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Introducción
Las asociaciones que se establecen entre Hongos Micorrícicos Arbusculares (HMA) y briofitas (Anthocerotophyta, Bryophyta y Marchantiophyta) juegan un rol importante en el desarrollo de este grupo de plantas no vasculares. Asociarse les permite establecerse en ambientes con ciertas condiciones desfavorables para su desarrollo, como pueden ser los suelos pobres en materia orgánica, temperaturas extremas y presencia de patógenos (Liepina, 2012; Nelson y Shaw, 2019). En función de las estructuras fúngicas presentes como hifas inter e intracelulares, arbúsculos, coils y coils arbusculados, estas asociaciones se clasifican en dos tipos morfológicos conocidos como Arum y Paris (Smith y Smith, 1997). Dickson (2004) propuso la existencia de formas intermedias entre ambos tipos morfológicos, reconociendo una secuencia estructural entre Arum (con hifas intercelulares y arbúsculos intracelulares) y Paris (con hifas intracelulares con coils y coils arbusculados).
La relación entre HMA y Anthocerotophyta (antocerotes) ha sido estudiada con anterioridad y se sabe que en antocerotes la colonización por hongos puede diferir en abundancia y ocurrencia en los géneros Anthoceros L., Folioceros D.C. Bhardwaj, Megaceros Campbell, Nothoceros (R.M. Schust.) J. Haseg., Notothylas Sull. ex A. Gray, Phaeoceros Prosk. y Phaeomegaceros Duff, J.C. Villarreal, Cargill & Renzaglia, mientras que en Dendroceros Nees y Leiosporoceros Hässel, está ausente (Desirò et al., 2013). Dentro de las siete especies que comprenden el género Nothoceros (Villarreal et al., 2010), en dos ha sido analizada la presencia de asociaciones micorrícicas (Desirò et al., 2013). En Nothoceros vincentianus (Lehm. & Lindenb.) J.C. Villarreal, se registró la presencia de HMA con base en la revisión de especímenes recolectados en Panamá (Öpik et al., 2010; Desirò et al., 2013; Feijen et al., 2018), mientras que en N. giganteus (Lehm. & Lindenb.) J. Haseg. ex J.C. Villarreal, Hässel & N. Salazar, de material proveniente de Nueva Zelanda, no se observaron asociaciones con simbiontes fúngicos (Öpik et al., 2010; Desirò et al., 2013; Feijen et al., 2018). La especie N. fuegiensis (Steph.) J.C. Villarreal no ha sido analizada, por ello el objetivo principal de este trabajo es dar a conocer y caracterizar por primera vez la colonización de HMA en este antocerote.
Materiales y Métodos
Recolecta de material
Los especímenes de N. fuegiensis fueron recolectados en las Provincias de Chubut (Paraje Entre Ríos, Planta Educativa Parque Nacional Lago Puelo y arroyo Centinela); Neuquén (Lagunas de Epulafquen, Pilolil-Rahue, Playa Yuco y Termas del Queñi); Río Negro (Pampa Linda, arroyo Alerce, Paso Pérez Rosales, Puerto Blest, Villa los Coihues, lago Steffen y Refugio Los Laguitos) y Santa Cruz (Puerto Argentino); en sitios de bosque templado frío dominado por especies de Nothofagus Blume en la Patagonia, Argentina. El material recolectado se acondicionó utilizando técnicas tradicionales para el estudio de plantas no vasculares (Frahm, 2003) y se depositó en el herbario BCRU (Centro Regional Universitario Bariloche, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina). Para la identificación del material examinado se utilizaron los trabajos de Hässel de Menéndez (1961, 1990) y Villarreal et al. (2010).
Estudio de colonización
Las estructuras características de los HMA (hifas aseptadas, coils, arbúsculos y vesículas) fueron observadas después de preparar secciones sagitales de gametofitos teñidos y montadas en agua o lactofenol, se observaron en un microscopio compuesto Olympus BX50 (Olympus Corp., Tokio, Japón) y se fotografiaron con una cámara digital Lumenera Infinity 1 (Lumenera Corp., Otawa, Canadá).
Para observar la colonización por HMA, los gametofitos fueron lavados con agua corriente y preservados en etanol al 70% durante 24 horas a temperatura ambiente; posteriormente se colocaron en cajas de Petri a 50 °C sobre un agitador magnético de calentamiento (VELP Scientifica, Usmate, Velate, Italia), con placa caliente hasta la evaporación total del líquido. Posteriormente, fueron clarificados en hidróxido de potasio al 1% durante 20 minutos a 80 °C; acidificados con ácido clorhídrico al 1% durante 10 minutos a 50 °C y teñidos con azul de tripán al 0.05% durante 20 minutos a 60 °C (Cottet et al., 2018; Cottet y Messuti, 2019). El porcentaje de colonización por HMA se estimó utilizando la presencia o ausencia de las estructuras características de estos hongos con un aumento de 400× en todo el talo (47 talos). El número promedio de campos observados por talo fue de 800. El tipo de colonización se determinó utilizando los criterios de Dickson (2004), quien basó la clasificación en la presencia de hifas inter e intracelulares, arbúsculos, coils y coils arbusculados. Además, para determinar qué parte del talo estaba asociada con hifas, se realizaron cortes transversales tanto en las porciones distales como proximales de la planta.
Resultados
Los especímenes examinados de N. fuegiensis presentaron gametofitos verde-esmeralda, cespitosos o formando rosetas (Fig. 1A) adheridos al sustrato por rizoides unicelulares. En sección transversal, los talos mostraron una superficie dorsal plana con epidermis; tejido fundamental sólido sin cavernas, colonias de cianobacterias y una superficie ventral plana similar a la dorsal (Fig. 1B). En el área de estudio esta especie es frecuente, se encontró asociada a sectores muy húmedos cerca de arroyos o ríos, incluso sumergidos. Los talos analizados provenientes de sustratos no sumergidos, tales como suelo, roca y madera, presentaron una colonización de HMA variable donde el porcentaje osciló entre 9-40%. En tanto que en los talos que se desarrollaban sobre suelo, roca o madera sumergidos, o anfibios, no hubo colonización. Las estructuras fúngicas características observadas fueron las siguientes: hifas superficiales o externas cercanas a los rizoides, 7 μm de diámetro; hifas intracelulares, 5 μm de diámetro; coils arbusculados intracelulares y abundantes en la porción media del talo, 35-45 μm de diámetro (Fig. 1C); vesículas globosas, 17-25 μm de diámetro, escasas a abundantes (Fig. 1D). La colonización se encuentra restringida a la porción media ventral del gametofito y corresponde al denominado tipo morfológico Paris.
Figura 1: Nothoceros fuegiensis (Steph.) J.C. Villarreal, Cottet 5550 (BCRU). A. aspecto general del talo; B. sección transversal del talo colonizado por hongos micorrícicos arbusculares (▼); C. coil arbusculado (CA); D. hifas intracelulares (HI) y vesícula (V).
Material examinado: ARGENTINA. Provincia Chubut, Lago Puelo, Paraje Entre Ríos, confluencia río Azul y río Quenquentreu, I.2016, A. Cottet 5552 (BCRU); Parque Nacional Lago Puelo, Planta Educativa, 30.XI.2017, A. Cottet 5556 (BCRU), 5557 (BCRU); Parque Nacional Los Alerces, arroyo Centinela, 29.I.2017, A. Cottet 5549 (BCRU). Provincia Neuquén, Las Ovejas, Lagunas de Epulafquen, laguna Superior, 08.I.2019, A. Cottet 5567 (BCRU), 5568 (BCRU); entre Pilolil y Rahue, 05.X.2018, A. Cottet 5569 (BCRU); Parque Nacional Lanín, Playa Yuco, 31.XII.2018, A. Cottet 5559 (BCRU), 5560 (BCRU), 5561 (BCRU); Termas del Queñi, 30.XII.2018, A. Cottet 5562 (BCRU), 5563 (BCRU), 5564 (BCRU), 5565 (BCRU), 5566 (BCRU). Provincia Río Negro, Parque Nacional Nahuel Huapi, Pampa Linda, 08.XII.2016, A. Cottet 5539 (BCRU); sendero Refugio Otto Meiling, arroyo Alerce, 08.XII.2016, A. Cottet 5541 (BCRU), 5542 (BCRU), 5543 (BCRU), 5544 (BCRU); Paso Pérez Rosales, 10.XII.2016, A. Cottet 5545 (BCRU), 5546 (BCRU), 5547 (BCRU), 5548 (BCRU), Puerto Blest, sendero Puerto Cántaros - Puerto Blest, 08.IX.2017, A. Cottet 5510 (BCRU), 5518 (BCRU), 5519 (BCRU), 5550 (BCRU), 5554 (BCRU), 5555 (BCRU); San Carlos de Bariloche, Villa Los Coihues, VII.2016, A. Cottet 5553 (BCRU); Parque Nacional Nahuel Huapi, lago Steffen, 15.II.2018, A. Cottet 5558 (BCRU); El Bolsón, refugio Los Laguitos, I.2017, A. Cottet 5551 (BCRU). Provincia Santa Cruz, Parque Nacional Los Glaciares, Puerto Argentino, 26.XI.2016, A. Cottet 5526 (BCRU), 5527 (BCRU), 5528 (BCRU), 5529 (BCRU), 5530 (BCRU), 5531 (BCRU), 5532 (BCRU), 5533 (BCRU), 5534 (BCRU), 5535 (BCRU), 5536 (BCRU), 5537 (BCRU), 5538 (BCRU).
Discusión
Tradicionalmente los HMA han sido incluidos en el filo Glomeromycota (Brundrett, 2004; Bidartondo y Duckett, 2010). No obstante, en la última propuesta de clasificación filogenética (Spatafora et al., 2016) los HMA fueron transferidos a nivel de subfilo junto con Mortierellomycotina y Mucoromycotina. Con base en la clasificación de Spatafora et al. (2016), entonces, los HMA se ubican tanto en Glomeromycotina como en Mucoromycotina, representantes capaces de formar asociaciones micorrícicas con plantas no vasculares. Los Glomeromycotina se caracterizan por presentar hifas intracelulares principales de 4-8 μm de diámetro, hifas de arbúsculos con un rango entre 1-3 μm y por formar vesículas. Por otro lado, los Mucoromycotina presentan hifas intracelulares principales de 3-4 μm de diámetro, hifas de arbúsculos con un rango entre 0.5-1 μm de diámetro y no forman vesículas (Field et al., 2016). Teniendo en cuenta estas diferencias morfológicas, los hongos encontrados en N. fuegiensis pueden incluirse dentro de Glomeromycotina. Los especímenes estudiados presentan todas las características típicas del tipo morfológico de colonización Paris, lo que coincide con lo mencionado por Smith y Smith (1997), quienes concluyeron que este tipo predomina en las briofitas. No obstante, como una excepción, existe el caso de Phaeoceros laevis (L.) Prosk., donde el tipo morfológico de colonización es una forma intermedia entre el tipo Arum y el tipo Paris llamado Intermediate I (Cottet y Messuti, 2017). En los últimos años el estudio de esta simbiosis entre plantas y hongos se ha concentrado en aspectos moleculares y experimentales relacionados con la identidad y fisiología del hongo (Öpik et al., 2010; Martin, 2016; Carrillo-Saucedo y Gavito, 2020). Sin embargo, aún es necesario registrar y describir este tipo de asociación para numerosas especies de briofitas y ambientes. La información brindada a partir de este tipo de estudios descriptivos puede contribuir no solo a la comprensión integral de la interacción que ocurre entre los organismos involucrados, sino también proporcionar nuevos registros sobre la relación entre briofitas y hongos.
