Notas científicas

 

Betalaínas, compuestos fenólicos y actividad antioxidante en pitaya de mayo (Stenocereus griseus H.)

 

Betalains, phenolic compounds and antioxidant activity in pitaya de mayo (Stenocereus griseus H.)

 

Leticia García-Cruz¹, Yolanda Salinas-Moreno²* y Salvador Valle-Guadarrama¹

 

¹ Investigaciones Forestales, Agricolas, Fisiología Poscosecha, Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Autónoma Chapingo. 56230, Chapingo, Estado de México.

² Laboratorio de Calidad de Maíz, Instituto Nacional de Investigación Forestal Agrícola y Pecuarias. Apartado Postal 10. 56230, Chapingo, Estado de México.

 

*Autor para correspondencia (yolasm@gmail.com)

 

Recibido: 9 de Febrero del 2012
Aceptado: 8 de Agosto del 2012

 

Resumen

La pitaya de mayo (Stenocereus griseus H.) es una cactácea columnar que se encuentra en zonas áridas y semiáridas de México. Sus frutos son jugosos y de coloraciones que van desde naranja hasta el púrpura. El color del fruto se debe a las betalaínas, que son compuestos nitrogenados hidrosolubles. En este estudio se analizó el fruto de dos variedades de pitaya: roja (PR) y naranja (PN), en cuanto al contenido de betalaínas totales (betacianinas + betaxantinas), fenoles solubles totales y ácidos fenólicos, así como el poder antioxidante que se evaluó mediante el ensayo DPPH y cálculo del IC₅₀ . En PR se obtuvo un contenido de 347.3 ± 21.0 mg de betalaínas totales (BET)/100 g muestra seca, mientras que en la PN se encontraron 215.0 ± 36.2 mg de BET/100 g de muestra seca. El contenido de fenoles solubles totales fue de 166.5 ± 14.4 y 52.8 ± 3.8 mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g de pulpa seca, para los frutos de PR y PN, respectivamente. De los ácidos fenólicos (AF), los libres se encontraron en mayor proporción que los glucosilados y esterificados. La PN tuvo mayor contenido de AF que la PR. La PR mostró un valor de IC₅₀, que es la concentración del extracto con la cual se logra una reducción de 50 % del radical DPPH, de 59.8 ± 0.32 µM, en tanto que en la PN fue de 161.7 ± 4.8 uM, lo que muestra una mayor capacidad antioxidante en la PR. La actividad antioxidante de los frutos de pitaya se atribuye principalmente a la presencia de betalaínas puesto que los fenoles se encuentran en menor proporción que ellas. Los frutos de S. griseus representan una alternativa para incrementar y diversificar la ingesta de antioxidantes entre la población de las zonas áridas y semiáridas de México.

Palabras clave: Stenocereus griseus, ácidos fenólicos, actividad antioxidante, DPPH, betacianinas, betaxantinas.

 

Abstract

Stenocereus griseus H. (pitaya de mayo) is a columnar cactus that can be found growing in the arid and semi-arid lands of México. It produces juicy fruits with colored flesh ranging from orange to red- purple. The color of the fruit is due to the presence of betalains, which are water soluble nitrogen-containing compounds. In this study we analyzed fruits of two varieties of S. griseus H.: red (PR) and orange (PN), by measuring their composition in total betalains (betacyanins + betax-anthins), total soluble phenolics, and phenolic acids. The antioxidant activity of the fruits was also determined by DPPH assay and IC₅₀. Total betalains content of red pitaya (PR) was 347.3 ± 21.0 mg of total betalains (BET)/100 g of dry flesh (DF), while in orange pitaya (PN) it was 215.04 ± 36.16 mg of BET/100 g DF. Total soluble phenolics (FST) content in the fruits of PR was 166.5 ± 14.4, and in PN was of 52.8 ± 3.8 mg equivalents of gallic acid (EAG)/100 g DF. Free phenolic acids (AFL) were found in a higher proportion than those glucosylated and esteri-fied acids. The PN had higher content of AFL than the PR. IC₅₀, which represents the concentration of the extract needed to reduce 50 % of the DPPH, for the fruits of S. griseus was 59.8 ± 0.32 µM for PR, and 161.7 ± 4.8 µM for PN, thus showing a higher antioxidant activity (AA) for PR. The AA in S. griseus is attributed to betalains rather than to pheno-lics which were present in a lower proportion. S. griseus represents an alternative to increase and diversify the consumption of antioxidants in the population of arid and semiarid lands of México.

Key words: Stenocereus griseus, antioxidant activity, DPPH, betacianins, betaxantins, phenolics acids.

 

INTRODUCCIÓN

Son innegables los beneficios que acarrea a la salud humana el mantener una dieta elevada en frutas y verduras, beneficios que se atribuyen principalmente al poder antioxidante de los fitoquímicos contenidos en estos alimentos, entre los cuales destacan los compuestos fenólicos (Shahidi 2009) ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Las betalaínas también son fitoquímicos considerados como potentes antioxidantes (Cai et al., 2003), sin embargo su presencia está restringida a solamente algunas familias de plantas relacionadas con el orden Caryophyllales, dentro de la cual destacan los géneros Beta, Amaranthus, Opuntia e Hylocereus (Cai et al., 2003; Stintzing et al., 2005). En los últimos años han proliferado los estudios sobre las betalaínas y sus propiedades en varias especies de los géneros Opuntia (Sreekantha et al., 2007; Osorio-Esquivel et al., 2011) e Hylocereus (Wu et al., 2006; Herbach et al., 2007). El género Stenocereus ha sido menos estudiado, no obstante que se caracteriza, al igual que Opuntia e Hylocereus, por producir frutos jugosos con pulpa de atractivos colores.

La pitaya de mayo (Stenocereus griseus H.) es una cactácea columnar originaria de México. Sus frutos son bayas poliespermáticas de forma globosa u ovoide, con espinas caducas; la pulpa puede ser de color anaranjado, rojo o púrpura. El color característico de sus frutos se debe a las betalaínas, pigmentos naturales hidrosolubles con nitrógeno en su estructura que se sintetizan a partir del aminoácido tiro-sina. Las betalaínas se dividen en dos grupos: betacianinas, que brindan tonalidades rojas y se forman por condensación de una estructura ciclo-DOPA (dihidroxifenilalanina) con el ácido betalámico, y betaxantinas que proporcionan coloraciones amarillas y se sintetizan a partir de diferentes compuestos amino y el ácido betalámico (Strack et al., 2003; Gandía-Herrero et al., 2010).

Además de dar coloración a los frutos que las contienen y poseer actividad antioxidante, las betalaínas son reconocidas por otras importantes actividades biológicas, tales como la inducción de la quinona reductasa, potente enzima de detoxificación en la quimio prevención del cáncer (Azeredo, 2009), y su actividad antiproliferativa de células de melanoma maligno (Wu et al., 2006).

Los frutos que contienen betalaínas también poseen fenoles de diferentes tipos, excepto antocianinas, pues estas dos clases de pigmentos son mutuamente excluyentes (Wu et al., 2006). En algunas especies el contenido de fenoles es mayor que el de betalaínas, y en otras es lo contrario. En pitahaya (Hylocereus spp.) Wu et al. (2006) reportaron un contenido mayor de fenoles solubles totales (42.4 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g de pulpa fresca) que de betalaínas (10.3 mg equivalentes de betanina /100 g de pulpa fresca); en betabel (Beta vulgaris L.), Kujala et al. (2000) señalaron un contenido mayor de betalaínas respecto a FST. En varias especies del género Opuntia los valores de FST fueron mayores que los de betalaínas (Cayupán etal., 2011).

Las investigaciones realizadas en pitaya de mayo se han enfocado principalmente en la composición proximal y características físicas de los frutos (Luna-Morales y Aguirre, 2001; Luna-Morales, 2006). Sin embargo, también es importante estudiar los rasgos funcionales de estos frutos, para impulsar su desarrollo como fuente de compuestos antioxidantes. Por ello, los objetivos de este trabajo fueron determinar el contenido de betalaínas y compuestos fenólicos, así como la actividad antioxidante de la pulpa de dos variedades de pitaya de mayo.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Los frutos que se analizaron fueron de dos variedades de pitaya; roja y naranja, seis de cada una, fueron colectados en huertos familiares del municipio de Tepexi de Rodríguez, Puebla, cuando estaban en estado de madurez comercial, en mayo de 2011.

 

Extracción y cuantificación de betalaínas

De cada fruto se tomó una muestra de 2 g de pulpa fresca macerada y se colocó en un matraz Erlenmeyer al que se añadieron 20 mL de metanol acuoso 80 % (v/v). La mezcla se sonicó por 10 min (Bath sonicador, Branson model 2510®; Danbury, USA), previo a su agitación por 20 min en un agitador horizontal model G10® (New Jersey, USA) a temperatura ambiente y en oscuridad. Cada muestra se centrifugó a 2200 x g por 10 min en una centrífuga Hettich zentrifugen® Mod. Universal 32 (Germany). El sobrenadante se guardó y el residuo se sometió a una segunda extracción con la metodología descrita. Los sobrenadantes se juntaron y se filtraron con papel Whatman Núm. 4, para luego concentrarlos a sequedad en un rotavapor Buchi® Mod R-215 (Switzerland), a 40 °C. Las muestras de la variedad roja fueron re-suspendidas en 10 mL de metanol acuoso a 80 % (v/v) y en 5 mL para la variedad naranja, y luego almacenadas en viales color ámbar bajo condiciones de congelación hasta su posterior análisis.

El contenido de betacianinas y betaxantinas se cuantificó según lo descrito por Castellanos-Santiago y Yahia (2008), mediante la absorbancia de los extractos de betalainas a 538 y 483 nm en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25® UV/Vis (USA). Para la conversión de las unidades de absorbancia en unidades de concentración se utilizó la expresión: B(mg/g) = (AxFDxPMxV)/(εxPxL), dónde B es betacianinas o betaxantinas, A es la absorbancia a 538 nm para betacianinas y 483 nm para betaxantinas, FD es el factor de dilución al momento de leer en el espectrofotómetro, PM es el peso molecular (Betanina = 550 g/mol e Indicaxantina = 308 g/mol), V es el volumen del extracto, ε es el coeficiente de extinción molar (Betanina = 60 000 L/ mol.cm, e Indicaxantina = 48 000 L/mol.cm) y L es la longitud de la celda (1 cm).

 

Determinación de fenoles solubles totales (FST)

Esta determinación se hizo a partir del extracto metanólico obtenido para la cuantificación de betalaínas, mediante el método de Folín-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). A 100 µL del extracto se añadieron 125 µL del reactivo FolinCiocalteu 1N (dilución 1:2 del reactivo comercial 2N), y se agitó y dejó reaccionar por 6 min, para luego neutralizar la reacción con la adición de 1250 µL de carbonato de sodio (Na₂CO₃) a 19 % (p/v); luego se aforó a 3 mL con agua destilada, se agitó y se dejó reposar a temperatura de cuarto en oscuridad por 90 min. Las muestras se centrifugaron a 15300 x g por 10 min para eliminar la turbidez. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25® UV/Vis (USA) a 760 nm. Se elaboró una curva patrón de ácido gálico para expresar el contenido de FST en función de este ácido.

 

Cuantificación de ácidos fenólicos

Los ácidos fenólicos presentes en el extracto metanólico se aislaron con la metodología descrita por Bakan et al. (2003). En forma breve, se pesaron 0.2 g de muestra seca y se hicieron dos extracciones con 10 mL de metanol a 80 %, se concentró parcialmente a presión y temperaturas reducidas para eliminar parte del metanol. El concentrado se llevó nuevamente a un volumen de 20 mL con agua destilada. Para obtener los ácidos fenólicos libres (AFL), el pH de la solución se ajustó a 2 y se hicieron dos extracciones líquido-líquido con 20 mL de acetato de etilo en cada extracción. La fase orgánica se concentró a sequedad en un rotavapor Buchi® Mod R-215 (Switzerland), el residuo se re-suspendió en 1 mL de metanol grado HPLC y se almacenó a -4 °C hasta su posterior análisis. La fase acuosa se aforó a 20 mL con agua destilada y dividió en dos partes iguales; una se trató con 10 mL de HCl 2N y se almacenó a 4 °C durante 1 h, para de ahí obtener los ácidos fenólicos glucosilados (AFG); la otra parte se trató con 10 mL de NaOH 2 N y se almacenó en oscuridad por 3 h, para luego extraer los ácidos fenólicos esterificados (AFE). Posteriormente se ajustó el pH a 2 en ambas fracciones y se siguió la misma metodología que en el caso de los AFL. La cuantificación de ácidos fenólicos totales de cada una de las fracciones se determinó con el método de Folín-Ciocalteu descrito anteriormente.

 

Actividad antioxidante

La capacidad antioxidante de las betalaínas presentes en las muestras de pitaya roja y naranja se determinó utilizando una solución 60 µM de DPPH disuelto en metanol a 80 %, con el método reportado por Cai et al. (2003) que utiliza el radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co). Para desarrollar la reacción en una celda se colocaron 200 µL del extracto metanólico de betalaínas y se agregaron 2800 µL de la solución de DPPH, y se midió la absorbancia a 515 nm, en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25® UV/Vis (USA). Inicialmente la lectura se tomó cada minuto hasta el minuto cinco, posteriormente cada 5 min hasta completar 2 h, que según Cai et al. (2003) es el tiempo necesario para que la reacción se estabilice. La inhibición o reducción del radical libre DPPH se midió en porcentaje (% DPPH) mediante la ecuación: % DPPH = [(A₀ - A_e)/A₀ x100], donde A₀ es la absorbancia de la muestra al tiempo cero y A₀ es la absorbancia de la muestra examinada en cada uno de los tiempos (Liu y Yao, 2007). La absorbancia al tiempo cero (A₀) fue la obtenida al mezclar 200 µL de metanol a 80 % con 2800 µL de la solución 60 µM de DPPH.

Con el fin de determinar el IC₅₀, el cual indica la concentración a la que se tiene 50 % de reducción del DPPH, se prepararon diferentes concentraciones del extracto y se les midió el porcentaje de DPPH reducido al final de un periodo de incubación de 2 h. Los datos obtenidos de porcentaje de reducción de DPPH se graficaron con respecto a la concentración y se calculó la concentración a la cual se alcanzó 50 % de reducción de DPPH, mediante una regresión logarítmica de tres parámetros. Al valor de concentración obtenido se le consideró como IC₅₀.

 

Análisis estadístico de datos

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar, y con los valores obtenidos para las diferentes variables se hizo un análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias por el método de Tukey (α = 0.05) con el paquete estadístico SAS (SAS Institute, 2002). Todos los análisis se hicieron por triplicado, excepto la actividad antioxidante que se realizó por duplicado.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuantificación de betalaínas

El contenido de betalaínas totales (betacianinas + betaxantinas) en la pulpa de la pitaya roja (PR) fue mayor (P ≤ 0.05) que en la pulpa de la pitaya naranja (PN) (Cuadro 1). En la PR predominaron las betacianinas (BC) en tanto que en la PN fueron las betaxantinas (BX). Las BC se asocian con coloraciones rojo-violeta mientras que en las BX se asocian con coloraciones amarillas, por lo que la proporción de BC y BX observada en los frutos de los dos ecotipos de pitaya aquí analizados es acorde con el color de su pulpa. Estos valores de betalaínas en frutos de pitaya son parecidos a los informados por Castellanos-Santiago y Yahia (2008) para varias especies del género Opuntia, pero superiores a los de pitahaya roja (H. polyrhizus) reportados por Wu et al. (2006) de 10.3 ± 0.22 mg/100 g de pulpa fresca, y que los de Wybraniec y Mizrahi (2002) quienes señalaron una variación de 23 a 39 mg equivalentes de betanina/100 g de pulpa fresca en ocho variedades e híbridos de Hylocereus, género en el que no se ha reportado presencia de betaxantinas.

 

Cuantificación de fenoles solubles totales y ácidos fenólicos

En el extracto de pulpa el contenido de fenoles solubles totales (FST) de PR resultó considerablemente mayor que en PN (Cuadro 2). En pitahaya (H. polyrhizus) se han reportado valores de FST de 42.4 ± 0.04 mg de EAG /100 g de muestra fresca (Wu et al., 2006), que son similares a los de la pitaya roja aquí analizada, si se considera que el contenido está expresado en muestra seca. No obstante, son menores a los 15.5 mg EAG /g de muestra seca registrados en betabel por Kujala et al. (2000). En frutos de garambullo (Myrtillocactus), Guzmán-Maldonado et al. (2010) encontraron valores que variaron de 9.12 ± 1.28 a 10.46 ± 0.48 g EAG/kg de muestra fresca, que también son más elevados que los observados en los frutos de pitaya analizados.

Dado que el ensayo de Folin-Ciocalteau no es específico para fenoles, pues compuestos como azúcares y algunos aminoácidos también lo reducen (Robbins, 2003), los valores de FST en el extracto metánolico de los frutos de pitaya podrían estar sobreestimados. Entre los fenoles solubles en el extracto metanólico de la pulpa de pitaya están los ácidos fenólicos, que pueden encontrarse en forma libre o conjugados mediante enlaces éter (glucosilados) o éster (esterificados) a azúcares u otros ácidos. El contenido de ácidos fenólicos fue mayor en la PN que en la PR (Cuadro 2). En Cactáceas como el garambullo se ha reportado la presencia de los ácidos gálico y caféico (Guzmán-Maldonado et al., 2010), mientras que en betabel se menciona un éster del ácido ferúlico (Kujala et al., 2000).

 

Actividad antioxidante

El poder antioxidante de un extracto o fruto se puede expresar en función del porcentaje de DPPH reducido (Villanueva-Tiburcio et al., 2010). Al respecto, si no se considera la concentración de antioxidantes en el extracto o fruto es poco confiable hacer comparaciones entre extractos o frutos diferentes. Para evitar esta situación se recomienda estimar la capacidad antioxidante con el IC₅₀ (Cai et al., 2003), que representa la concentración del extracto con la cual se obtiene 50 % de reducción del DPPH presente en la reacción. Mientras menor sea el valor de IC₅₀ mayor será la capacidad antioxidante.

En este trabajo se encontró que a medida que aumenta la concentración de betalaínas en los extractos de pitaya, el porcentaje de DPPH reducido se incrementa (Figura 1). En pitaya roja una concentración de 135.07 μM reduce 76 % del radical DPPH, en tanto que en la pitaya naranja se requiere una concentración de 307.01 μM para lograr una reducción de 67 %. Estos resultados indican que los metabolitos presentes en los dos extractos de pitaya son diferentes, y pueden relacionarse con el tipo de betalaínas. Se ha informado que las betacianinas son antioxidantes más potentes que las betaxantinas (Azeredo, 2009), y estas últimas son las predominantes en la pitaya naranja. Los valores obtenidos de porcentaje de DPPH reducido se encuentran por arriba de lo reportado en frutos de frambuesa (Rubus idaeus en diferentes estados de madurez, los cuales oscilaron de 50 a 70 % (Peña-Varela et al., 2006), aunque en esta especie los metabolitos responsables de la actividad antioxidante son las antocianinas. El IC₅₀ de la pitaya naranja fue de 161.7 ± 4.8 μM, que es más del doble que el de la roja (59.8 ± 0.32 μM), lo que significa que el poder antioxidante de la pitaya roja es mayor que el de la naranja. Sin embargo, el poder antioxidante de S. griseus H. también puede atribuirse a los compuestos fenólicos presentes en sus frutos, y aunque están en menor proporción que las betalaínas se consideran potentes antioxidantes (Torres-Rodríguez et al., 2011).

 

CONCLUSIONES

El contenido de betalaínas en la pitaya de mayo (S. griseus) es diferente entre los dos colores de fruto analizados, pues las betacianinas son las más abundantes en la pitaya roja y las betaxantinas en la pitaya naranja. Dado que las betalaínas se encontraron en mayor proporción que los fenoles, se consideran estos compuestos como los que más contribuyen a la actividad antioxidante observada en los frutos de S. griseus, los cuales representan una alternativa como fuente de betalaínas y de antioxidantes.

 

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