Colecta, extracción y muestreo de aceites

Se utilizaron frutos de tres variedades de palma africana: Deli x Ekona, Deli x Ghana y Deli x Nigeria (Figura 1), que fueron cosechados de cinco parcelas que cuentan con sistema de riego, con las tres variedades mencionadas, y por la disponibilidad de los propietarios para efectuar la extracción el aceite de manera artesanal para esta investigación.

Figura 1 Frutos de las variedades de palma africana empleados en el estudio: a) Deli x Ekona, b) Deli x Ghana, y c) Deli x Nigeria. 

Se recolectaron de dos a tres frutos de cada variedad en cada una de las cinco parcelas. Los frutos cosechados fueron seleccionados por los productores conforme a su propio método visual para estimar la madurez de la cosecha comercial. Cada productor llevó a cabo la extracción de aceite de acuerdo con el método artesanal que habitualmente emplea, que en todos los casos consistió en prensado manual y separación (Figura 2).

Figura 2 Imágenes que ilustran parte del proceso de extracción artesanal del aceite: a) prensado manual, b) separación del aceite. 

En cada huerto se tomaron cinco muestras que corresponden a 15 muestras por parcela. Además, se obtuvo una muestra de aceite de una agroindustria local (cinco repeticiones), que corresponde a la mezcla de las tres variedades de palma. En total se colectaron 80 muestras de aceite depositadas en envases de plástico ámbar, para evitar mayor exposición a la luz cuyo traslado se hizo en frío a los laboratorios de análisis.

Métodos de análisis de los aceites

Determinación de humedad. Para analizar el contenido de agua en el aceite se empleó el secado en estufa, técnica que se basa en la pérdida de peso de la muestra por evaporación del agua. Para esto se requiere que la muestra sea térmicamente estable y que no contenga una cantidad significativa de compuestos volátiles. El principio operacional incluye la preparación de la muestra, consistente en pesado, secado, enfriado y pesado nuevamente de la muestra de acuerdo con el método descrito en el Apartado 926.12 de la (^{AOAC, 1990}).

Análisis de ácidos grasos. Las muestras fueron saponificadas y metiladas de acuerdo con lo descrito por (^{Murrieta et al., 2003}), con algunas modificaciones en la metodología. Para determinar el contenido de ácidos grasos se prepararon las muestras de 1.5 mL de aceite extraídas del análisis de materia seca, que se guardaron en viales para su posterior tratamiento. De cada muestra de aceite se pesaron 0.0050 g y se les adicionó 1 mL de hexano; de esta mezcla se tomaron 10 μL y se colocaron en un vial, para posteriormente agregar 40 μL de hidróxido de trimetil sulfonium (HTS).

La nueva mezcla se agitó y se mantuvo en refrigeración por 2 h para permitir la metilación de los ácidos. Transcurrido este tiempo se inyectó 1 μL en el cromatógrafo de gases marca Perkin Elmer® Varian auto-System equipado con un detector y un integrador de flama ionizante, con una columna capilar de 30 m x 225 mm x 0.225 mm. La temperatura del inyector se estabilizó a partir de 130 ^oC y se aumentó 1 ^oC a la vez, hasta alcanzar 150 ^oC; la temperatura de la columna se estableció en 200 ^oC y la del detector se estableció en 250 ^oC.

Para el acarreo de la muestra se empleó una mezcla de gases marca Infra® constituida por H, He y aire comprimido a 1,378.95:551.58:1,378.95 kPa cm^-2 por "split" (dispositivo para diluir) a un flujo de 1mL min^-1. Los ácidos grasos se identificaron por comparación con los tiempos de retención de los respectivos estándares de los ácidos grasos usados en el análisis, todos de la marca Sigma® (99 % de pureza). Los estándares se procesaron bajo las mismas condiciones que las muestras y se inyectaron con tres repeticiones cada uno para establecer sus tiempos de retención.

Análisis de vitaminas liposolubles. La extracción de las vitaminas se llevó a cabo de acuerdo con la metodología descrita por (^{Macrae, 1998}), modificada. Se pesó 1 g de aceite y se adicionaron 35 mL de etanol absoluto, 10 mL de KOH al 50 % y 25 mg de hidroquinona como antioxidante; se calentó la mezcla a reflujo durante 30 min a temperatura no mayor de 35 ^oC con agitaciones periódicas; la mezcla se retiró del calor y se agregaron 40 mL de agua destilada y 50 mL de una mezcla éter dietílico:n-hexano, se colocó en un matraz de separación donde se agitó por 5 min y se dejó reposar hasta la separación de fases. Se drenó la fase acuosa y a la fase orgánica se le realizaron cinco lavados con 50 mL de agua acidulada, misma a la que se le agregaron 2 g de Na₂SO₄.

El extracto se concentró a sequedad en un rotavapor Buchi® y se reconstituyó con 25 mL de KOH metanólico. Fue almacenado en congelación en frascos ámbar para su conservación hasta ser cuantificado en un periodo máximo de 12 h. Todo el material fue cubierto con papel aluminio para evitar el deterioro de las vitaminas por la luz, y el aceite se mantuvo lo menos posible en contacto con el ambiente.

La identificación y cuantificación de vitamina A se realizó de acuerdo con la metodología descrita por (^{García-Peña et al., 2008}) con adecuaciones, por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo de líquidos Waters® 717 autosampler (con muestreo automático), equipado con un detector UV modelo 2487 y una bomba dual. Se usó una columna Perkin Elmer® fase reversa Spheri 5 RP18 (250 mm x 4.6 mm, tamaño de partículas 5 μm). La fase móvil para el caso de la vitamina A fue metanol-agua (98:2), el tiempo de corrida fue de 10 min, la detección de la vitamina A se realizó a 325 nm a temperatura ambiente, con un flujo de 1.5 mL min^-1. Para la identificación y cuantificación de esta vitamina se empleó como estándar a palmitato de retinol disuelto en KOH metanólico, para la elaboración de la curva patrón a concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm. Cada estándar se filtró en un acrodisco de nailon de 0.22 μm Titan2® antes de ser inyectados en el HPLC.

La identificación y cuantificación de la vitamina D se llevó a cabo de acuerdo con la metodología descrita por (^{García-Peña et al., 2008}) con adecuaciones, por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en un cromatógrafo de líquidos Waters® 717 autosampler, equipado con un detector UV modelo 2487 y una bomba dual. Se usó una columna Perkin Elmer® fase reversa Spheri 5 RP18 (250 mm x 4.6 mm, tamaño de partículas 5μ). La fase móvil para el caso de la vitamina D fue acetonitrilo-metanol (91:9). El tiempo de corrida fue de 20 min; la detección de la vitamina D se hizo a 265 nm a temperatura ambiente, con un flujo de 1.5 mL min-1. Para la identificación y cuantificación de esta vitamina se empleó como estándar a colecalciferol disuelto en KOH metanólico, para la elaboración de la curva patrón a concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm. Cada estándar se filtró en un acrodisco de nailon de 0.22 μm Titan2® antes de ser inyectados en el HPLC.

Para la identificación y cuantificación de α-tocoferol (vitamina E), se emplearon las metodologías descritas por (^{Correa et al., 2005}) y (^{Momenbeik et al., 2005}), con adecuaciones. Los tocoferoles se analizaron por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en un equipo Waters® 717 "autosampler" equipado con un detector UV Modelo 2487 y una bomba dual. Se usó una columna Perkin Elmer® fase reversa Spheri 5 RP18 (250 mm x 4.6 mm, tamaño de partículas 5μ). La fase móvil fue metanol/agua (93:7) a una velocidad de flujo de 1.5 mL min^-1 a temperatura ambiente. La mezcla de solvente se filtró a través de un disco con poros de 0.45 μm antes de usarlo, y se agitó en vacío para extraer gases disueltos.

La longitud de onda programada para αtocoferol fue de 285 nm y el tiempo de corrida fue de 25 min. Para la identificación y cuantificación de esta vitamina se empleó como estándar α-tocoferol disuelto en KOH metanólico, para la elaboración de la curva patrón a concentraciones de 5, 10, 15, 20 y 25 ppm. Cada estándar se filtró en un acrodisco de nailon de 0.22 μm Titan2® antes de ser inyectados en el HPLC.

Métodos estadísticos

El diseño experimental utilizado para evaluar la influencia de las distintas fuentes de variación en las variables de respuesta fue completamente al azar. Los análisis de varianza se realizaron utilizando el paquete estadístico SAS 9.0. Todos los análisis de contenido de materia seca, ácidos grasos y vitaminas fueron realizados por triplicado y la comparación de medias de los valores entre variedades se llevó a cabo con la prueba de Tukey. También se discuten las diferencias estadísticas de los valores obtenidos de ácidos grasos y vitaminas de las muestras del aceite obtenido de la agroindustría en comparación con el de la extracción artesanal utilizando para este fin, la misma prueba de Tukey.