Material vegetal

Se colectaron muestras de hoja de 19, 23 y 24 individuos de A. salmiana ssp. crassispina en tres poblaciones silvestres: Aquiles Serdán (AqS) (23^o 16' 52.74" N, 100^o 55' 12.08" O), El Cuervo (EC) (23^o 14' 59.81" N, 100^o 55' 39.94" O), ambas localizadas en el municipio de Charcas, San Luis Potosí; e Ipiña (Ipi) (22^o 26' N, 101^o 19' 30" O) en el municipio de Ahualulco, San Luis Potosí. Las tres poblaciones muestreadas son explotadas para la producción de mezcal. La distancia entre los sitios Aquiles Serdán y El Cuervo es 1.5 km, y ambos sitios están ubicados a 101 km aproximadamente de Ipiña.

Extracción de ADN

El ADN genómico se extrajo con el siguiente protocolo. Se utilizaron 0.5 g de muestra de hoja y se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido. La muestra se trituró en mortero hasta obtener un polvo fino, al cual se agregaron 500 μL de buffer de extracción (D-sorbitol 0.14 M; Tris HCl 0.22 M; EDTA 0.022 M; NaCl 0.8 M; CTAB 0.8 %; n-lauril sarcosina 1 %; pH 8) en un tubo de 1.5 mL con agitación en vórtex. El tubo se incubó a 65 oC por 30 min con agitación constante. Posteriormente, el tubo se centrifugó durante 10 min a 8510 Xg (MiniSpin®, Eppendorf, USA). El sobrenadante se separó y transfirió a un tubo nuevo.

A este tubo se adicionó un volumen igual de fenol/cloroformo/isoamílico (25/24/1), se mezcló en vórtex, y se centrifugó durante 10 min a 8510 Xg (MiniSpin, Eppendorf, USA). La fase acuosa se separó con pipeta y transfirió a un tubo nuevo de 1.5 mL. La extracción con fenol/cloroformo/isoamílico (25/24/1) se repitió con el sobrenadante. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo con 1 μL de RNAasa (1 μg mL^-1) e incubada a 37 ^oC por 45 min. El ADN se precipitó con un volumen igual de isopropanol frío, y el tubo se incubó en hielo por 5 min. Posteriormente, el tubo se centrifugó durante 5 min a 8510 Xg, y el sobrenadante se eliminó por decantación. La pastilla de ADN se lavó gentilmente con etanol 70 %, seguido de un paso de centrifugación por 5 min a 8510 Xg. El etanol se eliminó con pipeta. La pastilla de ADN se dejó secar a temperatura ambiente y se resuspendió en 50 μL de agua Milli Q estéril.

Marcadores moleculares AFLP

El protocolo de marcadores moleculares AFLP se basó en (^{Vos et al., 1995}). Aproximadamente 250 ng de ADN se digirieron simultáneamente con las enzimas de restricción EcoRI y MseI, seguido de una ligación de adaptadores específicos con T4 ADN ligasa (Invitrogen). Los fragmentos ligados fueron utilizados como templetes para una preamplificación con los oligonucleótidos preselectivos EcoRI + A (5'-AGA CTG CGT ACC AAT TCA-3') y MseI + C (5'-GAC GAT TCC TGA GTA AC-3'). Para la amplificación selectiva se utilizó la combinación de oligonucleótidos MseI + CTG (5'-GAC GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3') y EcoRI + ACA (5'-AGA CTG CGT ACC AAT TCA CA-3'). El oligonucleótido EcoRI + ACA se etiquetó con fluorescencia (IRDye 800). Los marcadores moleculares AFLP se separaron en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (PAGE 6 %) en un secuenciador automático LiCor 4200L (LI-COR® Biosciences; Lincoln, NE, USA).

Análisis de datos

Los marcadores moleculares AFLP se analizaron asumiendo que: i) las bandas de ADN correspondieron a un locus genético y que los alelos marcadores de diferentes loci no co-emigran a la misma posición en el gel de electroforesis; ii) que cada locus puede ser tratado como un sistema de dos alelos, y se trata de un alelo amplificable por PCR; y iii) que las poblaciones están en el equilibrio de Hardy-Weinberg (^{Lynch y Milligan, 1994}). La diversidad genética se midió mediante el cálculo de medidas basadas en distancia y en frecuencias alélicas, dentro de cada población y entre ellas, a partir de la matriz binaria de presencia / ausencia de bandas-alelos (1 / 0) (^{Bonin et al., 2007}). La matriz binaria se obtuvo a partir del patrón de bandeo del gel de AFLP mediante el "software" Cross Checker V2.9 (^{Buntjer y Otsen, 1999}).

Los marcadores moleculares dominantes pueden tener una sobreestimación de aproximadamente 5 % en los parámetros de diversidad, principalmente en aquellos donde el número de muestras es relativamente pequeño (^{Lynch y Milligan, 1994}), por lo cual se eliminaron aquellos loci con frecuencia de banda mayor que 1- (3 / N), donde N = número de individuos muestreados. La frecuencia de cada banda-alelo se calculó con el "software" GenALEX versión 6.5 (Peakell y Smouse, 2012) para cada población. El cálculo de los parámetros de diversidad se realizó con el conjunto de los datos completos y los corregidos. Los datos obtenidos con la corrección de (Lynch y Milligan, 1994) se reportan en el presente trabajo.

La diversidad genética a nivel de poblaciones individuales se midió mediante el cálculo del número de alelos (n_a ), el número efectivo de alelos (n_e ) (^{Kimura y Crow, 1964}), la diversidad genética no sesgada de Nei (^{Nei, 1978}; ^{Nei, 1987}) (uHe) y el índice de Shannon (I) (^{Lewontin, 1972}) mediante el "software" Popgene 1.32 (^{Yeh et al., 1999}) y GenALEX versión 6.5 (Peakell y Smouse, 2012). A nivel de grupo de poblaciones, el parámetro diversidad genética total en todas las poblaciones (Ht), media de diversidad genética dentro de las poblaciones (Hs), diferenciación de poblaciones (Gst) y el estimado de flujo génico (Nm), se calcularon con el "software" Popgene 1.32 al considerar un grupo con tres poblaciones (Aquiles Serdán, El Cuervo, Ipiña) y un grupo con dos poblaciones (Aquiles Serdán, El Cuervo).

Un dendrograma basado en el coeficiente de Jaccard con el método UPGMA con 1000 permutaciones de "bootstrap" (técnica de remuestreo no paramétrico), se calculó con el "software" FreeTree (^{Bonin et al., 2007}; ^{Hampl et al., 2001}). La partición de la variación en dos niveles, entre poblaciones y dentro de poblaciones, mediante el análisis molecular de varianza (AMOVA), se calculó con base en una matriz de distancia euclidiana con el "software" Arlequin v3.5 (^{Excoffier et al., 2010}). La significancia de los componentes de varianza se probó con 1000 permutaciones.

Diversidad, diferenciación y estructura genética en poblaciones silvestres de A. salmiana ssp. crassispina en el Altiplano Potosino

Los resultados de diversidad genética no sesgada (uHe) mostraron valores similares entre las poblaciones AqS y EC (0.448 ± 0.012; 0.42 ± 0.011), mientras que la población Ipi mostró niveles más bajos (0.34 ± 0.02). Al formar un grupo con las poblaciones AqS + EC, en función de su cercanía geográfica y considerarla como una única población, y otro grupo considerando las tres poblaciones AqS + EC + Ipi, los valores de uHe mostraron diferencias (0.434 ± 0.008; 0.403 ± 0.0092) entre los grupos formados.

Sin embargo, el índice de información de Shannon (I) mostró valores similares a nivel de poblaciones individuales y a nivel de grupos. La diferencia entre estos parámetros radica en que uHe es una métrica basada en el cálculo de frecuencias alélicas aplicable a una muestra de tamaño reducido, mientras que I es una métrica basada en la comparación apareada del perfil de bandeo entre individuos (^{Bonin et al., 2007}). La información que brinda I es por lo tanto de carácter fenotípico al considerar que los patrones de bandeo obtenidos por AFLP corresponden a un fenotipo molecular, mientras que uHe brinda información acerca del genotipo de la especie. Entonces, los resultados sugieren que las tres poblaciones de A. salmiana ssp. crassispina ubicadas en el Altiplano Potosino poseen diferencias en los niveles de diversidad genética, incluso entre las dos poblaciones cercanas geográficamente (Cuadro 1).

A nivel de grupo de poblaciones, los valores de Ht mostraron diferencias significativas al formar los grupos AqS + EC + IP y AqS + EC (0.2598 ± 0.1129; 0.3827 ± 0.1455). Los valores de Hs fueron diferentes entre los dos grupos (0.3934 ± 0.0043; 0.4235 ± 0.0044). Por otro lado, los valores de diferenciación de poblaciones (Gst) fueron negativos al conjuntar las tres poblaciones (-0.5142) y al conjuntar dos poblaciones (-0.1067), y éstas deben considerarse como cero (Cuadro 2). Al respecto, el valor del estimado de flujo génico (Nm), calculado a partir de Gst, tiende al infinito, lo cual sugiere una tasa de migración entre las poblaciones analizadas. Los resultados sugieren que entre las tres poblaciones de A. salmiana ssp. crassispina ubicadas en el Altiplano Potosino no hay diferenciación génica, aun cuando están separadas geográficamente.

Ht = diversidad genética total de todas las poblaciones; Hs = media de la diversidad genética al interior de las poblaciones; Gst = diferenciación genética de poblaciones, a partir de Gst = (Ht - Hs) / Ht; Nm = estimado del flujo génico, a partir de Gst; Nm = 0.5(1 - Gst) / Gst (^{Balloux y LugonMoulin, 2002}; ^{McDermott y McDonald, 1993}).

Cuadro 2 Parámetros de diversidad y diferenciación genética entre poblaciones de las poblaciones silvestres de A. salmiana subsp. crassispina. 

Estructura genética de las poblaciones silvestres analizadas de A. salmiana ssp. crassispina en el Altiplano Potosino

Para visualizar las relaciones genéticas entre las poblaciones se calculó un dendrograma con el coeficiente de Jaccard mediante el método UPGMA y con 1000 permutaciones de "bootstrap" para estimar su robustez estadística (^{Bonin et al., 2007}). El dendrograma mostró la tendencia de agrupar a los individuos de acuerdo con su origen geográfico: la población de Ipiña tuvo dos subgrupos, mientras que las poblaciones Aquiles Serdán y El Cuervo tuvieron cuatro subgrupos con diferente número de individuos en cada uno. Los subgrupos se distribuyeron en todo el dendrograma.

Algunos nodos del dendrograma muestran valores significativamente altos de "bootstrap", mientras que otros nodos mostraron valores bajos. Esto puede explicarse por el alto grado de polimorfismo de los marcadores que apoyan la aparición de esos nodos con bajo valor de "bootstrap" en las tres poblaciones de A. salmiana ssp. crassispina; sin embargo, la topología general del árbol es más informativa que una rama en particular (Figura 1) (^{Mohammadi y Prassana, 2003}).

Figura 1 Análisis de agrupamiento jerárquico de A. salmiana ssp. crassispina basado en el coeficiente de Jaccard con el método UPGMA. Los valores de "bootstrap" se ubican en cada nodo del dendrograma. Los individuos con clave "aqs" pertenecen a la población Aquiles Serdán, "ec" pertenecen a la población El Cuervo; "ip" pertenecen a la población Ipiña. 

Para cuantificar la diversidad genética revelada a nivel entre poblaciones y entre individuos al interior de las poblaciones de A. salmiana ssp. crassispina, se calculó el análisis molecular de varianza (AMOVA). Este análisis reveló que 88.73 % de la variación genética total se ubica entre individuos al interior de las poblaciones, mientras que 11.27 % se ubica entre poblaciones. El parámetro de diferenciación de poblaciones (F_ST) estimado de AMOVA tuvo un valor 0.11266 (Cuadro 3). Los resultados confirman que existe un bajo nivel de diferenciación genética poblacional entre las tres poblaciones de A. salmiana ssp. crassispina.

Cuadro 3 Análisis molecular de varianza (AMOVA) en poblaciones silvestres de A. salmiana subsp. crassispina. 

En resumen, el análisis de marcadores moleculares AFLP en tres poblaciones silvestres de A. salmiana ssp. crassispina, sugiere la existencia de un alto grado de variabilidad genética entre individuos dentro de las poblaciones, y un bajo nivel de diferenciación genética entre las tres poblaciones analizadas. Al respecto, las poblaciones Aquiles Serdán y El Cuervo mostraron niveles similares de diversidad genética (uHe), probablemente debido a su cercanía geográfica.

Consideraciones agroecológicas de la diversidad genética en las tres poblaciones silvestres de A. salmiana ssp. crassispina

Las tres poblaciones analizadas de A. salmiana ssp. crassispina son explotadas para la elaboración de mezcal en el Altiplano Potosino. Dicha práctica requiere la extracción de individuos en estado de propagación vegetativa (^{Aguirre-Rivera et al., 2001}; ^{Martínez-Salvador et al., 2005}). La existencia de altos niveles de diversidad genética en varias especies de Agave con propagación vegetativa ha sido reportada previamente (^{Aguirre-Dugua y Eguiarte, 2013}; ^{Díaz-Martínez et al., 2012}; ^{Eguiarte et al., 2013}; ^{Infante et al., 2006}).

En este contexto, se ha documentado que la propagación vegetativa en A. tequilana y A. duranguensis está asociada a variabilidad epigenética heredable, que incluye la actividad de retrotransposones pertenecientes a las familias Ty1-copia; Gypsy y CACTA, así como a diferencias en los patrones de metilación entre plantas madre y sus respectivos hijuelos (^{Díaz-Martínez et al., 2012}; ^{Gross et al., 2013}; ^{Khaliq et al., 2012}). Asimismo, se ha descrito la relevancia de la variabilidad epigenética en los procesos evolutivos de las especies vegetales, al presentar un comportamiento diferencial en tejidos o en presencia de estímulos abióticos y bióticos (^{Díaz-Martínez et al., 2012}; ^{Richards, 2006}; ^{Schnable et al., 2009}). Por ello, la variabilidad epigenética contribuye significativamente en la generación de variabilidad natural de las especies vegetales (^{Fujimoto et al., 2012}; ^{Khaliq et al., 2012}; ^{Torres-Morán et al., 2012}; ^{Zhang y Hsieh, 2013}).

Este trabajo muestra que el alto grado de diversidad genética encontrada en las tres poblaciones silvestres analizadas de A. salmiana ssp. crassispina, podría ser el resultado del sinergismo entre un componente de variabilidad genética heredable (polinización cruzada) y un componente epigenético heredable, el cual incluiría la actividad de elementos genéticos transponibles y diferencias en patrones de metilación entre plantas madre y sus hijuelos.

Con base en la información de diversidad genética disponible, se han identificado especies como A. angustifolia y A. victoriae-reginae que necesitan esfuerzos prioritarios para su conservación. Estas especies poseen altos grados de diversidad genética al interior de cada especie y de diferenciación entre poblaciones, por lo cual, para salvaguardar el mayor número de alelos de cada especie se requieren altos números de individuos y poblaciones (^{Eguiarte et al., 2013}). Según los resultados de diversidad genética de las tres poblaciones analizadas en este estudio, los esfuerzos de conservación de A. salmiana ssp. crassispina deberían estar dirigidos a resguardar tantos individuos como sea posible sin considerar muchas poblaciones (^{Eguiarte et al., 2013}).

Tomando en cuenta los valores de flujo génico entre las tres poblaciones analizadas de A. salmiana ssp. crassispina, los datos sugieren que las tres poblaciones se comportan como una sola población. En este escenario, los resultados de flujo génico deberían ser interpretados como evidencia de migraciones históricas entre las tres poblaciones actuales, las cuales derivarían de una sola población, que pudo haber sido fragmentada por actividades antropogénicas relativamente recientes (^{Habel et al., 2015}; ^{Li et al., 2015}; ^{Luan et al., 2006}; ^{Zhao et al., 2012}).

A pesar de la pérdida de hábitats y del efecto demográfico negativo como consecuencia de la extracción de individuos en propagación vegetativa (^{Martínez-Salvador et al., 2005}; ²⁰⁰⁷), el alto nivel de variabilidad genética en las tres poblaciones analizadas de A. salmiana ssp. crassispina, una especie ampliamente distribuida en el Altiplano Mexicano, asegura la compatibilidad entre la conservación de la especie y su aprovechamiento sustentable. Asimismo, el hecho resalta la necesidad de desarrollar enfoques para la protección de los recursos fitogenéticos endémicos con alto valor social y agroecológico (^{Eguiarte et al., 2013}; ^{Martínez-Salvador et al., 2007}; ^{Mora-Lopez et al., 2011}).