Material vegetal

Se seleccionaron seis especies, tres de la familia Asparagaceae Agave funkian (K. Koch & C. D. Bouché), Agave obscura (Schiede ex Schltdl.), Agave salmiana (Otto ex Salm-Dyck); y tres de la familia Cactaceae Opuntia cochenillifera (Linnaeus & P. Miller), Opuntia ficus-indica (Linnaeus & P. Miller), y Pereskia sacharosa (Grisebach), con base en un trabajo previo de plantas tolerantes de zonas áridas (^{Perales-Aguilar et al., 2020}).

Propagación in vitro del material vegetal

La multiplicación de las especies se llevó a cabo mediante propagación in vitro, colocando cuatro explantes por frasco con capacidad de 500 mL, se añadieron 60 mL del medio MS (^{Murashige y Skoog, 1962}), adicionados con 8 g L^-1 de agar más 2 mg L^-1 de Benciladenina (BA) para la familia Asparagaceae y 10 g L^-1 de agar más 1 mg L^-1 de BA para la familia Cactaceae, a pH de 5.7 y con 3% de sacarosa. Los cultivos se mantuvieron a 25 ± 2 °C y con fotoperiodo 16/8 controlado. A los cuatro meses se registró el número y la longitud (cm) de cada brote por explante, se utilizó un diseño completamente al azar, con cuatro repeticiones, n = 16. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) para cada familia, utilizando el paquete estadístico GraphPad Prism versión 7.09.

Efecto de los metales Cd y Pb

Las pruebas de toxicidad se realizaron con los brotes regenerados, se transfirieron a la etapa de enraizamiento en medio MS (1962) sin metales (control) y en medio MS (1962) con metales pesados. Las concentraciones fueron 0.005, 0.007, 0.009 mM para CdCl₂ y 0.4, 0.6, 0.8 mM para Pb(NO₃)₂, todas las sales con 99% de pureza con grado de reactivo (Perales et al., 2020). A los tres meses de establecidos los bioensayos, se calculó el porcentaje de mortalidad y con el análisis Probit se calculó la CL₅₀, se realizó un diseño completamente al azar, con n = 9, tres repeticiones y análisis de varianza (ANOVA) (P ≤ 0.05) para validar la prueba. Se utilizó el paquete estadístico GraphPad Prism versión 7.09.

Propagación in vitro

Las seis especies presentaron respuesta morfogenética diferenciada al desarrollar brotes. Se registraron diferencias estadísticas significativa para la especie O. cochenillifera, en el número de brotes por explante, como se observa en el Cuadro 1. ^{Retes-Pruneda et al. (2007)} propagaron in vitro cactáceas, evaluando dos citocininas, Isopenteniladenina (2ip) y BA, en dos especies, Echinocereus knippelianus, y Polaskia chichipe, que respondieron significativamente a los tratamientos con la hormona vegetal BA.

La familia Asparagaceae presentó en promedio seis brotes por explante con una longitud de hasta 5 cm. El Agave retiene y conserva agua de lluvia lo que reduce la erosión del suelo, por ello la importancia de su propagación in vitro masiva mediante el uso hormonas vegetales como BA (^{Aguilar-Jiménez y Rodríguez-de la O, 2018}). El género Agave, se ha propagado in vitro exitosamente utilizando concentraciones que van de 1 mg L^-1 a 1.5 mg L^-1 de BA, generándose hasta 10.5 brotes por explante (^{Domínguez-Rosales et al., 2008}). La propagación in vitro se basa en asegurar la subsistencia de las especies vegetales que están comprometidas por la explotación de sus recursos, como lo son las plantas de zonas áridas (^{Morales-Rubio et al., 2016}). En la familia Cactaceae la especie O. cochenillifera respondió con 9 brotes por explante y longitud de 4 centímetros.

Efecto de los metales pesados Cd y Pb

La mortalidad más alta, 77%, se presentó en el tratamiento con Pb a la concentración de 0.8 mM (Cuadro 2). Lo metales pesados como Cd y Pb, inhiben el crecimiento y afecta la fotosíntesis en las plantas incluso en concentraciones subletales (^{Ouyang et al., 2012}).

A. salmiana presentó mortalidad de 55% con el tratamiento 0.009 mM de Cd, y 77% con 0.8 mM de Pb; A. funkiana 44% y 66% respectivamente, O. ficus-indica y P. sacharosa 55% con Cd, 44% y 77% con Pb; y O. cochenillifera 55% de mortalidad con Pb. Tanto los valores de mortalidad como los valores de las CL₅₀ indican que las especies más sensibles a la concentración más alta, fueron A. salmiana y P. sacharosa, tanto con Cd 0.009 mM como con Pb 0.8 mM. Las seis especies evaluadas desarrollaron raíz en el tratamiento control, que sólo contenía los metales pesados considerados como micronutrientes, que se encuentran en el medio de cultivo MS (1962). Estas especies al ser propagadas in vitro presentaron raíz fasciculada, debido a que la raíz primaria se pierde (Figura 1). Las seis especies desarrollaron raíz en todos los tratamientos. La especie O. cochenillifera presentó clorosis y muerte casi total, formando raíz solo en el tratamiento con Pb a 0.8 mM. Por la raíz entran los metales pesados a la planta, mediante adsorción y quelación por fitoquelatinas (^{Du et. al., 2018}). Entre las proteínas responsables de la movilidad de Cd al interior de célula se encuentran LCT1, IRT1 y Nramp, localizadas en la membrana de la vacuola (^{Rodríguez-Serrano et al., 2008}).

Figura 1: Comportamiento morfológico de las plantas sometidas a metales pesados: (a) Agave obscura, control; (b) A. obscura, 0.009 mM de Cd; (c) Opuntia cochenillifera, control; (d) O. cochenillifera, 0.8 mM de Pb; (e) O. ficus-indica, control y (f) O. ficus-indica, 0.8 mM de Pb en zonas áridas de México.  

Figure 1: Morphological behavior of plants subjected to heavy metals: (a) Agave obscura, control; (b) A. obscura, 0.009 mM Cd; (c) Opuntia cochenillifera, control; (d) O. cochenillifera, 0.8 mM Pb; (e) O. ficus-indica, control and f) O. ficus-indica, 0.8 mM Pb in arid zones in Mexico. 

En los tratamientos con Cd y Pb, O. cochenillifera y O. ficus-indica presentaron menor crecimiento de la parte aérea, en comparación con su control. Cuando las plantas son expuestas a metales pesados como Cd y Pb, se observa una disminución significativa en la formación de raíces. Por lo general, las plantas expuestas a Cd y Pb, tienen mayor concentración del metal en las raíces, por lo que se reduce la acumulación del metal en los brotes (^{Seregin e Ivanov, 2001}; ^{Rajkumar et al., 2009}). Los metales pesados como Cd y Pb afectan a las plantas debido a que alteran sus procesos fisiológicos, se reduce el crecimiento y presentan una menor producción de biomasa (^{Nagajyoti et al., 2010}).

En el Cuadro 3 se presentan los valores de toxicidad, CL₅₀, los límites de confianza inferior y superior a 95% de los bioensayos obtenidos por el método Probit, A. funkiana y A. obscura con CL₅₀ de 0.009 mM en Cd y A. obscura con CL₅₀ de 0.813 mM en Pb. ^{Reddy et al. (2013)} estudiaron la especie Oryza sativa L. con metales considerados como micronutrientes (Cu, Mn y Zn) y los que no lo son como Cd y Pb, los resultados mostraron que el Cd es altamente tóxico, el Pb moderadamente tóxico, y Cu, Mn y Zn son de baja toxicidad. A. salmiana presentó CL₅₀ de 0.008 mM para Cd y 0.546 mM para Pb; esta especie de la familia Asparagaceae, es muy emblemática para México y clave para la estructura y funcionamiento de los ecosistemas de las zonas áridas, por eso la importancia de investigar y estudiar este tipo de plantas (^{Martínez-Salvador, 2013}; ^{Gschalerdler, 2017}).

O. ficus-indica presentó CL₅₀ de 0.008 mM con Cd y 0.813 mM con Pb. En un estudio de toxicidad de cadmio y plomo en Brachiaria arrecta, los resultados mostraron mayor deterioro en raíces, tallos y hojas de las plantas, cuando fueron expuestas a Pb, que cuando se expusieron a Cd; la bioconcentración de metales pesados en los tejidos vegetales ocasiona trastornos histológicos, como los presentados en esta especie de planta, que resultó muy susceptible (^{Peláez et al., 2014}).

O. cochenillifera presentó CL₅₀ de 0.010 mM con Cd y 0.755 mM con Pb. ^{Pokorska-Niewiada et al. (2018)} realizó un estudio similar, con Cd y Pb, las concentraciones dependieron del contenido permitido en suelo para cada metal durante el proceso de germinación de semillas, el grado de toxicidad del metal se determinó calculando los valores de CL₅₀ y encontraron que las semillas más sensibles fueron las de cebada para Cd y berro para Pb. El cadmio y el plomo inhiben la proliferación y división celular de los meristemos, provocando daño a la planta incluso en bajas concentraciones (^{Lin y Aarts, 2012}).

Las diferentes concentraciones de los metales cadmio y plomo produjeron efectos distintos en las seis especies estudiadas. De las seis especies evaluadas, las que toleraron las concentraciones más altas de Cd y Pb fueron A. obscura, O. cochenillifera y O. ficus-indica. Las plantas como respuesta a la toxicidad de Cd y Pb, han desarrollado mecanismos de defensa que se basan en la acumulación del metal en las raíces (^{Silva et al., 2018}).