Material vegetal y microbiológico

Las hojas y tallos de V. mollis Kunth se colectaron en enero de 2015 en el estado de Jalisco, México en las coordenadas 20º 21.6’ N y 102º 48’ O, a una altitud de 1800 m. La identificación taxonómica de la planta se realizó en el Instituto de Botánica de la Universidad de Guadalajara con número de registro 192,156. Las cepas bacterianas utilizadas fueron Escherichia coli (ATCC 25922), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Salmonella enterica (ATCC 9270) y Staphylococcus aureus (ATCC 6638). Las diferentes especies de Fusarium pertenecen a la colección de hongos del Laboratorio de Fitopatología del Centro Universitario de la Ciénega de la Universidad de Guadalajara. Se utilizaron cuatro especies: F. verticillioides aislado de maíz, F. oxysporum f.sp. lycopersici aislado de tomate, F. tapsinum aislado de sorgo y F. oxysporum aislado de agave tequilero.

Obtención de extractos

Las hojas y los tallos recolectados se secaron en estufa a 45 ºC durante 48 h para posteriormente ser pulverizados. Se pesaron 4 g de cada una de las muestras y se adicionaron 15 mL de solvente (agua, metanol, acetona o hexano) homogeneizando por 20 s (IKA, Ultra-Turrax®, T-25 DS1, China). Después de sonicar por 20 min, las muestras se centrifugaron a 1753 × g durante 15 min a 4 ºC. Los sobrenadantes se filtraron y al sedimento obtenido se le realizó una segunda extracción a la que se le adicionaron 30 mL de solvente (agua, metanol, acetona o hexano) repitiendo los pasos desde la homogeneización. Una vez reunidos los sobrenadantes de los extractos, se procedió a la concentración de éstos en un rotavapor (Heidolph, 4003 VAC Senso T, Schwabach, Alemania); posteriormente, se resuspendieron en sus respectivos solventes para tener una concentración final homogénea en cada uno de ellos de 30 mg mL^-1 (^{Morales-Del Río et al., 2015}).

Análisis fitoquímico

El análisis fitoquímico se realizó a los extractos empleando técnicas simples, rápidas y selectivas para la determinación de fenoles y taninos (ensayo de cloruro férrico), flavonoides (ensayo de Shinoda), saponinas (prueba de espuma), alcaloides (ensayo de Dragendorff), triterpenos (ensayo de Liebermann-Buchard) y cumarinas (ensayo de Baljet) (^{Sánchez et al., 2010}).

Cuantificación de fenoles totales

Se realizó por la técnica de Folin Ciocalteu (^{Mullen et al., 2007}). Se tomaron 50 μL de extracto y se agregaron 3 mL de agua desionizada y 250 μL de Folin 1 N. Se dejó reposar por 5 min. Posteriormente, se adicionaron 750 μL de Na₂CO₃ al 20 % y 950 μL de agua desionizada. Se dejó reposar por 30 min y se determinó la absorbancia a 765 nm. Se realizó una curva con ácido gálico. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico por g de muestra seca (mg EAG/g muestra seca).

Cuantificación de flavonoides totales

Los flavonoides totales se determinaron por el método reportado en ^{Maksimović et al. (2005)}. Se tomaron alícuotas de 0.1 mL de extracto y fueron adicionadas a 1.4 mL de agua desionizada y 0.5 mL del reactivo de flavonoides (133 mg de tricloruro de aluminio, 400 mg de acetato de sodio en 100 mL de solvente constituido por 140 mL metanol, 50 mL agua y 10 mL ácido acético). Después de 30 min a temperatura ambiente se midió la absorbancia a 415 nm. Se realizó una curva utilizando el estándar quercetina. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de quercetina por g de muestra seca (mg EQ/g muestra seca).

Actividad antibacteriana

Se utilizó la técnica de microdilución con la obtención de la concentración inhibitoria mínima (CIM). Se preparó el inóculo mediante reactivación de las cepas con solución de caldo Muller Hilton (CMH) y se incubó a 37 °C durante 24 h. Posteriormente, se ajustó cada cepa a 1 × 10⁶ CFU mL^-1 y se midió su densidad óptica a 600 nm con base en la escala 1 de McFarland (^{McFaddin, 2000}). En microplacas de 96 pozos se hicieron microdiluciones de los extractos esterilizados a través de un filtro Millipore (0.45 μm); posteriormente, se adicionaron 100 µL del microorganismo en todos los pozos y se obtuvo un volumen final en cada uno de 200 µL, con concentraciones finales de extracto desde 30 × 10³ hasta 3 μg mL^-1. Transcurrido el tiempo de incubación se leyeron las placas a 600 nm para determinar la susceptibilidad del microorganismo, todo esto por triplicado (^{Peterson y Shanholtzer, 1992}). La CIM se determinó identificando la dilución que no presentó crecimiento microbiano en comparación con el control (caldo + microorganismo). Se consideraron también otros controles como caldo puro, caldo + solvente y caldo + extractos.

Actividad antifúngica

Se determinó la actividad antifúngica mediante el método de dilución en agar (^{Del Toro-Sánchez et al., 2010}). Se prepararon medios de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA 39 g L^-1) en cajas de Petri a las cuales se adicionaron los respectivos extractos a cuatro concentraciones (0, 30, 60, 90 y 120 µg mL^-1). Antes de inocular las especies de Fusarium en las cajas con extractos, éstos se sometieron a un crecimiento previo de 48 a 72 h; posteriormente, se adicionaron 5 mL de agua bidestilada estéril y se raspó la superficie del cultivo fúngico sin rayar el medio sólido. Después de la homogenización, se tomaron 20 µL de suspensión micelial y se depositaron suavemente en el centro de la caja de Petri, se dejó secar 10 min en una campana de flujo laminar de bioseguridad clase IIA y se incubó durante 4 d a 28 ± 1 ºC. Se tomaron como controles cajas de Petri con medio PDA inoculadas con el hongo sin extracto y con los solventes. Los resultados se reportaron como porcentaje de inhibición obtenido por la comparación de los diámetros miceliales (medidos con un Vernier) de los controles con las muestras según la siguiente fórmula:

Adicionalmente, con los datos obtenidos se graficaron curvas de concentración contra porcentaje de inhibición y se calculó la concentración fungicida media (CF₅₀).

Análisis estadístico

El análisis estadístico realizado fue con tres repeticiones con diseño completamente al azar y arreglo multifactorial y se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba DMS, (Diferencia Minima Significativa) (P ≤ 0.05) mediante el programa Statgraphics Centurión XV v.15.2.06.

Análisis fitoquímico

Los fenoles o taninos, así como los flavonoides, fueron los compuestos más abundantes en los extractos acuosos y metanólicos de hoja y tallo (Cuadro 1), estos resultados coinciden con los obtenidos por ^{Medina et al. (2017)}, quienes reportaron que los compuestos mayoritarios presentes en extractos metánolicos de V. mollis corresponden a fenoles. Los resultados sugieren que la hoja presenta fenoles o taninos hidrolizables, mientras que los de tallo tienen tanto hidrolizables como del tipo catecol. Las cumarinas sólo se identificaron en los extractos acuosos y metanólicos de tallos. Las hidroxicumarinas sencillas son solubles en agua y en soluciones alcohólicas. Las pirano y furanocumarinas son solubles en los mismos solventes, pero también en disolventes orgánicos no polares; por lo tanto, de acuerdo con los resultados obtenidos, los extractos acuosos y metanólicos presentan cumarinas del tipo hidroxicumarinas, ya que en el extracto apolar (hexánico) no se detectó la presencia de estos compuestos. Los triterpenos fueron los compuestos mayoritarios detectados en los extractos hexánicos, principalmente en los de tallo. No se lograron detectar saponinas y alcaloides en ningún extracto de las diferentes partes de la planta.

Con respecto a la cuantificación de fenoles totales, los extractos metanólicos y acuosos tanto de hoja (37.91 ± 1.56 y 20.91 ± 0.86 mg EAG/g muestra seca, respectivamente) como de tallo (33.46 ± 0.77 y 29.46 ± 0.99 mg EAG/g muestra seca, respectivamente) presentaron la mayor cantidad (Figura 1). Un comportamiento similar se observó en los flavonoides en los extractos metanólicos y acuosos de hoja (21.67 ± 1.23 y 12.47 ± 1.11 mg EQ/g muestra seca, respectivamente) y tallo (26.83 ± 0.51 y 22.21 ± 0.65 mg EQ/g muestra seca, respectivamente), donde los extractos del tallo fueron los que sobresalieron con este tipo de compuestos. Los flavonoides forman parte de los fenoles; por lo tanto, estos resultados demuestran que la mayor cantidad de los fenoles son del tipo flavonoide, ya que la cantidad de flavonoides es mayor al 50 % en todas las muestras con respecto a los fenoles, excepto en los extractos hexánicos (Figura 1).

Figura 1 Fenoles y flavonoides totales de los extractos acuoso (Ac), metanólico (M), acetónico (A) y hexánico (He), de las hojas (H) y los tallos (T) de Vitex mollis. Valores promedio de tres repeticiones ± desviación estándar.  

Actividad antibacteriana

De los cuatro tipos de extractos evaluados (acuoso, metanólico, acetónico y hexánico), los extractos hexánicos no presentaron inhibición en los microorganismos analizados (E. coli, M. luteus, S. enterica y S. aureus). Los extractos metanólicos presentaron mayor inhibición contra las bacterias estudiadas, le siguieron los acetónicos y posteriormente los acuosos (Cuadro 2); por lo tanto, los diferentes extractos obtenidos presentaron diferencias significativas entre ellos (P = 0.00023). Por otra parte, los tallos de V. mollis fueron más efectivos que las hojas, por lo que el factor tejido de la planta fue significativo (P = 0.0082) demostrando por la prueba DMS que los extractos de los tallos inhiben el crecimiento bacteriano con mayor actividad.

Salmonella enterica fue la bacteria más inhibida por el extracto metanólico de tallo (CIM = 28 μg mL^-1), le siguieron M. luteus (CIM = 32 μg mL^-1), S. aureus (CIM = 75 μg mL^-1) y E. coli (CIM = 80 μg mL^-1) (Cuadro 2). ^{Kuete (2010)} clasifica la potencia de las CIM de los extractos de plantas en significativo (< 100 μg mL^-1), moderado (100 < CIM ≤ 625 μg mL^-1) y débil (> 625 μg mL^-1); por lo tanto, al considerar esta clasificación, los extractos metanólicos tanto de tallo como de hoja son significativos para todos los microorganismos estudiados. Los extractos acetónicos tuvieron potencia inhibitoria moderada para todas las bacterias, los extractos acuosos tienen potencia moderada para M. luteus, S. enterica y S. aureus, mientras que para E. coli fue débil.

Actividad antifúngica

De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó que los extractos que presentaron mejor porcentaje de inhibición contra las diferentes especies de Fusarium fueron los metanólicos y acuosos, le siguieron los acetónicos y en menor medida los hexánicos. De forma general, la concentración más alta estudiada (120 μg mL^-1) presentó mayor inhibición en la mayoría de las especies de Fusarium analizadas. La parte de la planta que mejor efecto inhibitorio presentó fue la de tallo, y el Fusarium más afectado frente a los extractos de V. mollis fue F. verticillioides aislado de maíz.

El efecto inhibitorio en F. verticillioides de extractos de hoja y tallo de V. mollis se puede observar en las Figuras 2 y 3, con aproximadamente 62 y 91 % de inhibición con el extracto metanólico, respectivamente. No se observaron diferencias significativas (P ≥ 0.05) entre las concentraciones de 90 y 120 μg mL^-1 en los extractos metanólicos de hoja (Figura 2). En los de tallo, las concentraciones 60 y 90 μg mL^-1 no presentaron diferencias significativas (P ≥ 0.05) (Figura 3). Se observa el mismo comportamiento en los extractos acuosos que inhiben tan solo 7 y 12 % menos en hojas y tallos, respectivamente, en comparación con los metanólicos.

Figura 2 Porcentajes de inhibición de los extractos de hoja de Vitex mollis sobre las diferentes especies de Fusarium. Valores promedio de tres repeticiones ± desviación estándar.  

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici presentó 39 y 51 % de inhibición de hoja (Figura 2) y tallo (Figura 3), respectivamente; en los extractos metanólicos no se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones intermedias de las hojas, mientras que en las de tallo fueron las dos concentraciones mayores las que no tienen diferencias significativas (P ≥ 0.05). En comparación con los extractos metanólicos, los extractos acuosos presentaron 19 y 23 % menos inhibición en hoja y tallo, respectivamente. En este último solvente, no hubo diferencias significativas entre las concentraciones de 60, 90 y 120 μg mL^-1 en los extractos de hoja (P ≥ 0.05); sin embargo, todas las concentraciones analizadas de tallo fueron significativamente diferentes entre ellas (P ≤ 0.05), mostrando la mejor actividad inhibitoria la de mayor concentración.

Figura 3 Porcentajes de inhibición de los extractos de tallo de Vitex mollis sobre las diferentes especies de Fusarium. Valores promedio de tres repeticiones ± desviación estándar. 

Por otra parte, F. tapsinum fue otro de los hongos que se inhibió en menor proporción por los extractos de V. mollis, junto con F. oxysporum f.sp. lycopersici. Los extractos metanólicos de hoja presentaron aproximadamente 38 % de inhibición (Figura 2) y los de tallo 55 % (Figura 3), no hubo diferencias significativas (P ≥ 0.05) con respecto a F. oxysporum f.sp. lycopersici. El mismo comportamiento fue observado en los extractos acuosos en ambos hongos.

Finalmente, F. oxysporum fue el segundo hongo más inhibido por los extractos de V. mollis, presentando 63 y 80 % de inhibición con los extractos metanólicos de hoja (Figura 2) y tallo, respectivamente (Figura 3). En este mismo solvente todas las concentraciones estudiadas mostraron diferencias significativas (P ≤ 0.05) en los extractos de ambas partes de la planta, la concentración más alta fue la que produjo mejor porcentaje de inhibición. Los extractos acuosos de hoja presentaron 17 % menos inhibición en comparación con los metanólicos, mientras que se observó 15 % menos en tallos.

El orden de los hongos inhibidos por la concentración más alta de los extractos, tanto metanólicos como acuosos de tallo de V. mollis fue: F. verticillioides > F. oxysporum > F. tapsinum > F. oxysporum f.sp. lycopersici; sin embargo, solo se logró determinar la concentración fúngica media (CF₅₀) de F. verticillioides (Cuadro 3) en hoja y tallo de los extractos acuosos y metanólicos, así como los de tallo en estos mismos solventes en F. oxysporum. De acuerdo con los resultados, el extracto que obtuvo la mejor actividad antifúngica fue el metanólico de tallos (29.8 μg mL^-1).