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INTRODUCCIÓN
La resistencia bacteriana a los antibióticos es un grave problema de salud en todo el mundo (Livermore, 2011). Se ha propuesto que el desarrollo de terapias antivirulencia puede ser una alternativa viable para combatir infecciones con cepas resistentes, así como evitar su generación (Muñoz-Cazares et al., 2018). El modo de acción de las moléculas antivirulencia se basa en interferir en la producción de los factores que generan el daño al hospedero sin afectar la viabilidad bacteriana (Silva et al., 2016), por lo que se infiere no inducen la aparición de resistencia como los bactericidas clásicos (Rampioni et al., 2014).
Existen diferentes sitios de acción de las moléculas antivirulencia, como son los sistemas de secreción tipo 3, los sistemas de dos componentes, fimbrias y flagelos (Muñoz-Cazares et al., 2017); no obstante, en bacterias patógenas la regulación global de la virulencia es mediante la percepción de quórum (PQ) (Castillo-Juárez et al., 2017).
La PQ es un mecanismo de regulación génica que favorece el comportamiento multicelular de las bacterias, por lo que su activación es dependiente de la densidad celular bacteriana (Muñoz-Cazares et al., 2018). Existen diversos sistemas de percepción de quórum (SPQ) que se pueden agrupar de acuerdo con la naturaleza química de las moléculas autoinductoras, que son las encargadas de realizar la comunicación entre las bacterias (LaSarre y Federle, 2013).
En Chromobacterium violaceum, una bacteria saprofita de suelos y patógena oportunista de animales, la regulación de la producción del pigmento violaceina, así como algunos factores de virulencia son regulados por un SPQ basado en moléculas autoinductoras del tipo de la N-acil homoserina lactona (Montes de Oca-Mejía et al., 2015). Debido a que la violaceina es un pigmento visible de color morado, su inhibición se ha empleado como un indicador para la identificación de metabolitos inhibidores de PQ (Skogman et al., 2016).
Hasta el momento, ha sido en las plantas donde se ha identificado el mayor número de moléculas con esta propiedad, donde los compuestos de naturaleza fenólica son los más abundantes (Asfour, 2017; Hernández- Pasteur et al., 2019; Silva et al., 2016). Para el caso de los denominados fenoles de cadena larga (FCL), sus propiedades bactericidas han sido ampliamente documentadas (Hemshekhar et al., 2012); sin embargo, algunos estudios señalan que también pueden exhibir propiedades antivirulencia, como interferir en la formación de fimbrias (Lee et al., 2014), biopelículas (Jagani et al., 2009) y en la inhibición de sistemas de dos componentes (Kanojia et al., 1999).
Los fenoles de cadena larga (FCL) son estructuralmente muy diversosy se presentan en forma de mezclas complejas de donde su separación es costosa y complicada (Muñoz- Cazares et al., 2017). Recientemente, se publicó que una mezcla de fenoles de cadena larga (MFCL) rica en ácidos anacárdicos aislados de la corteza de Amphipterigyum adstringens inhibe la PQ; sin embargo, la baja concentración, aunado a que la corteza es una estructura vegetal de lento crecimiento limitan un posible uso comercial (Castillo- Juárez et al., 2013). En este sentido, la principal fuente de FCL reportada hasta el momento es el aceite obtenido del pericarpio de la nuez del Anacardium occidentale, el cual es una mezcla de ácidos anacárdicos, cardoles y cardanoles (Hemshekhar et al., 2012). En esta planta el rendimiento de los FCL es mayor, además de que se obtiene a partir del fruto (lo que no daña a la planta), además de que se han desarrollado distintas estrategias que facilitan su extracción y la separación de sus constituyentes (Hamad y Mubofu, 2015). Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue comparar la composición de las MFCL de estas dos especies vegetales y analizar su potencial para inhibir la PQ en el sistema modelo de C. violaceum para identificar fuentes de moléculas antivirulencia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de extractos orgánicos y aceite
Amphipterygium adstringens se recolectó en febrero de 2016 en el municipio de Tepecoacuilco de Trujano en el estado de Guerrero (18º 18′ 0″ N, 99º 29′ 0″ O). La corteza fresca, en trozos (1 kg) de alrededor de 0.5 cm, se sometió a un proceso de extracción consecutiva por maceración con 2.8 L de hexano (hex) y acetato de etilo (AcOEt) (J. T. Baker) por periodos de 48 h durante 7 d (Castillo-Juárez et al., 2013). El A. occidentale se recolectó en marzo del 2017 en el Puerto de San Benito en el municipio de Tapachula de Córdova y Ordoñez, en el estado de Chiapas (4º 41′ 49.2″ N, 92º 24′ 39.6″ O). El aceite conocido como CNSL por sus siglas en inglés (cashew nut shell liquid) se obtuvo de los pericarpios de la nuez (100 g) por maceración con 500 mL de hex (J. T. Baker), por periodos de 24 h durante 7 d (Morais et al., 2017). Todos los extractos se filtraron y se eliminaron los disolventes en un evaporador rotatorio R-114 (Buchi) a una temperatura de 60 ºC a 75 rpm.
Aislamiento de las MFCL de A. adstringens y A. occidentale
Para la obtención de la MFCLAa, los extractos de hex (26g) y AcOEt (34.6 g) se separaron mediante cromatografía de columna flash (71 × 6 cm) empacada con 200 g de gel de sílice (0.063-0.200 mm, malla de 70-230 ASTM). Posteriormente, las fracciones que contenían FCL se juntaron y purificaron mediante cromatografía en columna abierta (77 × 2.5 cm) empacada con 81 g de gel de sílice. Para ambas se empleó como fase móvil hex-AcOEt en diversas proporciones. Finalmente, la MFCLAa se purificó mediante cromatografía en capa fina preparativa (PLC sílica gel 60 GF254, Meck de 20 × 20 cm, 0.25 m de espesor) con un sistema de elución hex-AcOEt 70:30 v/v.
Para el caso de la MFCLAo se empleó el método propuesto por Paramashivappa, con algunas modificaciones (Paramashivappa et al., 2001). Se disolvieron 50 g del aceite (CNSL) en 300 mL de acetona (J. T. Baker), se agregó gradualmente hidróxido de calcio a 50 ºC en agitación constante y se mantuvo la reacción por 5 h, hasta la precipitación del anacardato de calcio. El precipitado se filtró a vacío en un embudo Buchner, se lavó con acetona (J. T Baker) con cantidad suficiente para eliminar los componentes que no reaccionaron y se dejó secar por 2 h. Para reconstituir los ácidos anacárdicos presentes en el precipitado, se dejó en agitación con 200 mL de agua destilada y 150 mL de HCl 11 M durante 1 h. La solución resultante fue extraída con AcOEt (2 × 150 mL). La fase orgánica se lavó con agua destilada (2 × 100 mL), se secó con sulfato de sodio anhidro y se obtuvo la MFCLAo.
Identificación y caracterización de las MFCL
La identificación de la MFCL fue realizada por la comparación de los espectros de infrarrojo con un estándar de referencia (Castillo-Juárez et al., 2013) en un equipo de espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (EITF) (Cary 630 FTIR-, 400-4.000 cm-1 a una resolución de 4 cm-1, Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA). Los datos de cromatografía líquida de alta resolución acoplado a espectrometría de masas (CL/EM) fueron registrados en un equipo Agilent 1200 Series Binary SL, con una columna Synergi 4um Polar-RP 80 Å 150 × 2.0 mm, acoplado a un detector de espectrometría de masas (Bruker Esquire 6000 ESI, Billerica, Massachusetts, USA) UV-Vis Arreglo de Diodos Waters 2996.
Evaluación de la actividad inhibidora de PQ de las MFCL
Una colonia de C. violaceum ATCC 553 se homogenizó en 5 mL de medio LB (Luria Bertani) y se incubó a 150 rpm, 28 ºC por 18 h. Posteriormente, se ajustó con medio LB a una D.O620nm = 0.1 en un espectrofotómetro (Halo MPR-96 visible, Dynamica, East Victoria, Australia) y se colocaron 200 µL del inóculo en placas de 96 pozos (Corning Costar). Posteriormente, las MFCL se disolvieron en dimetil sulfoxido (DMSO, Sigma Aldrich®) y se agregaron 5 µL en cada pozo para obtener una concentración final de 15.6, 31.2, 62.5, 125 y 250 µg mL-1. Se utilizó como control positivo una mezcla de ácidos anacárdicos (250 µg mL-1) (Castillo-Juárez et al., 2013) y como control negativo el vehículo DMSO. Las placas se incubaron a 28 ºC a 150 rpm por 2 d, para después medir el crecimiento bacteriano por cuenta viable y la inhibición de violaceina.
Para la cuantificación del pigmento se agregaron 200 µL de AcOEt en cada pozo, se centrifugó a 15,000 rpm. (Microfuge E Beckman, Brea, California, USA) y el sobrenadante se evaporó a temperatura ambiente por 24 h. Posteriormente, la violaceina se solubilizó en 200 µL de etanol al 70 % y se cuantificó a 620 nm en un espectrofotómetro (Halo MPR-96 visible, Dynamica).
Análisis estadístico
Los gráficos y los resultados son expresados en medias y desviaciones estándar, se utilizó el programa Sigma-Plot 13. Las diferencias estadísticamente significativas en ensayos in vitro fueron obtenidas de tres réplicas independientes por duplicado. Las variables en porcentaje se normalizaron mediante arcoseno y se comprobó su normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Para la comparación de las muestras, se observó si había diferencias significativas mediante ANOVA de un factor y prueba t de Student.
RESULTADOS
Estudios previos reportan un bajo rendimiento (≤ 0.096%) en la obtención de fenoles de cadena larga del tipo de ácidos anacárdicos a partir del extracto en hexano de la corteza de A. adstringens (Castillo-Juárez et al., 2013; Mata et al., 1991). En este trabajo se obtuvo una MFCL que es una cera de color blanco amarillenta con rendimiento del 0.01 %, mientras que la del A. occidentale es un aceite de color café oscuro con rendimiento del 3.24 %.
Caracterización química de las MFCL por EITF y CLAR/EM
Se realizó una comparación con una muestra estándar de ácidos anacárdicos obtenida previamente por Castillo- Juárez et al. (2013), con la cual se identificó la presencia de varios grupos funcionales característicos de absorción para este tipo de moléculas (Ribeiro et al., 2013). Las bandas de absorción correspondientes al anillo aromático de los fenoles se asocian con las señales C=C (1670 a 1640 cm-1), las asociadas a las vibraciones de estiramiento características del enlace C=O (1730 a 1650 cm-1) y las asociadas a la cadena alifática, donde se observa el estiramiento asimétrico y simétrico de los grupos metilo y metileno en el rango de 2929 a 2850 cm-1. Las bandas del grupo alcohol (O-H) se aprecian alrededor de los 3400 cm-1. Aproximadamente, la vibración del enlace C-O se observa entre 1260 y 1000 cm-1.
Mediante CLAR/EM se encontró que la MFCLAa está constituida principalmente por cinco ácidos anacárdicos de distinta longitud de cadena hidrocarbonada y grado de saturación (Figura 1, Cuadro1) (Erşan et al., 2016). Con base en su tiempo de retención y espectros de masas reportados en la literatura, los ácidos anacárdicos identificados fueron C15:0, C17:1, C17:0, C19:1 y C19:0 (Cuadro 1). Cabe señalar que no fue posible identificar con exactitud la posición de las dobles ligaduras de los ácidos anacárdicos C17:1 y C19:1, por lo que las estructuras mostradas en la Figura 1 se basan en reportes previos (Castillo-Juárez et al., 2013; Mata et al., 1991).
Se encontró que la MFCLAo estaba compuesta principalmente por cuatro ácidos anacárdicos reportados previamente para esta especie como son C15:0, C15:1, C15:2 y C15:3 (Mattison et al., 2018) (Figura 2). Cabe señalar que la principal diferencia con respecto a los presentes en la MFCLAa es que éstos están restringidos a cadenas alifáticas de 15 átomos de carbono y son principalmente de naturaleza insaturada (Cuadro 2).
Figura 1 A) Análisis por CLAR/EM de la MFCL de A. adstringens. Cromatogramas de espectros de masas de ácidos anacárdicos C15:0, m/z 347.3; B) C17:1, m/z 373.4; C) C17:0, m/z 375.6; D) C19:1, m/z 401.4; E) C19:0, m/z 403.2; F) en modo de ion negativo.
Actividad inhibidora de percepción de quórum de las MFCL
Se usó el sistema modelo de la bacteria C. violaceum, la cual regula la producción del pigmento violaceina mediante un sistema de PQ que emplea N-acil homoserina lactona, de tal forma que la inhibición de la producción del pigmento, sin afectar el crecimiento bacteriano, es considerado como una medida indirecta de la inhibición de PQ (Castillo-Juárez et al., 2013). Ninguna de las mezclas afectó significativamente el crecimiento de la bacteria, pero sí redujeron la producción del pigmento violaceina de manera dosis respuesta (Figura 3); sin embargo, aunque no existen diferencias de actividad entre las mezclas a dosis menores de 15.6 µgmL, a dosis mayores la MFCLAo inhibe con mayor efectividad la producción del pigmento (Figura 3). A 125 y 250 µg/mL-1 la MFCLAa logra una inhibición del 75 y 85 %, mientras que la MFCLAo a las mismas concentraciones lo hace significativamente en 85 y 95 %, respectivamente (P ≤ 0.05) (Figura 3).
DISCUSIÓN
Actualmente el grave problema de la resistencia a los antibióticos ha favorecido un resurgimiento en el estudio de productos naturales antimicrobianos, en los cuales se están empezando a identificar nuevos mecanismos de acción distintos al efecto bactericida (Silva et al., 2013). Ante este reto, las terapias antivirulencia se presentan como una opción factible para combatir cepas resistentes a múltiples antibióticos, con la ventaja de evitar o reducir la generación de resistencia (Nazzaro et al., 2013; Tay e Yew, 2013).
Aunque el panorama es prometedor, cabe señalar que hasta el momento no existe aún una terapia de este tipo de manera comercial y sólo algunos compuestos han demostrado un efecto positivo en estudios in vivo (LaSarre y Federle, 2013). De igual manera, en el caso de algunas moléculas como las furanonas, su aplicación se ha visto limitada por la falta de estudios preclínicos y su alta toxicidad (Muñoz-Cazares et al., 2017).
Los FCL son un grupo de metabolitos que han sido ampliamente estudiados y en los que se han identificado diversas propiedades biológicas como son las bactericidas, antitumorales, antiparasitarias, antioxidantes y contra la obesidad, por mencionar algunas (Hemshekhar et al., 2012; Morais et al., 2017; Muñoz-Cazares et al., 2017); sin embargo, en lo que respecta a sus propiedades antivirulencia los estudios son limitados.
A. adstringes es una especie vegetal endémica de México y Centroamérica de gran importancia para la población, debido a las propiedades medicinales que se le han atribuido desde épocas prehispánicas (Solares et al., 2006). En la corteza se concentran los principales metabolitos activos descubiertos, dentro de los que se encuentran compuestos de naturaleza terpénica, así como FCL (Navarrete et al., 1989). La sobreexplotación del árbol ha causado una reducción en las poblaciones silvestres en los últimos años (Solares y Gálvez, 2002). También, el bajo rendimiento de los FCL limita su uso para el desarrollo de terapias antivirulencia, ya que elevaría los costos y favorecería aún más la demanda de la corteza. En este sentido, la cantidad de FCL que se registraron en este estudio es relativamente baja, no obstante que se realizaron extracciones consecutivas con hexano y acetato de etilo (0.01 %), lo que es similar a lo reportado en estudios previos (Castillo-Juárez et al., 2013; Mata et al., 1991).
Figura 2 A) Análisis por CLAR/EM de la MFCL de A. occidentale. Cromatogramas de espectros de masas de ácidos anacárdicos C15:3, m/z 341.2; B) C15:2, m/z 343.2; C) C15:1, m/z 345.2; D) C15:0, m/z 347.2; E) En modo de ion negativo.
El aceite del pericarpio de la nuez de A. occidentale es la principal fuente de FCL empleados en la industria para la elaboración de diversos productos (Hemshekhar et al., 2012). Su alto rendimiento (Hamad y Mubofu, 2015),aunado a que su obtención se realiza de la cáscara de la nuez, lo vuelve una fuente potencial para facilitar la obtención de esta clase de metabolitos.
De igual manera, los factores bióticos y abióticos son determinantes de las variaciones de concentración y producción de metabolitos secundarios en plantas (Gouvea et al., 2012). Bajo este panorama, el uso de MFCL para el desarrollo de terapias antivirulencia es factible; sin embargo, se desconoce de qué manera la diversidad y el tipo de FCL de las mezclas puede afectar esta actividad. El análisis de composición química reveló que en ambas mezclas los principales FCL son del tipo de los ácidos anacárdicos, además de que la composición es relativamente constante con relación a estudios previos (Chuayjuljit et al., 2007; Mattison et al., 2018; Ribeiro et al., 2013).
Figura 3 Efecto de las MFCL en la producción de violaceina y el crecimiento.P ≤ 0.05.. Se muestra el porcentaje de inhibición del pigmento de violaceina (barras azules A. adstringens y verdes A. occidentale). Las barras negras (A. adstringens) y grises (A. occidentale) su efecto sobre el crecimiento expresado en log UFC mL-1. DMSO: dimetilsulfóxido; ácidos anacárdicos* : P ≤ 0.05.
Para el caso de la MFCLAa, ésta contiene ácidos anacárdicos de tamaño de cadena variable, que van de 15 a 19 átomos de carbono principalmente monoinsaturados y saturados, donde el mayoritario es el C19:1 (41 %) seguido por el 15:0 (19.8 %) (Castillo-Juárez et al., 2013; Erşan et al., 2016), mientras que la MFCLAo contiene principalmente ácidos anacárdicos de naturaleza polinsaturada y están restringidos a un largo de cadena de 15 átomos, donde los mayoritarios son el 15:3 (40 %) y el 15:2 (24 %) (Chuayjuljit et al., 2007; Mattison et al., 2018).
Los resultados obtenidos sobre la composición química de las mezclas están acordes con su apariencia física, ya que las ceras son indicativas de cadenas alifáticas saturadas, mientras que los aceites lo son de cadenas polinsaturadas. A pesar de las diferencias químicas y físicas observadas previamente, las dos MFCL inhibieron la PQ; sin embargo, a dosis altas la MFCLAo mostró un mayor efecto en la inhibición de producción de violaceina (P ≤ 0.05), lo que permite proponerla como una mejor opción para el desarrollo de terapias antivirulencia; no obstante, hay que señalar que faltan estudios complementarios in vivo que corroboren esta posible ventaja.
CONCLUSIONES
Las dos MFCL evaluadas tienen potencial para ser empleadas en el desarrollo de terapias antivirulencia; no obstante, la MFCLAo tiene la ventaja de tener un mayor rendimiento y posiblemente una mejor actividad. Los FCL son un grupo de productos naturales con gran diversidad estructural que representan una fuente importante de moléculas con potencial antivirulencia.
