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Introducción
Los pseudocereales, provenientes de semillas de flores (eudicotiledóneas), a diferencia de los cereales, que son frutos de espigas de gramíneas (monocotiledóneas), han formado parte de la nutrición humana desde épocas prehispánicas cuando incluso se consideraron sagrados, ya que su consumo se asociaba con el aumento de la resistencia física y desarrollo mental (Ciudad-Mulero et al., 2019; Rollán et al., 2019). Los pseudocereales más cultivados y estudiados son quinoa (Chenopodium quinoa Willd.), amaranto (Amaranthusspp.), chía (Salvia hispanica L.) y trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum Moench) (Martínez-Villaluenga et al., 2020). Este grupo de alimentos se caracteriza por su alto valor nutricional como fibra dietaria, minerales (potasio, calcio, magnesio, fósforo) y ácidos grasos insaturados (Usman et al., 2022). En la actualidad, los pseudocereales son de gran interés ya que, además de su aporte nutricional, contienen proteínas y péptidos de gran valor biológico, así como como flavonoides, ácidos fenólicos y ácidos grasos, los cuales se han asociado con efectos benéficos a la salud (Morales et al., 2021).
Un pseudocereal nativo de México y poco estudiado es el huauzontle (Chenopodium berlandieri subsp. nuttalliae (Saff.) H. Dan. Wilson & Heiser), que pertenece a la familia Chenopodiaceae (Fig. 1), cultivado en la zona centro del país (Puebla, Ciudad de México, Tlaxcala), el cual se consume en diferentes platillos tradicionales mexicanos (Assad-Bustillos et al., 2014; Martínez, 2014). La palabra huauzontle proviene del náhuatl huauhtzontli, donde huauhtli es bledo y tzontli, cabello; lo que significa “cabello o maleza del bledo” (Kistler y Shapiro, 2011). Esta planta se destaca por sus propiedades nutricionales: rico en proteínas, vitaminas (A, B, C, D), minerales (Ca, P, Fe) y fibra; además de su contenido en compuestos fenólicos y flavonoides, lo cual favorece sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (Lazo-Vélez et al., 2016; Román-Córtes et al., 2018; López-Monterrubio et al., 2020). Un estudio destaca las propiedades antioxidantes de las semillas de huauzontle cocinado, asociando su efecto a la presencia de compuestos fenólicos (Chaires-Martinez et al., 2013) y otro evidenció el uso potencial de las semillas de huauzontle para elaborar una infusión fermentada con diferentes bacterias ácido-lácticas epífitas del huauzontle (Garcia et al., 2022). En este último estudio la bebida fue elaborada con huauzontle seco y fermentada con Lactiplantibacillus plantarum (Orla-Jensen 1919) Lp22, la cual fue seleccionada debido a que mostró el porcentaje más alto de preferencia (31% en la prueba de análisis sensorial realizada con panelistas no entrenados). Además, en la bioactividad se destacó por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, tanto in vitro (Garcia et al., 2022) como in vivo (Santiago-López et al., 2023). Considerando los antecedentes, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto de la fermentación por Lactiplantibacillus plantarum Lp22, en semillas de huauzontle suspendidas en agua, sobre sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias in vitro.
Materiales y Métodos
Cultivo bacteriano
La bacteria empleada en el estudio, Lactiplantibacillus plantarum Lp22, fue aislada de semillas de huauzontle (Garcia et al., 2022). Pertenece al cultivo de bacterias ácido-lácticas del Laboratorio de Productos Lácteos del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C., Hermosillo, Sonora, México. La bacteria se cultivó a 37 °C en caldo MRS (de Man Rogosa and Sharpe, BD Difco, St. Louis, Missouri, EUA), realizando tres subcultivos, el primero de 24 h, seguido de 18 h y por último de 12 h. Del último subcultivo, las bacterias se recuperaron por centrifugación con las siguientes condiciones: 4696 × g, 10 min, 10 °C en una centrifuga Sorvall (Modelo ST16R, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). El paquete celular se lavó dos veces con una solución amortiguadora de fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés 0.2 M, pH 7.0) y se ajustó la densidad óptica (DO600nm=0.5 equivalente a 108 unidades formadoras de colonia (UFC)/ml), midiendo la absorbancia en un espectro (SpectraMax M3, Molecular Devices LLC, San José, California, EUA) (Garcia et al., 2022), dicha concentración celular se utilizó para fermentar semillas de huauzontle.
Preparación del huauzontle fermentado
Las inflorescencias de huauzontle fueron compradas en centros comerciales locales de la ciudad de Hermosillo, Sonora, México. Posteriormente, fueron sometidas a un proceso de secado por 12 h, 60 °C (VWR International, Radnor, Pensilvania, EUA). La preparación de la muestra a fermentar se realizó siguiendo la metodología previamente reportada para la elaboración de una infusión (Garcia et al., 2022), con algunas modificaciones. Las semillas de huauzontle se adicionaron (0.3% p/v) en agua purificada estéril, se aplicó un tratamiento (85 °C, 20 min), y se agregó la solución azucarada estéril (110 °C, 10 min) preparada al 5%, v/v (Azúcar morena, Zulka, Culiacán, Sinaloa, México). Finalmente, 300 ml de la solución con semillas se inoculó (1%) con la suspensión bacteriana de L. plantarum Lp22 ajustada a una DO=0.5 (108 UFC/ml) y se dejó incubar por 24 h (Modelo 2200, VWR, Radnor, Pensilvania, EUA). La fermentación de tres muestras independientes se detuvo en un baño de agua con hielo. Las muestras obtenidas (300 ml) fueron filtradas (Papel filtro Whatman #1, Merck, Darmstadt, Alemania), y 1 g de las semillas de huauzontle se mezcló con 20 ml de agua Milli-Q® (ZRQSVP3US, Millipore, Burlington, Massachussetts, EUA). Se realizó una molienda utilizando un mortero, y se dejó en agitación a 60 rpm (placa de calentamiento con agitación PC 200, Corning, Nueva York, EUA) por 50 min. La mezcla se filtró nuevamente bajo las mismas condiciones, y se evaluó la actividad antioxidante y antiinflamatoria. El huauzontle no fermentado se utilizó como testigo. La estrategia experimental se esquematiza en la Figura 2.
Determinación de compuestos fenólicos totales
Para la determinación de los compuestos fenólicos se emplearon semillas (1 g) de huauzontle fermentado y no fermentado, molidas, las cuales se mezclaron con 20 ml de metanol (99.9% de pureza, J.T. Baker, Avantor, Pensilvania, EUA). Estas se mantuvieron en agitación a 60 rpm (placa de calentamiento con agitación PC 200, Corning, Nueva York, EUA) por 50 min. Posteriormente, la mezcla fue filtrada (Papel filtro Whatman #1) y los extractos metanólicos obtenidos se mantuvieron en oscuridad. El contenido de compuestos fenólicos de los extractos metanólicos fueron determinados por el método de Folin-Ciocalteu (Gunathilake et al., 2018). Primero, 0.5 ml de muestra o ácido gálico (curva estándar de 31.25 a 3.90 (g/ml) fueron mezclados con 0.1 ml del reactivo de Folin (0.2 N) y se dejó incubar por 15 min, a 25 °C, en condiciones de oscuridad. Posteriormente, se adicionaron 1.5 ml de carbonato de sodio (7.5% p/v) y se incubaron por 60 min a 25 °C. La absorbancia se midió a 760 nm (SpectraMax M3) y los valores se representaron como (g/ml de equivalentes de ácido gálico.
Determinación de actividad antioxidante
La actividad antioxidante de las muestras fue determinada por dos métodos: 2, 2'-Azinobis-3-etil-benzo-tiazolina-6-acido sulfónico (ABTS por sus siglas en inglés), y capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno (ORAC, por sus siglas en inglés), siguiendo las metodologías reportadas por Zulueta et al. (2009)) y Cuevas-González et al. (2020). Los resultados se reportaron como equivalentes de Trolox (6, ácido hidroxi-2,3,7,8-tetra-metilcroman-2-carboxílico, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), considerando una curva estándar de 0-500 (M en solución amortiguadora de fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés, 50 mM, pH 7.0).
Determinación de actividad antiinflamatoria
La actividad antiinflamatoria fue determinada usando dos métodos enzimáticos; inhibición de tripsina e inhibición de lipooxigenasa (LOX), siguiendo las metodologías reportadas por Gunathilake et al. (2018) y Garcia et al. (2022). El porcentaje de inhibición fue determinado con la siguiente formula:
Para inhibir la actividad de tripsina (Sigma-Aldrich), primero, esta se preparó a una concentración de 0.06 mg/ml en una solución de Tris-HCl (25 mM, pH 7.4). Posteriormente se mezclaron la solución enzimática (0.5 ml) y extracto acuoso de las muestras de estudio, fermentada o no fermentada (0.5 ml). La mezcla de reacción se incubó por 5 min a 37 °C, seguido por la adición de 0.5 ml de una solución de caseína preparada al 0.8% (p/v) en PBS (50 mM, pH 7.2 y NaOH 0.1 M) y se mantuvo en incubación por 20 min en las mismas condiciones. La reacción finalizó al agregar 1 ml de ácido perclórico (60% de pureza, Sigma-Aldrich). La absorbancia (Abs) se midió en el extracto obtenido después de la centrifugación (4600 × g, 5 min).
Para el ensayo de inhibición de lipooxigenasa, 10 (l de enzima (20,000 U, Glycine max (Soja tipo-1B, Sigma-Aldrich), se mezclaron con 10 (l de extracto acuoso de muestra fermentada y no fermentada, 970 (l de solución de borato (0.1M, pH 9.0) y 10 (l de ácido linoleico (0.6 mM). Este último se preparó en una solución de borato a una concentración de 0.6 mM y se adicionó 0.005% (v/v) de Tween (Sigma-Aldrich). La mezcla se dejó incubar por 5 min a 37 °C. La solución de borato se utilizó como la solución blanco del ensayo.
Análisis estadístico
Los experimentos se realizaron en triplicado. En los datos obtenidos se aplicó la prueba de normalidad (prueba de Shapiro-Wilk) y se realizó una comparación para muestras independientes, usando la prueba de t-student con corrección por la prueba de Welch. El análisis de los datos se realizó en el programa estadístico Prisma v. 8.2.1 (GraphPad, San Diego, California, EUA).
Resultados
La Figura 3 muestra los resultados de la determinación de fenoles totales determinados en el huauzontle fermentado y no fermentado. La concentración total fue de 7.49 y 20.24 (g/ml en equivalentes de ácido gálico para huauzontle no fermentado y fermentado, respectivamente. Estos resultados indican un incremento de 2.70 veces en semillas de huauzontle después de 24 h de fermentación con L. plantarum Lp22.
Figura 3: Concentración de compuestos fenólicos en semillas de huauzontle fermentado por Lactiplantibacillus plantarum Lp22. Los valores representan la media ( SD (n=3).
Lo relacionado con las propiedades funcionales evaluadas en la semilla de huauzontle fermentada, los valores de actividad antioxidante determinada por el método de ABTS fue de 812.5 y 927.5 (M en equivalentes de Trolox para semilla de huauzontle no fermentado y fermentado, respectivamente, y mostrando diferencia significativa (p=0.026).
Los resultados obtenidos de actividad antioxidante por el método de ORAC, fueron de 1384.32 y 3391.11 (M en equivalentes de Trolox, para huauzontle no fermentado y fermentado, respectivamente, lo que corresponde a un incremento de 2.44 veces después de la fermentación, siendo significativa para ambas determinaciones (Fig. 4).
Figura 4: Actividad antioxidante en semillas de huauzontle fermentado, determinado por los métodos de ABTS y ORAC. Los valores representan la media ( SD (n=3).
En el caso de la actividad antiinflamatoria, la inhibición de la actividad de las enzimas tripsina y lipooxigenasa mostró porcentajes entre 12.53 y 14.38% para tripsina y entre 40.06 y 37.24% para LOX para muestra no fermentada y fermentada, respectivamente (Fig. 5). Los resultados, en este caso en particular, muestran que el huauzontle fermentado y no fermentado presentan porcentajes de inhibición enzimática similares (p>0.05), y dicho efecto se mantiene aún después de la fermentación.
Discusión
Los resultados obtenidos en el presente estudio demostraron que la fermentación mejoró las propiedades antioxidantes que posee el huauzontle, los cuales podrían asociarse con el incremento en el contenido de fenoles totales en la muestra fermentada. Estudios previos en huauzontle mostraron una concentración de fenoles de 433.99 mg/100 g de peso fresco (Román-Córtes et al., 2018), siendo mayores a lo reportado en nuestro estudio. Esto se puede atribuir a que Román-Córtes et al. (2018) evaluaron tanto la semilla como las hojas del huauzontle, mientras que en nuestro caso solo fueron las semillas.
Adicional a estos estudios, algunos otros han reportado un incremento en la concentración de fenoles totales en algunos vegetales fermentados con diversas cepas de Lactobacillus plantarum. Por ejemplo, la fermentación en hojas de mora negra africana con L. plantarum 75 incrementó la concentración de los ácidos gálico, vanílico, cumárico, elágico, catequina y quercetina (Degrain et al., 2020). En un estudio reportado para sorgo fermentado por cepas de Lactobacillus spp., se incrementó el contenido de catequinas, ácido gálico y quercetina (Adebo et al., 2018). Asimismo, en un trabajo previo se observó un incremento en el contenido de fenoles totales en una infusión fermentada a base de semillas de huauzontle, con L. plantarum Lp22 (Garcia et al., 2022).
Durante el proceso de fermentación con bacterias ácido-lácticas, algunos compuestos pueden ser descarboxilados o reducidos por acción del ácido fenólico reductasa o por el ácido gálico descarboxilasa, impactando en la formación de nuevos compuestos (Adebo y Medina-Meza, 2020). Este incremento puede ser atribuido a que algunas bacterias ácido-lácticas pueden metabolizar compuestos fenólicos glicosilados y liberarlos (Salar et al., 2012; Zhao y Shah, 2016). En algunas especies de L. plantarum se ha reportado la presencia de enzimas como tanasa y galato descarboxilasa, debido al incremento de ácido gálico y elágico después de la fermentación, lo cual se puede explicar por la actividad de la enzima tanasa, lo que resulta en la bioconversión de galotaninas y elargitaninos (Jiménez-López et al., 2018; Degrain et al., 2020). Así como la fermentación puede impactar sobre la liberación de compuestos fenólicos, también las propiedades bioactivas como antioxidante y antiinflamatoria se ven favorecidas (Román-Cortés et al., 2018; Khubber et al., 2022).
Considerando que el huauzontle se puede consumir en diversas presentaciones culinarias, y las propiedades que han sido demostradas cuando es fermentado, este podría contribuir a la mejora de la salud (Manzanero-Medina et al., 2020). Diversas enfermedades, tales como obesidad, diabetes, cáncer, enfermedades respiratorias, e incluso enfermedades autoinmunes, se asocian con una inflamación de bajo grado, lo cual está estrechamente relacionado con el estrés oxidativo, que puede ser un efecto causal o secundario a la inflamación (Menzel et al., 2021). Como estrategias para disminuir las especies reactivas de oxígeno liberados en el organismo, se han estudiado ampliamente los compuestos antioxidantes provenientes de plantas (Adegbola et al., 2017). Estudios previos han demostrado que las semillas de huauzontle cocinado, por ejemplo, presentan actividad superior a 2000 mM de equivalentes de Trolox o un porcentaje de hasta 95.41% de actividad (Chaires-Martínes et al., 2013). El resultado encontrado en nuestro trabajo de investigación fue similar al reportado por Chaires-Martínes et al. (2013), indicando que la fermentación es una tecnología favorable para mejorar las propiedades bioactivas del huauzontle.
Referente a una potencial respuesta antiinflamatoria del huauzontle, se ha reportado que una infusión, a base de semillas de huauzontle, fermentado por L. plantarum Lp22 presenta porcentajes de inhibición de 36 y 39% para los dos ensayos enzimáticos utilizados (Garcia et al., 2022). Además, en un modelo de estrés crónico se obtuvo un aumento de IL-10, MCP-1 en muestras de plasma y de actividad de inhibición de LOX en hipocampo (Santiago-López et al., 2023). Estos porcentajes de inhibición se mantienen en la semilla de huauzontle, lo cual la hace de gran interés para la búsqueda de compuestos responsables de dicho efecto ya que pueden estar presentes per se en la planta.
Durante el desarrollo de un proceso de inflamación, algunas células son reclutadas hacia el sitio de la infección para activar una respuesta y contrarrestar los efectos (Chen et al., 2018). Durante este proceso, los eosinófilos, por ejemplo, son susceptibles a la actividad de proteasas, en donde un agonista de receptores activadores por proteasas induce la producción de uniones superóxido y la degranulación de las células (Miike et al., 2001). Las enzimas lipooxigenasas son enzimas que catalizan la oxidación de ácido grasos poliinsaturados, tales como linolénico, linoleico y araquidónico para producir hidroperóxidos (Chedea y Jisaka, 2013). En los procesos inflamatorios, la producción de especies reactivas de oxígeno conlleva a un incremento en la concentración de citocinas proinflamatorias y a la activación de LOX. Esta última es involucrada en la síntesis de leucotrienos y prostaglandinas, por lo que la inhibición de esta ruta es de gran importancia para detener el desarrollo de la inflamación (Lončarić et al., 2021).
Los compuestos fenólicos podrían ser los responsables de incrementar o mantener dicha actividad, aunque podrían no ser los únicos componentes presentes en la semilla de huauzontle. Por ejemplo, el trabajo de investigación reportado por Román-Cortés et al. (2018) mostró que la actividad antioxidante del huauzontle fue mayor (83% de inhibición de radicales libres), mismo que presentó el mayor contenido de fenoles y flavonoides en contraste a lo encontrado para otro tipo de quelites. Estos resultados concuerdan con lo encontrado en el presente estudio. Asimismo, en otros tipos de quelites, como las verdolagas, se ha documentado que los ácidos grasos insaturados, como el ácido linolénico, α-linoleico y araquidónico, podrían contribuir a disminuir la inflamación, mejorar el estado antioxidante, generar un efecto neuroprotector y efecto antidiabético (Uddin et al., 2014). Esto hace interesante conocer el impacto de la fermentación sobre este tipo de compuestos, y su relación con las propiedades antioxidantes y antiinflamatorias determinadas hasta el momento en las semillas de huauzontle.
Los hallazgos reportados en nuestro trabajo contribuyen a difundir las propiedades bioactivas del huauzontle, que han sido poco estudiadas. Además, hemos demostrado que con el proceso de fermentación se favorece la liberación o biotransformación de compuestos fenólicos, y que las propiedades antioxidantes y antiinflamatorias evaluadas in vitro se ven favorecidas. Sin embargo, no se puede descartar que componentes per se de la bacteria, conocidos como postbióticos (Pandey et al., 2022), también puedan contribuir a los resultados observados. En este sentido, aun son necesarios más estudios de caracterización para conocer los componentes de la planta que son biotransformados por acción del metabolismo de la bacteria y cuáles son liberados por las bacterias durante la fermentación. Esto es de gran importancia, ya que el huauzontle puede ser una fuente potencial para la elaboración de nuevos alimentos. Con esto, buscamos que esta planta de cultivo y consumo tradicional en México pueda ser revalorizada por las nuevas generaciones, dando a conocer sus propiedades funcionales.
