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INTRODUCCIÓN
La conservación de recursos genéticos de especies forestales es fundamental para mantener la estabilidad de los bosques (FAO et al., 2007; St.Clair y Howe, 2011), la cual contribuye a la adaptación de estas especies ante la ocurrencia de diferentes factores como la infestación de plagas, los regímenes de incendios o el cambio climático (Kim et al., 2011; Vangestel et al., 2016). Adicionalmente, el conocer la estructura y diversidad genética de especies forestales es importante para la planeación y operación de programas de reforestación, ya que permite diseñar estrategias para el manejo y conservación de recursos genéticos (Bilgen y Kaya, 2017; Pazouki et al., 2016). Por otra parte, conocer la estructura y diversidad genética de especies forestales de importancia económica permite realizar programas de selección para incrementar la productividad y la probabilidad de éxito de las reforestaciones (Ivetić et al., 2016).
Pinus engelmannii Carr. es económicamente importante en el norte de México debido a sus propiedades maderables y a su amplia distribución (Ávila-Flores et al., 2016). Esta especie se distribuye en 2,450,000 ha, aproximadamente (CONAFOR, 2009) y se encuentra principalmente en los estados de Chihuahua, Durango, Sinaloa, Sonora y Zacateca (Sánchez-González, 2008). Por su distribución y potencial maderable, P. engelmannii es ampliamente utilizada en programas de reforestación (Prieto et al., 2004).
La estructura y diversidad genética se ha evaluado previamente en especies de pinos en el norte de México. Hernández-Velasco et al. (2017) encontraron diferencias genéticas entre poblaciones de P. cembroides Zucc. ssp. cembroides, P. discolor D. K. Bailey & Hawksw, P. durangensis Martínez y P. teocote Schltdl. & Cham; por su parte, Quiñones-Pérez et al. (2014) y Friedrich et al. (2018) reportaron amplia diversidad genética entre poblaciones de P. arizonica (Engelm.) Shaw y Picea chihuahuana Martínez. De igual manera, Ortiz-Olivas et al. (2017) evaluaron la diversidad genética dentro de rodales semilleros de P. engelmannii y encontraron diferencias genéticas entre las localidades evaluadas en el estado de Durango. La diversidad y estructura genética también se han evaluado a nivel de huertos semilleros en Pinus patula Schiede ex Schltdl. et Cham (Méndez-Neri et al., 2020), donde se ha encontrado que la mayor diversidad genética se encuentra dentro de los huertos.
En el estado de Chihuahua P. engelmannii se distribuye a lo largo de la Sierra Madre Occidental, con secciones discontinuas generadas por las barrancas en diferentes regiones del estado; estas barreras geográficas y la amplia distribución de la especie podrían generar poblaciones con diferencias en diversidad genética a lo largo del estado. Bajo este marco, el objetivo del presente estudio fue conocer la estructura y diferenciación genética de tres poblaciones de Pinus engelmannii en el estado de Chihuahua.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio y método de muestreo
La toma de muestras se realizó en tres sitios del estado de Chihuahua (Figura 1). Los sitios de muestreo se ubicaron en los bosques templados de las zonas norte, centro y sur del estado, en los municipios de Madera, Bocoyna y Balleza, respectivamente (Figura 1; Cuadro 1). En cada población se recolectaron hojas (acículas) de 10 individuos seleccionados al azar en el centro de diferentes rodales de masas puras de la especie. Se consideró una distancia promedio de 1 km entre cada árbol. Las muestras de acículas se colocaron en bolsas de plástico y se transportaron en hieleras al laboratorio de Genética Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), Unidad Irapuato, Guanajuato.
Figura 1 Localización geográfica de las poblaciones estudiadas de Pinus engelmannii en el estado de Chihuahua, México.
Cuadro 1 Ubicación geográfica y características ambientales de los lugares de procedencia de las tres poblaciones estudiadas de Pinus engelmannii en el estado de Chihuahua, México.
| Ubicación | Latitud N | Longitud O | Población | Municipio | Altitud (msnm) | PPT (mm) | TMA (ºC) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Norte | 29.8179 | 108.2660 | Ejido El Largo | Madera | 2324 | 625 | 12.3 |
| Centro | 28.029 | 107.5999 | Mesa de Baboreachi | Bocoyna | 2229 | 724 | 12.2 |
| Sur | 26.9319 | 106.7202 | Carretera Balleza-Guachochi | Balleza | 1559 | 490 | 18.2 |
PPT: precipitación media anual, TMA: temperatura media anual. Fuente: Climate-data.org (2019).
El tamaño de muestra se basa en los criterios propuestos por Rodríguez-Peña et al. (2018), quienes sugirieron que la técnica de AFLP es muy útil para realizar estudios de estructuras genéticas, pues es posible economizar utilizando muestras relativamente pequeñas; así mismo, Nei (1978) indicó que es posible estimar heterocigosidad promedio y distancia genética con cualquier tamaño de muestra, siempre y cuando se considere un alto número de loci.
Extracción y análisis de ADN
Para la obtención de ADN se utilizaron de dos a tres acículas por árbol; se utilizó el kit Qiagen DNeasy® 96 Plant Kit (QIAGEN Inc, Alemania). El material se molió en un mortero, el cual se desinfectó con etanol 70 % entre cada muestra. El material molido se colocó en tubos de microcentrífuga de 2 mL, junto con una esfera de metal de 5 mm (Qiagen Stainless Steel Beads). Posteriormente, las muestras fueron liofilizadas y re-molidas en un disruptor/homogeneizador de muestras TissueLyser II (Quiagen® Inc., Haan, Alemania) con dos ciclos de 30 Hz por 30 s. Las muestras molidas y liofilizadas fueron utilizadas para la extracción del ADN. Una vez realizada la extracción, el total de ADN genómico se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific™, Wilmington, Delaware, EUA) y se ajustó a una concentración de 50 ng µL-1 con agua desionizada.
El análisis AFLP se realizó utilizando el Kit IRDye® Fluorescent AFLP® Kit for Large Plant Genome Analysis (LI-COR Bioscences). El análisis comenzó con la digestión de 2 µL de ADN diluido por medio de las enzimas de restricción EcoRI y MseI; posteriormente, los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados con adaptadores para EcoRI y MseI; después, se adhirió un nucleótido extra a los inicidores (EcoRI + A y MseI + C) para realizar la pre-amplificación. La amplificación selectiva se llevó a cabo mediante cuatro combinaciones de iniciadores marcados con fluorescencia: MseI + CTC - EcoRI + ACA, MseI + CAG - EcoRI + ACT, MseI + CTA - EcoRI + AGA, MseI + CTG - EcoRI + AGC. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en un termociclador Cycler (Veriti, Applied Biosystems™ 2720, Foster City, California, EUA), con el siguiente programa: un ciclo de 94 ºC por 30 s, 65 ºC por 30 s, 72 ºC por 1 min;12 ciclos de 94 ºC por 30 s, 65 ºC por 30 s, 72 ºC por 1 min; 23 ciclos de 94 ºC por 30 s, 56 ºC por 30 s, 72 ºC por 1 min. Los productos de la amplificación selectiva (2 µL) se mezclaron con 8 µL de formamida y 1 µL de marcador Eco 700 GeneScan (Applied Biosystems). Finalmente, la separación y detección de fragmentos se realizó por medio de un secuenciador Genetic Analyzer 3730xl (Applied Biosystems).
Análisis de la información
Los electroferogramas obtenidos se organizaron en una matriz binaria de presencia (1) o ausencia (0) de bandas para realizar el análisis con el software Geneious versión R10. Se utilizó el sofware GenAIEx versión 6 (Peakall y Smouse, 2006) para obtener los estadísticos de diversidad, porcentaje de loci polimórficos, promedio de alelos por locus, número de alelos efectivos, índice de información de Shannon (I) y heterocigosidad esperada (He). Estos índices fueron estimados bajo el supuesto de que cada locus representa un par de alelos, cuando en una banda se encuentra presencia y ausencia de fragmento AFLP. La heterocigosidad esperada se estimó mediante el enfoque de Lynch y Milligan (1994), quienes utilizaron el índice de diversidad de Nei (1978) como el valor de heterocigosidad esperada. Los estadísticos de diversidad para cada población se compararon mediante la prueba Wilcoxon con corrección Bonferroni (α = 0.05).
La estructura genética de las poblaciones se infirió con base en el algoritmo de agrupamiento con un modelo Bayesiano mediante el software STRUCTURE versión 2.3.4 (Falush et al., 2007; Pritchard et al., 2000). El programa STRUCTURE se ejecutó 30 veces para cada k número de conglomerados genéticos y se analizó desde k = 1 hasta k = 10. En cada corrida se efectuaron 10,000 repeticiones de cadena de Markov-Monte Carlo (CMMC) y 20,000 periodos de rodaje (burn-in periods). Este análisis se llevó a cabo por medio de un modelo de mezcla y frecuencia de alelos correlacionados. Se consideró como número óptimo de k grupos al que obtuvo el valor mayor de la probabilidad posterior promedio (log likelihood) y de ΔK, de acuerdo con los criterios propuestos por Evanno et al. (2005). Los valores de la probabilidad posterior promedio y ΔK se obtuvieron a través del sitio web Structure Harvester (Earl y vonHoldt, 2012). Se realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992), donde se comparó entre poblaciones y entre los grupos conformados en el análisis de estructura genética. Este análisis se llevó a cabo empleando el software Info-Gen (Balzarini y Di Rienzo, 2004). El índice de flujo genético se estimó con la fórmula Nm = [0.25 (1- ΦST)/(ΦST)] (Whitlock y Mccauley, 1999) utilizando los estadísticos F (ΦST) obtenidos del AMOVA.
Para detector posibles barreras eco geográficas que afecten el flujo genético entre poblaciones, los datos fueron analizados mediante el algoritmo de Monmonier, con ayuda de software Barrier versión 2.2 (Manni et al., 2004). Los valores de Bootstrap de cada barrera fueron calculados con 100 matrices de distancias genéticas Dice. Todos los análisis fueron realizados para cada especie por separado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diversidad genética de las poblaciones
El análisis AFLP produjo 1341 bandas en total para las dos combinaciones de iniciadores, de las cuales el 76 % fueron polimórficas. Adicionalmente, se detectó un alto porcentaje de loci polimórficos dentro de las poblaciones (de 74 a 77 %). Estos resultados son mayores a los registrados con los mismos marcadores en otras especies de pinos; por ejemplo, Xu et al. (2008) encontraron 65 y 46 % de loci polimórficos en P. echinata Mill y P. taeda L., respectivamente; así mismo, Rawat et al. (2014) encontraron 36 % de loci polimórficos en P. roxburghi Sarg.
El valor de I total obtenido en este estudio es similar al encontrado para otras especies de pinos; Di y Wang (2013) evaluaron la diversidad de 20 poblaciones de P. tabulaeformis Carr. mediante marcadores AFLP y encontraron un I de 0.35; de igual manera, Androsiuk et al. (2015) encontraron un valor de I de 0.35 para 20 poblaciones de P. sylvestris L. distribuidas en 12 países europeos. Lo anterior sugiere que el nivel de diversidad genética encontrado en este estudio (I = 0.38) podría ser considerado como alto (Cuadro 2).
Cuadro 2 Parámetros de diversidad genética en tres poblaciones de Pinus engelmannii Carr. del estado de Chihuahua, México.
| Población | Porcentaje de loci polimórficos | Promedio de alelos por locus | Número de alelos efectivos | I | He |
|---|---|---|---|---|---|
| Norte | 77 | 1.539 b | 1.41 a | 0.382 a | 0.249 a |
| Centro | 74 | 1.494 c | 1.38 b | 0.364 b | 0.237 b |
| Sur | 77 | 1.550 a | 1.43 a | 0.395 a | 0.260 a |
| Total | 76 | 1.528 | 1.41 | 0.380 | 0.249 |
Valores en las columnas seguidos de la misma letra no son estadísticamente diferentes (Wilcoxon con corrección Bonferroni, P ≤ 0.05). I: índice de información de Shannon, He: heterocigosidad esperada o diversidad génica de Nei (1978).
Los niveles obtenidos de heterocigosidad pueden considerarse como intermedios si se comparan con los encontrados en investigaciones previas con AFLP. Xu et al. (2008) encontraron valores de heterocigosidad esperada desde 0.08 hasta 0.17 en P. echinata Mill y P. taeda; en contraste, Kim et al. (2011) obtuvieron 0.35 de heterocigosidad esperada en P. monticola Dougl. Si se toma como base este intervalo, se podría sugerir que P. engelmannii presenta heterocigosidad moderada en el estado de Chihuahua (He = 0.25). Los resultados obtenidos en los parámetros de diversidad indicaron que las poblaciones del norte y sur de P. engelmannii poseen mayor nivel de diversidad que la población del centro, ya que obtuvieron el mayor porcentaje de loci polimórficos (P ≤ 0.05), número de alelos por locus, índice de información de Shannon y heterocigosidad esperada (Cuadro 2).
Estructura y diferenciación genética de las poblaciones
El análisis de estructura genética (STRUCTURE) sugiere k = 2 como el número apropiado de grupos, ya que obtuvo la mayor probabilidad posterior promedio (-16134.4) y el valor de ΔK más alto (31.7). El grupo I quedó conformado por casi todos los árboles de las poblaciones del norte y centro, con excepción de tres individuos. Todos los árboles de la población sur quedaron integrados en el grupo II (Figura 2A); no obstante, los árboles de las tres poblaciones presentaron coeficientes de identidad para ambos grupos, lo cual es un indicador de que existe cierto grado de flujo genético en toda la sierra de Chihuahua. Lo anterior se puede observar en la gráfica de barras de la Figura 2A, donde los colores representan la proporción de la probabilidad de pertenecer a cada grupo. Por otro lado, el análisis de barreras genéticas (BARRIER) reveló la existencia de una discontinuidad genética (Bootstrap = 78 %) entre las poblaciones de P. engelmannii estudiadas. Esta barrera divide a la población del sur de las poblaciones del centro y norte (Figura 2B).
Figura 2 Estructura genética dentro y entre tres poblaciones de Pinus engelmannii en el estado de Chihuahua, México. A) Análisis STRUCTURE con k = 2 realizado con base en 1341 fragmentos AFLP. Cada color representa la proporción de la probabilidad de pertenecer a cada grupo. B) Estructura en contexto geográfico, el área de las gráficas circulares representa el porcentaje de árboles de cada grupo. La barra amarilla representa una barrera en el flujo genético y el número es el valor de Bootstrap (1000 remuestreos) identificado mediante análisis BARRIER. El mapa fue generado con el modelo digital de elevación esc: 1:50000, con un tamaño de celda de 30 × 30 m (INEGI, 2019).
Los sistemas montañosos, ríos y barrancas ubicados entre los municipios de Guachochi y Guadalupe y Calvo podrían actuar como barrera geográfica con influencia en el intercambio genético entre la población del sur y las poblaciones del centro y norte. Con datos del modelo digital de elevación escala 1:50000 se estimó que la anchura de los cañones va de 4 a 60 km, lo cual supone una distancia entre poblaciones de P. engelmannii de al menos 4 km en su porción más angosta y de 60 km en su porción más ancha (INEGI, 2019). Por otro lado, la distancia en línea recta entre las poblaciones muestreadas del norte y el centro es de 208 km, mientras que entre la del centro y del sur es de 200 km (INEGI, 2019). Lo anterior concuerda con investigaciones previas, como la realizada por Yang et al. (2015), quienes encontraron que barreras geográficas como sistemas montañosos y ríos han actuado como cuellos de botella en el intercambio genético entre poblaciones de P. henryi Mast y P. tabuliformis Carr. Así mismo, Wang et al. (2013) señalaron que factores geográficos y climáticos han sido causa importante de la diferenciación genética entre poblaciones de P. yunnanensis Franch.
El AMOVA determinó que existen diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre la población del sur y las poblaciones del norte y centro; sin embargo, las poblaciones del norte y centro no fueron diferentes (P = 0.28; Cuadro 3). Este resultado ratifica la sugerencia de que los programas de reforestación en el sur del estado deben realizarse con material genético de esa región, mientras que la reforestación en el norte y centro pueden realizarse con materiales de ambas regiones. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Ortiz-Olivas et al. (2017), quienes estudiaron la diversidad en rodales semilleros de P. engelmannii en el estado de Durango y encontraron una estructura genética espacial definida entre los rodales, por lo que recomendaron utilizar semilla local en los programas de reforestación de P. engelmannii. De igual manera, los resultados de este estudio coincidieron con lo señalado por Friedrich et al. (2018) para P. arizonica, quienes encontraron diferencias genéticas entre poblaciones del estado de Durango y recomendaron utilizar genotipos nativos para evitar la pérdida de las estructuras genéticas locales. El utilizar genotipos locales significa utilizar materiales adaptados e incrementar la probabilidad de éxito en programas de reforestación (Mijnsbrugge et al., 2010).
Cuadro 3 Análisis molecular de varianza (AMOVA) entre tres poblaciones de Pinus engelmannii y entre grupos formados por análisis STRUCTURE, calculado con 1341 fragmentos AFLP.
| Fuente de variación | GL | SC | CV | PV | P | ΦST | Nm |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AMOVA general | |||||||
| Entre poblaciones | 2 | 776182.67 | 10701.43 | 3.67 | 0.01 | 0.04 | 6.56 |
| Dentro de poblaciones | 27 | 7589079.2 | 281077.01 | 96.33 | 0.01 | ||
| AMOVA norte vs centro | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 286539.2 | 1648.96 | 0.61 | 0.28 | 0.01 | 40.7 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4860893.6 | 270049.64 | 99.39 | 0.001 | ||
| AMOVA norte vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 455909 | 17881.74 | 6.06 | 0.0011 | 0.06 | 3.38 |
| Dentro de poblaciones | 18 | 4987648.4 | 277091.58 | 93.94 | 0.0005 | ||
| AMOVA centro vs sur | |||||||
| Entre poblaciones | 1 | 421789.8 | 12557.65 | 4.07 | 0.045 | 0.04 | 5.74 |
| Dentro de poblaciones | 16 | 5331839.2 | 296213.29 | 95.93 | 0.042 | ||
| AMOVA grupos estructura k = 2 | |||||||
| Entre grupos | 1 | 678944.31 | 25322.55 | 8.17 | 0.0028 | 0.08 | 2.80 |
| Dentro de grupos | 27 | 7688429.82 | 284756.66 | 91.83 | 0.0025 | ||
GL: grados de libertad, SC: suma de cuadrados, CV: componente de varianza, PV: porcentaje de variación, P: nivel de significancia, ΦST: estimador de la diferencia genética promedio con 10,000 permutaciones, Nm: índice de flujo genético por número de migrantes (Whitlock y Mccauley, 1999).
La variación entre poblaciones explicó 3.67 % de la variación total, mientras que la variación dentro de las poblaciones explicó 96.33 % (Cuadro 3). Este resultado indica que existe potencial para realizar programas de selección para obtener individuos con características sobresalientes. En pinos es común que la mayor parte de la variación total se encuentre dentro de poblaciones y la variación entre poblaciones represente solamente una pequeña proporción; un ejemplo de esto es lo reportado en P. oocarpa Schiede ex Schltdl., donde se encontró que la variación entre poblaciones solamente explicó 3.6 y 0.95 % de la variación global con marcadores RAPD y AFLP, respectivamente (Díaz et al., 2001). Otro ejemplo es mencionado por Androsiuk et al. (2015), quienes encontraron que la variación entre poblaciones de P. sylvestris representó 5.3 % de la variación total.
El índice de flujo genético (Nm) promedio entre las tres poblaciones fue de 6.56 (Cuadro 3); sin embargo, al comparar entre poblaciones se encontró un flujo genético alto entre las poblaciones del norte y centro (40.7 individuos por generación), en contraste con el flujo genético que comparten estas dos poblaciones con la población del sur (3.38 y 5.74). Estos resultados son consistentes con el patrón de agrupamiento obtenido en el análisis STRUCTURE. De igual manera, los índices de flujo genético concuerdan con los resultados del análisis BARRIER, el cual reveló una barrera geográfica al flujo genético que separa a la población del sur de las poblaciones del centro y norte; a pesar de ello, el flujo genético entre poblaciones encontrado en este estudio se puede considerar alto si se compara con los valores que se han encontrado en otras coníferas; por ejemplo, Di y Wang (2013) encontraron un flujo genético de 0.57 individuos por generación entre poblaciones de P. tabulaeformis. En este mismo sentido, Xue et al. (2005) obtuvieron un índice de flujo de genético de 0.96 individuos por generación en poblaciones de Picea asperata Mast.
La diversidad y el flujo genético encontrados en este estudio podrían deberse a que los pinos se caracterizan por poseer un mecanismo eficiente de reproducción mediante la dispersión de polen a través del viento (Parker et al., 2001). Investigaciones previas han reportado que el polen de los pinos puede dispersarse a grandes distancias de la fuente de origen y ser aún viable. Williams (2010) encontró que P. taeda puede dispersar polen hasta 41 km de la fuente, Robledo-Arnuncio (2011) señaló que el polen de P. sylvestris puede viajar hasta 100 km de su población de origen y Varis et al. (2009) detectaron granos de polen viables a más de 600 km de la fuente en P. sylvestris. Por otro lado, pájaros y mamíferos pueden dispersar las semillas de pinos, lo cual también provoca flujo genético y aumenta la diversidad (McCune, 1988). Existen además datos de que los pájaros cascanueces (Nucifraga sp.) pueden transportar semillas de pinos a más de 22 km (Tomback y Linhart, 1990).
CONCLUSIONES
Existen diferencias de diversidad genética entre las poblaciones del sur y del norte con respecto a la población del centro del estado de Chihuahua. La amplia diversidad genética encontrada dentro de poblaciones muestra que existe potencial para realizar programas de selección de genotipos sobresalientes para características de interés. La población del sur se diferencia genéticamente de las poblaciones del norte y centro, las cuales presentan estructuras genéticas similares; en este sentido, los programas de reforestación en el sur del estado deben llevarse a cabo con materiales locales, mientras que la reforestación en el norte y centro pueden realizarse con materiales de ambas regiones. El alto intercambio genético que existe entre poblaciones de P. engelmannii puede ser una de las causas de la diversidad de esta especie en la región de estudio. Por otro lado, la disminución en el flujo genético entre la población del sur con las poblaciones del centro y norte podría estar asociada con la presencia de barreras orográficas como las barrancas y cañones de Chihuahua.
