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Introducción
El género Tigridia Jussieu pertenece a la familia Iridaceae, subfamilia Iridoideae, tribu Tigridiae, subtribu Tigridiinae (Goldblatt, 1982) y agrupa entre 50 y 55 especies (Goldblatt et al., 2008; The Plant List, 2013) que se distribuyen en México, América Central y los Andes. En México el género está representado por 35 taxa entre especies y variedades, y la nativa Tigridia pavonia (L.f.) DC. es la especie de más amplia distribución (Calderón de Rzedowski, 1987; Henrich y Goldblatt, 1994; López-Ferrari y Espejo, 1994; Rodríguez y Sytsma, 2006). Se le encuentra principalmente en bosques de Pinus y Quercus a lo largo de la Sierra Madre Occidental, la Sierra Madre Oriental, el Eje Volcánico Transversal, la Sierra Madre del Sur y la Sierra Madre de Chiapas (Molseed, 1970) y se considera que México representa su centro de mayor diversidad genética (Arzate-Fernández et al., 2008). Es una hierba criptófita de bulbo carnoso, posee hojas grandes, lanceolares y envainantes, su flor es actinomorfa, posicionada sobre un escapo cilíndrico con varias flores bilabiadas grandes, de color rojo a amarillo y es considerada una de las flores más bellas (Fig. 1) y más representativas de la Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel (REPSA) (Velázquez-López et al., 2009). La REPSA es una reserva natural urbana que pertenece a la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y desde el siglo XIX es considerada como un sitio de alta riqueza de especies vegetales (Rzedowski, 1954; Valiente-Banuet y Luna, 1990), animales (Negrete y Soberón, 1994) y hongos (Hernández-Cuevas et al., 2003). Tigridia pavonia es conocida como hierba de la trinidad, cacomit, flor del tigre y oceloxóchitl. Además de ser una especie ornamental también se le utiliza como alimento y, por sus propiedades antipiréticas, en la medicina tradicional (Vázquez et al., 2001; Rojo y Rodríguez, 2002).
Desde el punto de vista citogenético, Goldblatt (1982) sugirió que la subtribu Tigridiinae tiene un número cromosómico básico x=14. Posteriormente, Kenton y Heywood (1984) registran una especie de Tigridia colectada en Perú (Tigridia sp.) con un número cromosómico diploide 2n=14 y proponen x=7 para el género Tigridia. Por otra parte, los estudios citogenéticos realizados en T. pavonia incluyen registros de 2n=26 (Brittingham, 1934; Sharma y Sharma, 1961) y 2n=28 (Sakai, 1952; Molseed, 1970; Goldblatt, 1982; Kenton y Heywood, 1984). Aunque en todos los trabajos anteriores se describen complementos cromosómicos claramente bimodales, no existen propuestas de fórmulas cariotípicas y sólo en dos de éstos se registraron tallas cromosómicas. A las discrepancias en los números cromosómicos obtenidos con técnicas citogenéticas diferentes se suma la propuesta de Kenton y Heywood (1984) sobre el posible origen alotetraploide de T. pavonia en función de un número básico x=7(2n=4x=28) y no aquel x=14 propuesto por Goldblatt (1982).
Los objetivos de la presente investigación son analizar citogenéticamente una muestra de individuos de T. pavonia de la REPSA para: (I) corroborar el número cromosómico de este taxon, (II) analizar en detalle su arquitectura cromosómica en la búsqueda de evidencias que descarten o sustenten el origen híbrido con particular énfasis en el número y morfología de los cromosomas con satélite como criterio para establecer la existencia o no de dominancia nucleolar o amfiplastía diferencial y (III) proponer una fórmula cariotípica acorde al nivel de ploidía. La información del sistema genético básico de esta especie es necesaria para interpretar su evolución y su amplia distribución y variabilidad morfológica.
Materiales y Métodos
Colecta de material
Se recolectaron frutos de Tigridia pavonia durante el mes de noviembre de 2014 en las zonas de amortiguamiento A8 (Biológicas) y A10 (Jardín Botánico) de la Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel (REPSA) de Ciudad Universitaria (UNAM, 2005), en el sur de la cuenca del valle de México; entre 19°20'2" y 19°13'45"N, 99°08'26" y 99°14'3"O; 2250 a 2350 m s.n.m.
Germinación de semillas
Un grupo de semillas seleccionadas al azar, provenientes de seis individuos, fueron puestas a germinar en cajas de Petri con algodón humedecido en agua destilada y cubierto con papel absorbente en incubadora a 32 °C por la noche y a temperatura ambiente durante el día, por un periodo mayor a tres semanas y hasta su germinación. Las raíces de 1-2 mm de largo fueron cortadas y pretratadas en 8-hidroxiquinoleína 0.002 M durante 5 h a temperatura ambiente y en oscuridad. Posteriormente, fueron fijadas en solución Farmer, etanol-ácido acético, 3:1.
Obtención de cromosomas
Para la obtención de los cromosomas en metafase se siguió el método de extendido en superficie y secado al aire propuesto por Tapia-Pastrana y Mercado-Ruaro (2001), el cual se basa en la maceración enzimática (pectinasa 20%+celulasa 2%) de los meristemos apicales durante 2 h a 37 °C, seguido de la transferencia de los protoplastos a una solución fresca de KCl 0.075 M durante 15-20 minutos a 37 °C. Posteriormente, se realizaron dos lavados con la misma solución y el botón celular fue fijado en solución Farmer. Dos gotas del botón celular se colocaron sobre portaobjetos limpios y la tinción de los cromosomas se realizó con Giemsa a 10%. Las preparaciones se hicieron permanentes empleando resina sintética (Sigma) como medio de montaje. Los mejores campos fueron fotografiados con un microscopio óptico Zeiss Axioskop (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania), usando película Kodak Technical Pan.
Se utilizó un vernier digital Mitutoyo Digimatic Caliber CD-G’’BS (Mitutoyo Corporation, Kanagawa, Japón) para establecer las tallas cromosómicas y otras medidas morfométricas sobre siete fotografías de placas en metafase típica con similar grado de condensación y amplificadas con la misma magnificación.
Para la obtención de la fórmula cariotípica y nomenclatura, se aplicó el sistema propuesto por Levan et al. (1964). La proporción de brazos, r, se obtuvo mediante el cociente q/p, valor que muestra la relación del brazo largo y el brazo corto de los cromosomas individuales. La proporción de la suma total de longitudes de brazos cortos respecto a la suma total de longitudes cromosómicas como indicador de simetría o asimetría de un cariotipo (TF%) se realizó según Sinha y Roy (1979).
Resultados
Cuantificación del cariotipo
Las características cuantitativas del cariotipo de Tigridia pavonia se describen en el Cuadro 1, mientras que en el Cuadro 2 se resumen otros datos relacionados con los complementos de la misma. Se observaron un total de 224 células en metafase típica. En todas se registró sin ambigüedad un 2n=28, los complementos cromosómicos claramente fueron asimétricos y bimodales, conformados por cuatro cromosomas submetacéntricos grandes (6.84±0.33µm) y 24 cromosomas más pequeños con centrómeros medios (metacéntricos) o ligeramente desplazados (submetacéntricos). En estos se apreció que los cuatro cromosomas homólogos más pequeños (sm) portaban constricciones secundarias asociadas a macrosatélites (Cuadro 1; Fig. 2), según la clasificación de Battaglia (1955).
Cuadro 1: Medidas cromosómicas promedio obtenidas de siete células en metafase típica de Tigridia pavonia (L.f.) DC. GC: grupo cromosómico; LC: longitud cromosómica en µm; LBL: longitud de brazo largo en µm; LBC: longitud de brazo corto en µm; r: LBL/LBC; N: nomenclatura; *: constricción secundaria y satélite.
| GC | LC | LBL | LBC | r | N |
| 1-4 | 6.84±0.33 | 4.66 | 2.17 | 2.14 | sm |
| 5-8 | 3.33±0.40 | 1.82 | 1.50 | 1.21 | m |
| 9-12 | 3.07±0.14 | 1.82 | 1.37 | 1.32 | m |
| 13-16 | 2.90±0.08 | 1.86 | 1.03 | 1.80 | sm |
| 17-20 | 2.83±0.11 | 1.80 | 1.02 | 1.76 | sm |
| 21-24 | 2.56±0.07 | 1.45 | 1.10 | 1.31 | m |
| 25-28 | 2.23±0.01 | 1.42 | 0.80 | 1.77 | sm* |
Rearreglos cromosómicos
Por otra parte, se encontró evidencia de posibles translocaciones particularmente en los cromosomas submetacéntricos grandes donde frecuentemente fueron observados tanto en los brazos cortos y largos segmentos de los cromosomas alineados de manera atípica y en algunos casos formando ángulos raramente observados en cromosomas vegetales (Fig. 3). Asimismo, se observó con relativa frecuencia por lo menos un cromosoma metacéntrico pequeño (Fig. 3) que exhibió un centrómero notoriamente laxo el cual separa ampliamente a ambos brazos (Figs. 3, 4).
Figura 3: Metafase mitótica de Tigridia pavonia (L.f.) DC. 2n=4x=28. Las flechas estrechas señalan sitios de probables translocaciones. Las flechas gruesas resaltan a dos cromosomas con centrómero laxo. * =cromosomas con satélite. Barra=10 µm.
Propuesta de fórmula cariotípica
Para la descripción del cariotipo de T. pavonia de la población bajo estudio se consideró un número básico x=7 (Kenton y Heywood, 1984) y sobre la base de la longitud cromosómica y proporción de brazos fue posible caracterizar siete grupos de cuatro cromosomas cada uno con una morfología similar correspondientes a una especie de origen autotetraploide (Cuadro 1). En consecuencia, la fórmula cariotípica haploide propuesta para la población bajo estudio fue 6m + 8sm (Cuadro 2). La Figura 5 muestra el cariotipo de T. pavonia donde los cromosomas fueron agrupados por homología, alineados por el centrómero y en orden decreciente, conforme a la propuesta de Kenton y Heywood (1984). No se encontró evidencia de fragmentos ni se observaron cromosomas B.
Cuadro 2: Características cuantitativas del complemento cromosómico de Tigridia pavonia (L.f.) DC. obtenidos a partir de siete células en metafase. FC: fórmula cromosómica; LCTH: longitud cromosómica total haploide en µm; TCP: talla cromosómica promedio en µm; Rango (longitud del cromosoma mayor-longitud del cromosoma menor); Razón (cromosoma mayor/cromosoma menor); TF%: índice de asimetría (longitud total de brazos cortos/longitud cromosómica total × 100).
| 2n | FC | LCTH | TCP | Rango | Razón | TF% |
| 28 | 6m+8sm | 47.54±1.69 | 3.39±0.12 | 4.61±0.34 | 3.06±0.16 | 37.83 |
Figura 5: Cariotipo de Tigridia pavonia (L.f.) DC. (2n=4x=28), con siete grupos de cuatro cromosomas cada uno con una morfología similar sobre la base de la longitud cromosómica y proporción de brazos. Los cromosomas fueron agrupados por homología, alineados por el centrómero y en orden decreciente. *=cromosomas con satélite. Barra=10 µm.
Discusión
El número cromosómico 2n=28 obtenido en la presente investigación para la población estudiada se obtuvo a partir del recuento de 224 células en metafase y por tanto se corrobora un 2n=28 encontrado por Sakai (1952), Goldblatt (1982) y Kenton y Heywood (1984) quienes utilizaron técnicas estándar de squash y tinción Feulgen y corresponde al de una población tetraploide con un número básico x=7, reconocido como el predominante en las monocotiledóneas (Raven, 1975; Dahlgren et al., 1985).
La propuesta sobre la participación de translocaciones en la conformación del cariotipo actual de T. pavonia de la REPSA se sustenta en la identificación de segmentos cromosómicos con alineación atípica a lo largo de ambos brazos de los cromosomas grandes y que frecuentemente se corresponden con inflexiones raramente observadas en los cromosomas de especies vegetales (Fig. 3). Este fenómeno parece correlacionar con los fragmentos y cromosomas B observados en diversas especies de Tigridia (Molseed, 1970) y con el registro de centrómeros frágiles y aparentes constricciones secundarias en los cromosomas grandes de una especie diploide 2n=14 descrita como Tigridia sp. (Kenton y Heywood, 1984), en donde además solo se registró un par de cromosomas pequeños con satélites. Tomadas en conjunto, estas observaciones apuntan hacia un papel activo de translocaciones subsecuentes a rompimientos en sitios frágiles en los cromosomas grandes de T. pavonia, fenómeno similar al exhibido por Milla biflora Cav. (Asparagaceae), otra monocotiledónea con amplia distribución (Tapia-Pastrana, 2014) y confirman la opinión de Stebbins (1971), quien sugirió el papel relevante de las translocaciones en la conformación de los cariotipos bimodales de las monocotiledóneas.
Por otra parte, Kenton y Heywood (1984) señalan que existe poca heteromorfia entre los cromosomas grandes de T. pavonia; sin embargo, esta misma observación puede aplicarse a los agrupamientos de los cromosomas pequeños propuestos por las mismas autoras como se aprecia en la Figura 4b de su investigación. Estos datos parecen describir mejor a una especie de origen autopoliploide y no a una alopoliploide como fue sugerido. Asimismo, la identificación de siete grupos de cuatro cromosomas cada uno con morfología similar obtenidos en la presente investigación refuerza la idea anterior.
Por otro lado, la presencia de satélites ubicados en los brazos cortos de los cuatro cromosomas más pequeños apunta hacia la ausencia de amfiplastía o dominancia nucleolar, es decir la inactivación uniparental de transcripción de los genes del rRNA por competencia de los organizadores nucleolares (Navashin, 1928; Preuss y Pikaard, 2007). A este respecto conviene mencionar que en el proceso autopoliploidía el número de satélites presentes en una especie diploide también se duplica y no involucra pérdida o supresión de la función nucleolar. Las regiones del organizador nucleolar (NOR) asociadas a las constricciones secundarias se muestran laxas y por tanto los satélites se aprecian claramente. Por ejemplo, Medicago sativa L., un reconocido autotetraploide, exhibe cuatro macrosatélites en células en metafase (Falistocco, 1987). En contraparte, las plantas de origen alopoliploide experimentan inactivación de las regiones NOR de uno de los genomas parentales, silenciadas por efecto de dominancia nucleolar y en consecuencia se registra un número menor de satélites. Así, en el complejo Hordeum murinum L. (Poaceae, Triticeae) los citotipos tetraploides y hexaploides surgidos por hibridación exhiben únicamente un par de cromosomas con constricciones secundarias y satélites (Cuadrado et al., 2013). De hecho, la inactivación de genes ribosomales es uno de los fenómenos más comunes en miembros híbridos y poliploides de Triticeae (Cermeño y Lacadena, 1985; Carmona et al., 2016).
Así, la identificación de siete grupos cromosómicos de morfología similar y la ausencia de dominancia nucleolar apoyan nuestra propuesta sobre el origen autotetraploide de T. pavonia. Si bien la morfología de los cromosomas en metafase mitótica se ha usado frecuentemente como criterio para distinguir entre autopoliploides y alopoliploides, es necesario emplear el mayor número de evidencias posibles en la determinación de la naturaleza poliploide en especies vegetales (Stebbins, 1971), por lo que en un futuro se deberán realizar estudios meióticos y técnicas de bandeo que apoyen la propuesta anterior.
Asimismo en la población aquí estudiada las tallas cromosómicas se ubicaron en el intervalo de 2.23 hasta 6.84 µm el cual concuerda en general con aquellas registradas previamente por Sharma y Sharma (1961), quienes obtuvieron un intervalo de 2.1-8.8 µm y con el de Kenton y Heywood (1984) que lo ubicaron entre 3 y 6.5 µm. Las diferencias se atribuyen a que T. pavonia contiene un grupo de cromosomas grandes que varían en su grado de contracción durante la metafase mitótica.
