Introducción

La producción de trigo es afectada por factores bióticos y abióticos, dentro de los primeros se encuentran las enfermedades fungosas, principalmente las ocasionadas por especies del género Puccinia spp. La roya amarilla, causada por Puccinia striiformis f. sp. tritici, está presente en más de 60 países y, de acuerdo con la incidencia y severidad con la que se presente la enfermedad, puede ocasionar pérdida en el rendimiento hasta de 100 % en variedades susceptibles infectadas en etapas tempranas ^{(Begum et al., 2014}; ^{Wellings, 2011)}.

Se han identificado 78 genes (Yr) que confieren resistencia a las diferentes razas de roya amarilla ^{(McIntosh et al., 2017)}. El gen Yr5 fue descrito por ^{Macer (1966)} en Triticum spelta var. album, la resistencia de éste no se utilizó en cultivares comerciales de trigo por mucho tiempo después de su identificación, hasta hace poco. Recientemente, ^{Marchal et al. (2018)} clonaron Yr5 (en adelante referido como Yr5a) y mostraron que es alélico a YrSP (Spalding Prolific) = Yr5b y parálogo a Yr7. El gen Yr15 se descubrió en la década de los 1980s en la accesión G25 de Triticum dicoccoides ^{(Gerechter-Amitai et al., 1989)}. Desde su introgresión inicial en Israel, los programas de mejoramiento han utilizado las líneas resultantes como fuente de resistencia en cultivares de trigo duro y harinero ^{(Chen y Kang, 2017)}.

En la última década se han reportado epidemias de roya amarilla en diferentes regiones del mundo, incluyendo el centro y oeste de Asia, norte y este de África ^{(Ali et al., 2017)}, así como en Europa con la raza Warrior (virulenta a: Yr1, Yr2, Yr3, Yr4, Yr6, Yr7, Yr9, Yr17, Yr32 y Yr5b), que se identificó por primera vez en 2011 en el Reino Unido ^{(Hubbard et al., 2015)}. ^{Ali et al. (2017)} llevaron a cabo un estudio durante 2009-2015 en el que recolectaron 887 aislados pertenecientes a 79 razas diferentes de 35 países. Yr5a y Yr15 fueron los únicos genes para los que no se observó virulencia, aunque ^{Nagarajan et al. (1986)} reportaron lo contrario para Yr5a en India y Australia y, posteriormente, ^{Wellings et al. (2009)} reportaron un aislado virulento en Australia. En la actualidad se considera que ninguna raza es virulenta a la combinación Yr5a y Yr15 ^{(Ali et al., 2017}; ^{Sharma-Poudyal et al., 2013)}.

En México la roya amarilla está presente en todas las zonas productoras de trigo, hasta el año 2001 el aislado más común era MEX 96.11, virulento a Yr2, Yr3, Yr6, Yr7, Yr9 y Yr27 ^{(Huerta-Espino et al., 2015)}. En 2003 una raza con virulencia a Yr8 ya se encontraba ampliamente distribuida y evolucionó venciendo la resistencia a Yr1. Para el año 2008 se detectaron variantes virulentas a Yr17 y Yr31 ^{(Huerta-Espino et al., 2015)}. ^{Rodríguez et al. (2009)} y ^{Rodríguez-García et al. (2010)} demostraron virulencia para los genes Yr1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 17, 27, Poll y A en los Valles Altos de México y regiones productoras de trigo de riego. En 2014 se identificaron los aislados CMEX14.25 (CEVAMEX14.25) y MEX 14.141 virulentos a Yr2, Yr3, Yr6, Yr7, Yr8, Yr9, Yr17, Yr27 y Yr31, lo que ocasionó pérdidas en los rendimientos del cultivar Luminaria F2012, recomendado para siembras en áreas de riego en El Bajío ^{(Solís et al., 2016)}, así como en el cultivar Nana F2007, recomendado para siembras de temporal en México ^{(Villaseñor et al., 2014)}, en el que se registraron pérdidas en rendimiento de hasta 84 % ^{(Díaz et al., 2018)}. El patógeno continuó evolucionando y posteriormente se identificaron los aislados MEX16.03 y MEX16.04 con virulencia a Yr10 y Yr24, lo que dejó efectivos solamente a los genes Yr5a, Yr15 y Yr5b ^{(Huerta-Espino y Singh, 2017)}.

Ante estos hechos, es claro que el uso de cultivares resistentes es la mejor estrategia de manejo de la enfermedad, ya que no ocasiona costos adicionales para el agricultor por el uso de fungicidas y es segura para el medio ambiente ^{(Singh et al., 2002)}. El método de retrocruzas es muy empleado por los programas de mejoramiento y es el más adecuado para transferir un gen (o pocos genes) a un cultivar adaptado, de modo que el único cambio en el cultivar elite se deba a los genes transferidos ^{(Acquaah, 2012)}. Adicionalmente, es posible llevar a cabo selección asistida por marcadores (MAS) debido a que permite acelerar el mejoramiento tradicional al emplear marcadores moleculares y los genes deseables pueden fijarse en las primeras generaciones del programa de mejoramiento ^{(Vagndorf et al., 2018)}.

Borlaug 100 (Bor100) es un cultivar de trigo harinero de hábito de crecimiento primaveral que se originó de la selección de poblaciones segregantes de la cruza ROELFS07/4/BOW/NKT//CBRD/3/CBRD/5/FRET2/TUKURU//FRET2, llevada a cabo por el Programa de Trigo Harinero del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT), y de su posterior selección por el Programa de Mejoramiento Genético de Trigo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) del Campo Experimental Norman E. Borlaug ^{(Camacho et al., 2017)}. Bor100 posee el gen de resistencia Yr17 proveniente de Aegilops ventricosa y para el cual no hay virulencia total en las poblaciones actuales de roya amarilla. Bor100 en estado de plántula es casi inmune hasta moderadamente susceptible, dependiendo de la raza del patógeno; ante la raza MEX18.191 es susceptible en plántula y en planta adulta muestra infecciones de 40MR a 60MR en la escala del 0-100.

Blanca Grande 515 (BG515) se originó de la cruza BLANCA-GRANDE/5*Yr5_and_Yr15 ^{(GRIS, 2017)}, es de hábito de crecimiento primaveral y se liberó por Resource Seeds, Inc. en 2010. Los genes de resistencia Yr5a y Yr15 se introdujeron por cuatro generaciones de retrocruzamiento en el cultivar susceptible Blanca Grande y luego se combinaron mediante selección asistida por marcadores en la Universidad de California, Davis ^{(Jackson, 2011)}.

Tomando como base la durabilidad de la combinación Yr5a + Yr15 y la ausencia de virulencia a nivel mundial, el objetivo del presente estudio fue transferir los genes Yr5a y Yr15 al cultivar Borlaug 100 manteniendo las características agronómicas de la misma.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Se obtuvieron 139 líneas a partir de la población derivada de dos retrocruzas (BC₂), de las cuales, en 135 no se aplicó ningún criterio de selección y cuatro se seleccionaron con base en criterios agronómicos deseables. De igual forma, de la población derivada de tres retrocruzas se obtuvieron 250 líneas donde 246 fueron sin selección y cuatro con selección (389 líneas en total).

De las 389 líneas evaluadas, 287 (74 %) mostraron lecturas de 0 a 10 % en la escala de severidad de la enfermedad; de éstas, 163 líneas mostraron 0 % de infección, lo que equivale a 42 % del total. Las restantes 102 líneas (26 %) tuvieron lecturas de severidad entre 15 y 70 %, esta última fue la lectura máxima registrada. La variedad Bor100 registró lectura de 10 % de infección, lo que sugirió la posibilidad de que las 163 líneas con severidad 0 % pueden ser resultado de la introgresión del gen Yr5a, Yr15 o ambos. En estas 163 líneas se observaron fenotipos semejantes a Bor100, incluso algunos con expresiones fenotípicas superiores a dicho cultivar.

Los resultados de la evaluación en estado de plántula mostraron 300 líneas resistentes; es decir, con infección entre 0 y 6. Los 89 restantes fueron susceptibles a la raza evaluada. BG515 mostró infección de 0, mientras que Bor100 tuvo 6. La raza CMEX14.25 es avirulenta a los genes Yr1, 5a, 5b, 10, 15, 24 y Poll ^{(Huerta-Espino et al., 2015)}. Fenotípicamente no se pueden distinguir las líneas portadoras de Yr5a de otras portadoras de Yr15 u otro gen de resistencia como Yr5b (YrSP) o en combinación cuando existe más de un gen y el gen de mayor efecto es epistático ^{(Huerta-Espino et al., 2003)}; además, en México no se han identificado razas de roya amarilla virulentas a Yr5a y a Yr15; por lo anterior, se utilizaron marcadores moleculares para identificar las líneas portadoras de Yr5a y Yr15 de forma individual o en conjunto.

Los marcadores moleculares asociados a los genes Yr5a, 15 y 17 permitieron identificar líneas con los genes de resistencia a roya amarilla en sus diferentes combinaciones (Cuadro 1). Se encontró que 23 líneas fueron negativas para los tres genes, 11 provienen de tres retrocruzas y 12 a partir de dos retrocruzas, todas ellas perteneciente al grupo donde no se realizó selección.

De las 246 líneas generadas a partir de tres retrocruzas sin selección, una fue positiva sólo a Yr5a y dos positivas sólo a Yr15. Las líneas positivas únicamente al gen Yr17 son las que se encontraron en mayor cantidad (168), lo que representa 68.3 % del total de líneas de este grupo. No se encontraron líneas con la combinación Yr5a+Yr15, pero sí hubo ocho con Yr5a+Yr17. El segundo grupo con mayor cantidad estuvo conformado por las 39 líneas positivas a Yr15+Yr17, las cuales representan 15.9 %. El gen que se encontró el mayor número de veces en estado heterocigótico fue Yr15, 10 líneas en combinación con Yr17 y una negativa para Yr5a y Yr17. También se encontraron tres líneas con HetYr5a y Yr17 en estado homocigótico en forma conjunta. Las tres líneas restantes fueron HetYr17 y negativas para Yr5a y Yr15.

Al realizar dos retrocruzas se obtuvieron líneas con más combinaciones de genes. En este grupo, nuevamente, la mayor cantidad fueron positivas para Yr17 (48 líneas); sin embargo, no hubo líneas positivas solo a Yr5a y cuatro fueron positivas sólo a Yr15. La segunda combinación más frecuente fue Yr15+Yr17 con 22 líneas, que representaron el 16.3 %, seguida de Yr5a+Yr17 con 14 líneas. La combinación de HetYr5a+Yr17 se encontró 12 veces, mientras que siete líneas sólo tuvieron el gen HetYr5a. Las combinaciones HetYr15+Yr17 y HetYr17+Yr15 se encontraron en cinco y tres líneas, respectivamente. La combinación Yr5a+Yr15+Yr17 se encontró en dos líneas, otras dos HetYr17 y negativas para los otros dos genes. Solamente se encontró una línea para cada una de las siguientes combinaciones: Yr5a+Yr15, HetYr5a+Yr15+Yr17, HetYr5a+HetYr17 y HetYr5a+HetYr15+Yr17.

De las ocho líneas derivadas de la selección agronómica, cuatro de ellas a partir de tres retrocruzas fueron positivas para Yr15+Yr17; también se encontró esta combinación en dos líneas provenientes de dos retrocruzas. Las dos líneas restantes fueron positivas para los tres genes y la combinación HetYr15+Yr17, respectivamente.

Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para los dos marcadores asociados a cada gen y se obtuvieron valores de r = 0.80** para los marcadores Yr15-R5 y Yr15-R8 usados en la detección de Yr15; r = 0.89** para Y5/SPKASP3K y Yr5New usados para Yr5a; r = 0.83** para Ventriup +Ln y VPM_SNP. En el caso de los marcadores asociados a Yr17, se prefiere VPM_SNP, ya que ofrece la ventaja sobre Ventriup +Ln de detectar heterocigotos.

Las líneas de mayor interés en este estudio son aquellas que poseen los genes Yr5a y Yr15, y corresponden a las entradas 358, 368 y 395 (Cuadro 2); sin embargo, las entradas 297 y 344 presentan uno o dos de los genes en estado heterocigótico, lo que fenotípicamente se observa como resistente desde plántula por ser genes mayores y dominantes ^{(Gerechter-Amitai et al., 1989}; ^{Marchal et al., 2018)}.

Se encontró que Bor100 posee el gen Yr17, lo que justifica el gran porcentaje de líneas positivas para este gen y gran parte de su genoma es recuperado al hacer las retrocruzas. Genotipos con Yr17 se han utilizado en muchos programas de mejoramiento de trigo en Europa. La virulencia para este gen se encontró desde 1994 en Inglaterra y se extendió por el norte y oeste de Europa en los años siguientes ^{(Chen and Kang, 2017)}. Actualmente, aislados virulentos para este gen están ampliamente distribuidos en el mundo ^{(Rodríguez et al., 2009}; ^{Sharma-Poudyal et al., 2013}; ^{Wellings et al., 2009)}; no obstante, en México la raza virulenta a Yr17 es avirulenta a Yr27 y Yr31 y muestra virulencia parcial en planta adulta, por lo que Borlaug 100 en planta adulta es moderadamente resistente debido a que los aislados presentes en México son parcialmente virulentos al gen Yr17, además de la presencia de los genes de raza no especifica Yr29 y Yr30, entre otros no identificados. El gen Yr17 aún puede proporcionar resistencia contra varias razas de roya amarilla si se usa en combinación con otros genes ^{(Iqbal et al., 2016)}, como en el caso del presente estudio donde está en combinación con el Yr5a, Yr15 o ambos.

A pesar de que ^{Jackson (2011)} reportó que BG515 posee Yr5a y Yr15 en condición homocigótica, en este estudio se encontró que Yr5a está en forma heterocigótica (Cuadro 2), razón por la cual el número de líneas positivas a este gen fue bajo en comparación con las positivas a Yr15 (Cuadro 1), además de que no se utilizaron marcadores para detectar Yr5a en la etapa de retrocruzas. El número de combinaciones de genes Yr5a y Yr15 encontradas fue menor cuando se realizó una tercera retrocruza, incluso cuando se realizó selección de las cuatro líneas que mostraron la misma combinación de genes. Se ha observado que una retrocruza es suficiente para obtener líneas que posean genes de resistencia de sus progenitores donadores sin afectar el rendimiento e incluso aumentar su potencial ^{(Singh y Huerta-Espino, 2004)}. Lo anterior se confirmó en este estudio, pues cuando se realizaron tres retrocruzas la variabilidad se redujo y no se encontraron líneas positivas a los dos genes de interés (Cuadro 1).

En una cruza simple, para incorporar dos genes dominantes, la frecuencia de familias es de 15:1 (resistentes:susceptibles), de la cual se obtienen los genotipos A_B_, A_bb, aaB_, aabb (A = Yr5a⁺ , a = Yr5a ^- ; B = Yr15⁺ , b = Yr15^- ) en proporción 9:3:3:1. En BC₁ la proporción de familias es 1:1:1:1, mientras que en BC₂ la proporción es 1:3:3:9, donde las familias de interés (A_B_) se encuentran en menor proporción, lo que disminuye la probabilidad de tener Yr5a y Yr15 en conjunto de forma positiva; lo anterior sucede nuevamente en BC₃, ya que la proporción es 1:7:7:49.

En este estudio se encontró que la variedad BG515 presentó Yr5a en forma heterocigótica, por lo que la cruza inicial fue AaBB × aabb y la F₁ estuvo conformada por los genotipos AaBb y aaBb (1:1); al realizar una, dos y tres retrocruzas las proporciones son 1:1:3:3, 1:3:7:21 y 1:7:15:105, respectivamente (para los genotipos A_B_, A_bb, aaB_ y aabb), de tal forma que al avanzar en las retrocruzas la proporción de las familias con ambos genes positivos fue disminuyendo, de ahí la importancia de la selección asistida por marcadores moleculares; sin embargo, los marcadores a utilizar deben ser marcadores de diagnóstico, de lo contrario se corre el riesgo de perder los genes de resistencia en el proceso de selección o terminar con plantas positivas en baja frecuencia como en el presente estudio. Al tomar en cuenta el gen Yr17 proveniente de Bor100, la frecuencia del mismo aumentó conforme se avanzó en las retrocruzas debido a la recuperación de genoma del cultivar.

Se encontraron familias que mostraron resistencia en la evaluación en plántula, pero fueron negativas a los marcadores, posiblemente debido a la presencia de otro gen que le confiere resistencia a la raza evaluada; además, hubo casos en que los marcadores indicaron positivo para alguno de los dos genes, pero fueron susceptibles en plántula, quizá debido a mezclas de semilla durante la siembra.

La combinación de múltiples genes de resistencia efectivos en todas las etapas en una sola variedad es la mejor estrategia para una resistencia duradera a royas ^{(Hulbert y Pumphrey, 2014)}, por lo que las líneas avanzadas identificadas en el presente estudio que poseen los genes Yr5a, Yr15 y Yr17 pueden ser utilizadas en los programas de mejoramiento de trigo en México como progenitoras para el control genético de la roya amarilla; por otra parte, estas líneas genotípicamente tienen el 86 % (dos retrocruzas) del fondo genético de la variedad elite recurrente (Borlaug 100), incluso se observó que algunas líneas mostraron mejor expresión fenotípica para rendimiento de grano, por lo que serán probadas en ensayos de rendimiento en el programa de trigo del INIFAP para su futura liberación como nuevos cultivares, lo que demuestra que la metodología de la retrocruzas con la selección asistida con marcadores moleculares y selección fenotípica hacia homocigosis es una estrategia importante para mejorar la resistencia y caracteres agronómicos.

Conclusiones

Se identificaron tres familias avanzadas con las características de Borlaug 100 que poseen los genes Yr5a y Yr15 en condición homocigótica. Se identificó una familia semejante a Blanca Grande 515 (Yr5a heterocigoto, Yr15 homocigoto) y una última con ambos genes en condición heterocigótica.