; el porcentaje de acidez se calculó con base en el ácido cítrico; se seleccionaron tres frutos maduros, color negro brillante, por repetición y se determinó en cinco repeticiones por tratamiento.

Azúcares solubles totales (AST) en fruto. Se determinó con el método de antrona descrito por ^{Witham et al. (1971)}, como se describió anteriormente para hojas y raíz; para ello, se seleccionaron cinco frutos maduros por tratamiento, esto se hizo en cinco repeticiones por tratamiento. Los resultados se expresaron en g 100 g^-1 p.f.

Determinación de compuestos antioxidantes en frutos

Preparación del extracto metanólico. Se usaron 5 g de pulpa obtenida de la mezcla de 10 frutos por planta (cinco repeticiones por tratamiento) con 50 mL de metanol acuoso 80 % (v/v); la mezcla se homogeneizó con agitación en un vórtex; posteriormente, la mezcla se colocó en sonicación por 15 min a temperatura ambiente, se dejó reposar por 24 h y se centrifugó por 10 min a 1400 × g ^{(Chang et al., 2002)}.

Fenoles totales. Se usaron 250 µL del sobrenadante del extracto metanólico arriba descrito y se aplicó el método de ^{Waterman y Mole (1994)}. Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de peso fresco (mg EAG 100 g^-1 p.f.).

Flavonoides. Con 500 µL del extracto metanólico se siguió la metodología de ^{Chang et al. (2002)}. Los resultados se expresaron en mg equivalentes de quercetina por 100 g de peso fresco (mg EQ 100 g^-1 p.f.).

Antocianinas. Se aplicó la metodología de ^{Giusti y Wrolstad (2001)}. La concentración se expresó en mg de antocianinas por 100 g de peso fresco de fruto.

Contenido de vitamina C. Se realizó con el método 967.21 de la ^{AOAC (1995)}, para lo cual se pesaron 0.5 g de muestra fresca de fruto y se realizó en cinco repeticiones por tratamiento. Los resultados se expresaron en mg 100 g^-1 p.f.

Actividad antioxidante del fruto. Se realizó por el método ABTS, descrito por ^{Re et al. (1999)}, a partir del extracto metanólico descrito previamente. Los resultados se expresaron en μmol equivalentes de trólox por g de peso fresco.

Análisis estadístico

Con los datos obtenidos se realizaron análisis de varianza y pruebas de medias de Tukey (P ≤ 0.05) mediante el programa SAS versión 9 ^{(SAS Institute, 2002)}.

Respuesta de la planta y rendimiento

En comparación con el testigo (2.0 dS m^-1), el peso seco de la parte aérea (PSPA) disminuyó 27 % con la CE de 2.6 dS m^-1 y 29 % con la de 3.0 dS m^-1; el peso seco de la raíz (PSR) se redujo hasta en 36 % con la CE de 2.8; el peso seco total (PST) tuvo una disminución de 30 % con las conductividades de 2.4 a 3.0 dS m^-1 (Cuadro 2). La inhibición del crecimiento y, en consecuencia, la disminución del peso se debe al estrés hídrico-osmótico generado por los tratamientos salinos ^{(Munns, 2005}; ^{Munns y Tester, 2008)}; las modificaciones en la transpiración causadas por el exceso de sales disueltas en la solución nutritiva o suelo puede desencadenar reducción en el crecimiento por falta de absorción de agua y nutrimentos por las raíces ^{(Parihar et al., 2015)}.

El rendimiento disminuyó significativamente en las plantas con conductividades eléctricas de 2.4 a 3.0 dS m^-1, con una reducción de 60 % con la conductividad más alta. El número de frutos por planta, en relación con el testigo, presentó una disminución del 34 al 50 % con las conductividades de 2.2 a 3.0 dS, pero sin diferencias estadísticas entre ellas (Cuadro 3). La reducción del rendimiento y número de frutos se debe a la salinidad en la rizósfera, lo que afecta la producción de los cultivos debido al menor crecimiento de la planta, con follaje reducido y, por lo tanto, fisiológicamente menos activo ^{(Parihar et al., 2015)} y, en consecuencia, una reducción en la formación de los fotosintatos que la planta requiere para la producción de frutos.

La concentración de prolina en la raíz se incrementó considerablemente (P ≤ 0.01) con las conductividades de 2.6 a 3.0, con esta última el aumento fue de 122 % en comparación con el testigo (Cuadro 3). Resultados similares se encontraron en fresa cv. Camarosa y en los genotipos chilenos Bau y Cucao ^{(Garriga et al., 2015)} y en los cultivares Camarosa y Chandler ^{(Turhan y Eris, 2009)} en respuesta a la salinidad. La acumulación de prolina en las hojas y la raíz en situaciones de estrés salino contribuye al ajuste osmótico del citoplasma celular, estabiliza y protege las estructuras subcelulares como membranas y proteínas y permite que se mantenga estable el potencial rédox celular ^{(Parihar et al., 2015)}.

La longitud de la caña principal no se vio afectada por los tratamientos, pero el diámetro disminuyó en 29 y 23 % con las conductividades de 2.6, 2.8 y 3.0, sin diferencias estadísticas entre ellas (Cuadro 3). En las plantas sometidas a salinidad por NaCl, el Na⁺ es retenido en las vacuolas de las bases de los tallos y raíces, o a través de las células de todo el tallo, sobre todo en aquellas plantas consideradas de tallo largo, donde las altas concentraciones del ion en el xilema pueden afectar el crecimiento del mismo ^{(Tester y Davenport, 2003)}.

La concentración de AST en la raíz presentó diferencias significativas (P ≤ 0.01) entre tratamientos, con disminución de hasta 70 % en las plantas que se desarrollaron en el medio con 3.0 dS m^-1; sin embargo, la concentración en las hojas no se afectó significativamente por los tratamientos (Cuadro 4), lo que puede deberse al consumo de los azúcares por la actividad radical para contrarrestar el estrés osmótico provocado por las conductividades eléctricas de los tratamientos, como lo es la síntesis de prolina, como se observa en el Cuadro 3. En raíces de un genotipo de arroz (Oryza sativa) sensible a salinidad (IR29) la concentración de AST disminuyó cuando el estrés salino fue prolongado ^{(Nemati et al., 2011)}.

La concentración de los pigmentos fotosintéticos se vio afectada por los tratamientos (P ≤ 0.01), los carotenoides disminuyeron a partir de la CE de 2.6 dS m^-1, pero con valores similares estadísticamente con los obtenidos con 2.8 y 3.0 dS m^-1, con una reducción de hasta 46 % con la más alta CE. Las concentraciones de clorofila A (CA), B (CB) y total (CT) disminuyeron con el aumento de la salinidad, con 3.0 dS m^-1 se observó la mayor reducción (54 % de CA, 41 % de CB y 50 % de CT) (Cuadro 4). Resultados similares se encontraron en frambueso sometido a tratamientos con diferentes niveles de salinidad (10, 20, 30 y 60 mM de NaCl) ^{(Neocleous y Vasilakakis, 2007)}; lo mismo se observó en arroz ^{(Amirjani, 2011)} con estrés por NaCl. Bajo estrés salino prolongado se acelera la senescencia de las hojas, por lo que disminuyen las concentraciones de pigmentos fotosintéticos y con ello la tasa fotosintética ^{(Munns y Tester 2008}; ^{Parida et al., 2002)}. Otra explicación proporcionada por ^{Hanafy et al. (2008)} es que la biosíntesis de clorofilas podría ser inhibida por el efecto depresivo que genera la salinidad en la absorción de iones participantes en la formación del cloroplasto como el Mg y Fe.

Calidad del fruto

El peso fresco, longitud y diámetro del fruto disminuyeron (P ≤ 0.01) a partir de la CE de 2.6 dS m^-1, sin diferencia estadística con las conductividades de 2.8 y 3.0 dS m^-1 (Cuadro 5). El índice de redondez disminuyó con las conductividades de 2.8 y 3.0 dS m^-1, con valores registrados de 0.9, por lo que los frutos fueron más ovalados que los obtenidos con las conductividades menores y el testigo (Cuadro 5). La firmeza se incrementó en 11 % con la CE de 2.8 dS m^-1; la obtenida con los demás tratamientos y el testigo fue similar estadísticamente (Cuadro 5). La disminución en el peso del fruto y firmeza por efecto de salinidad con NaCl también se observó en fresa Korona y Elsanta ^{(Keutgen y Pawelzik, 2008)}. En el presente estudio, para alcanzar la CE deseada se incrementó paulatinamente la concentración de Ca²⁺, entre otros iones, conforme la CE se incrementaba (Cuadro 1); una de las funciones del Ca²⁺ es como elemento estructural en la pared celular, con lo que influye positivamente en la firmeza al fruto.

La concentración de AST presentó una tendencia a disminuir (P ≤ 0.01) con el aumento de la salinidad, con una reducción de hasta 52 % con 3.0 dS m^-1; pero los SST y la AT se incrementaron (P ≤ 0.01) en 8 % y 22 %, respectivamente, con 2.8 y 3.0 dS m^-1, sin diferencias estadísticas entre los dos tratamientos; la relación SST/AT disminuyó (P ≤ 0.01) a partir de 2.6 dS m^-1 de CE, el valor más bajo (11.4) se registró con 3.0 dS m^-1 (Cuadro 6). La relación SST/AT disminuyó debido a que la AT se incrementó en mayor proporción que los SST; sin embargo, el valor de esta relación para zarzamora Tupy fue mayor en todos los tratamientos con salinidad que lo reportado para zarzamora (6.7) por ^{De Souza et al. (2014)}, quienes no indican el cultivar evaluado. La disminución de AST se debe a la disminución en la actividad fotosintética de las hojas, ya que los pigmentos fotosintéticos disminuyeron con la salinidad (Cuadro 4), por lo que hubo menos fotoasimilados movilizados a los frutos. El incremento en los SST y AT con las altas conductividades puede estar asociado con la reducción en el contenido de agua en el fruto, ya que esos frutos también registraron menor peso (Cuadro 5), ésto posiblemente debido al aumento de Na⁺, Cl^- o K⁺, e incluso de otros iones con los que se aumentó la salinidad ^{(Del Amor et al., 2001)}.

La concentración de fenoles (Cuadro 6) y flavonoides (Cuadro 7) disminuyó (P ≤ 0.01) con el aumento de la CE, la mayor reducción fue de 25 % en fenoles y de 29 % en flavonoides con la CE de 3.0 dS m^-1; en contraste, las antocianinas, con excepción del tratamiento con 3.0 dS m^-1, cuyo valor fue similar al del testigo, se incrementaron en 95 % con las conductividades de 2.2 a 2.8 dS m^-1, sin diferencias estadísticas entre ambas (Cuadro 7); la concentración de vitamina C, capacidad antioxidante y porcentaje de inhibición aumentaron (P ≤ 0.01) en 10, 21 y 18 %, respectivamente, con la CE de 3.0 dS m^-1 (Cuadro 7). Estos resultados coinciden con los reportados en otros cultivos, como frambueso sometido a salinidad por NaCl (10, 20, 30 y 60 mM), donde la capacidad antioxidante, fenoles y vitamina C tuvieron incrementos con el aumento de salinidad, mientras que las antocianinas no se afectaron por los tratamientos ^{(Neocleous y Vasilakakis, 2008)}. En fresa cv. Elsanta (sensible) y Korona (menos sensible) tratadas con 40 y 80 mmol L^-1 de NaCl se observó incremento en la capacidad antioxidante, contenido de fenoles y antocianinas ^{(Keutgen y Pawelzik, 2007)}. Ante el estrés abiótico que implica la salinidad, las plantas expresan distintos mecanismos de detoxificación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la célula, uno de ellos es la síntesis de compuestos antioxidantes como fenoles (que incluyen flavonoides y antocianinas) y ciertos ácidos orgánicos como el ácido ascórbico ^{(Jaleel et al., 2009)} que protegen a las células del estrés oxidativo que se presenta bajo condiciones de salinidad ^{(Munns y Tester, 2008)}.