Introducción

La simbiosis leguminosa-Rhizobium es el proceso biológico capaz de convertir nitrógeno atmosférico elemental (N₂) en amonio (NH₄ ⁺), forma aprovechable por las plantas. Los rizobios de los nódulos reducen entre 50 y 70% del nitrógeno biológicamente fijado en el mundo y aportan hasta 65% del nitrógeno utilizado en la agricultura (^{Simon et al., 2014}). Se estima que los niveles de fijación biológica del nitrógeno (FBN) a través de la simbiosis leguminosa-Rhizobium, puede variar desde 24 hasta 584 kg N ha^-1, proceso que puede ser capaz de abastecer en algunos casos hasta 90% de las necesidades de las plantas (^{Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015}).

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una leguminosa poco eficiente en fijación biológica de nitrógeno (^{Gómez et al., 1998}; ^{Granda et al., 2009}; ^{Yadegari, 2014}). Sin embargo, diversos estudios en este campo consideran que existe potencial para lograr un incremento en la fijación de nitrógeno a través de la selección de un binomio planta de frijol-cepa de Rhizobium eficiente en FBN (^{Acuña y Uribe, 1996}; ^{Granda et al., 2014}; ^{Farid y Navabi, 2015}). En frijol, ^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)} reportan diferencias en los niveles de fijación de nitrógeno entre variedades, desde 7.1 hasta 106.5 kg ha^-1.

Los trabajos de investigación encaminados a evaluar cepas de Rhizobium en diferentes leguminosas de importancia agrícola, entre ellas el frijol común, han sido orientados a la selección de cepas de mayor eficiencia en el proceso de fijación biológica de nitrógeno (FBN) (^{Granda et al., 2014}). Desde 1988 a 1992 el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) realizó trabajos sobre FBN en la Zona Andina con el objetivo de aumentar la producción y productividad del frijol solo y asociado con maíz, mediante la selección y uso de cepas de Rhizobium eficientes en la fijación de N₂, con capacidad competitiva contra las cepas nativas y con un rango amplio de adaptación. Esta investigación se realizó en laboratorio, invernadero y en campos de agricultores de la sierra peruana, donde se seleccionaron cuatro cepas con las características deseadas: CIAT 7001, Cusco 10, CIAT 2 y Cajamarca 13. En los ensayos de campo se lograron incrementos de 22 % en el rendimiento de frijol (^{Pineda, 1992}).

^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)}, evaluaron 98 aislados colectados en raíces de frijol cultivado de nueve estados de la Mesa Central y del Norte-Centro de México en variedades de frijol de diferente hábito de crecimiento. Por número de nódulos efectivos y producción de materia seca, encontraron que 37.5% de las cepas estudiadas se comportaron como efectivas en más de una variedad, el 26% como efectiva en dos variedades, 10% en tres variedades y únicamente la cepa EL 63 resultó efectiva en todas las variedades de frijol común. Esta variabilidad fue evidente en fijación entre las cepas de Rhizobium y una mejor nodulación en variedades de hábito indeterminado. Estos autores también afirman que es factible incrementar la fijación de nitrógeno del frijol en el campo, mediante la selección de cepas efectivas y competitivas, capaces de sobrevivir y adaptarse a las condiciones del suelo, así como la selección de variedades de frijol con alta capacidad de fijar nitrógeno en simbiosis con Rhizobium.

^{Acuña et al. (2001)} realizaron estudios en validación de inoculantes con cepas de Rhizobium en Centro América en 45 sitios de Panamá, Costa Rica, Nicaragua y el Salvador, con el objetivo de evaluar el efecto de los inoculantes en la producción comercial de frijol, considerando cuatro tratamientos: testigo absoluto (sin fertilización ni inoculación), inoculado, fertilización nitrogenada intermedia más inóculo y fertilización recomendada localmente. En Panamá la fertilización recomendada presentó los mayores rendimientos, seguida del tratamiento fertilización intermedia más inoculo. En Costa Rica y Nicaragua se obtuvieron los mayores rendimientos con fertilización intermedia más inoculo y fertilización recomendada. En El Salvador los mayores rendimientos de frijol se lograron con la fertilización intermedia más inóculo. Los autores concluyen que, no obstante, la buena respuesta del frijol al tratamiento combinado de fertilización nitrogenada intermedia más Rhizobium o fertilización recomendada, por menor costo de inversión el tratamiento seleccionado como mejor en el 80% de los casos, fue el de solo inoculante.

^{Mostasso et al. (2002)}, evaluaron 36 aislados y dos cepas comerciales de Rhizobium en dos variedades de frijol, con el objetivo de seleccionar cepas eficientes en fijación de nitrógeno. Reportaron que 10 de los aislados mostraron igual o mayor capacidad de fijación de nitrógeno en comparación con la cepa comercial CIAT 899, en ambas variedades. Concluyeron que los aislados seleccionados pueden ser utilizados como inoculantes para reducir el uso de fertilizante nitrogenado.

En los trabajos de evaluación y selección de cepas de Rhizobium eficientes en fijación biológica de nitrógeno atmosférico, la mayoría de los investigadores han considerado como variables importantes el número y peso seco de nódulos y peso seco de la parte aérea en ensayos de invernadero. Índices de eficiencia han sido poco utilizados en la evaluación y selección de cepas, índices que combinen más de una variable y que permitan hacer una mejor discriminación y distinción de cepas efectivas. ^{Bécquer et al. (2013)}, utilizaron dos índices: índice de nodulación (IN) e índice de eficiencia de la inoculación (IEI) para selección de cepas de Bradyrhizobium de Centrocema spp. El IN lo estimaron dando valores numéricos (3, 2 o 1) al tamaño, color y cantidad de nódulos y multiplicando los tres valores obtenidos en cada aislado. El IEI se calculó usando el peso seco del vástago y la fórmula: (tratamiento inoculado - tratamiento no inoculado) / tratamiento no inoculado, todo multiplicado por 100.

La presencia en el suelo de cepas nativas poco eficientes y muy competitivas, así como algunos aspectos abióticos del suelo que afectan el proceso de infección, contribuyen a la baja eficiencia en la fijación de N₂ del binomio frijol-Rhizobium (^{Mora, 1995}; ^{Martínez-Romero, 2001}; ^{Castro et al., 2006}). Estos autores afirman que la selección de cepas eficientes y competitivas debe realizarse directamente en el área de producción, donde como primer paso se deben de colectar rizobios nativos y como segundo, evaluarlos por eficiencia en fijación en las variedades locales y bajo las condiciones de clima y suelo del área de producción. Esta estrategia puede fructificar en un incremento en la tasa de fijación (^{Ferrera-Cerrato et al., 1990}; ^{Granda et al., 2014}).

Con base en la variabilidad genética del frijol (^{Lépiz y Ramírez, 2010}) y del Rhizobium (^{López et al., 2017}) en la región occidente de México, el presente trabajo tuvo el objetivo de evaluar la eficiencia en FBN de 27 cepas de Rhizobium procedentes de nódulos colectados en plantas de frijol cultivado y silvestre de los estados mexicanos de Jalisco y Michoacán.

Materiales y Métodos

El experimento se condujo bajo malla sombra en el municipio de Zapopan, Jalisco, México. Se emplearon 27 cepas de Rhizobium (Cuadro 1), nueve procedentes de raíces de plantas de frijol silvestre y 18 de frijol cultivado, colectadas en los estados de Jalisco y Michoacán (Cuadro 2). El trabajo de colección, aislamiento, purificación, conservación e incremento de las cepas en el laboratorio, se describe por ^{López et al. (2017)}. Como hospedero se utilizó la variedad de frijol cultivado Cuarenteño de hábito determinado, cultivar con antecedentes de eficiencia en la producción de nódulos (Com. Pers.¹).

Las cepas se incrementaron en medio CELM (^{Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015}) en tubos de vidrio de 10 mL puestos en agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento de 10⁸ UFC mL^-1, de acuerdo con la escala de ^{McFarland (McFarland, 1970)}. Las semillas de frijol se lavaron con jabón, se esterilizaron en etanol al 70% por un minuto, se enjuagaron tres veces consecutivas con agua destilada estéril, se transfirieron a una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante tres minutos y finalmente se lavaron cinco veces con agua destilada estéril (^{Rodríguez, 1993}).

Las 27 cepas y dos tratamientos testigo (absoluto sin fertilización ni inoculación y fertilizado con 30 kg ha^-1 de N) se evaluaron en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones. Se sembraron cuatro semillas de frijol por contenedor de plástico de 1 L con arena (jal) tamizada en una zaranda de 4 × 4 mm, lavada y desinfectada con Bromometano (80 g m^-3 y 48 horas de exposición; evitar su inhalación); después de la emergencia se dejaron dos plantas por contenedor y se aplicaron 2 mL de inóculo. Durante el ensayo se aplicaron riegos con solución nutritiva de Jensen libre de nitrógeno, tres veces por semana. El registro de las variables se realizó en la etapa de prefloración del frijol.

Se midieron longitud de vástago, considerado como altura de planta (LV), longitud de raíz (LR), número de nódulos (NN), peso seco del vástago (PSV), peso seco de raíz (PSR), peso seco de nódulos (PSN), nitrógeno total (%) en el vástago (NT) y contenido de clorofila (CL) en unidades SPAD (Soil Plant Analysis Development) (^{Gholizadeh et al., 2011}). Para el registro de las variables LV, LR, PSV, PSR, NN y PSN se usó el promedio de dos plantas por contenedor. Para número de nódulos, las raíces se lavaron en un contenedor con agua por dos veces, se separaron y se contaron. Para NT se extrajo una muestra de biomasa de tallos y hojas por contenedor. Para obtener el peso seco, las muestras de biomasa y los nódulos se colocaron en una estufa marca Binder (D-78532 Germany) a 40 °C hasta que se observó peso constante. El nitrógeno total se evaluó con base en el método Kjeldhal (^{AOAC, 1990}). El contenido de clorofila (CL) se determinó como el promedio de tres lecturas en la lámina foliar de cada contenedor y se utilizó un medidor portátil Konica Minolta^® 502 Plus.

Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (ANOVA). En las variables con diferencias significativas se realizó la comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05). Los análisis de varianza y la prueba de medias se realizaron con el programa de cómputo SAS^® Ver. 9.4. Se realizó un análisis de componentes principales con el programa Past3exe. Además, se obtuvieron índices de eficiencia de las cepas para cada una de las variables (IEVi) que resultaron con diferencias significativas. Con los valores de NN y PSN se estimó el índice de eficiencia en nodulación (IEN) y con las variables PSV, PSR y NT se calculó el índice de eficiencia en fijación de nitrógeno (IEF). Asimismo, se obtuvo el índice de eficiencia general (IEG) para una cepa, considerando las cinco variables. Los índices expresan el porcentaje del valor per se de cada variable o de grupos de variables en relación al promedio respectivo; no hay unidades de medición y se pueden hacer comparaciones entre cepas y variables.

El índice de eficiencia para una cepa y para una variable (IEVi), se calculó utilizando la siguiente Ecuación 1:

Donde: IEVi = índice de eficiencia de una cepa para la variable i; Vi = valor de la variable i de una cepa; X-vi = promedio de la variable i de todas las cepas.

El índice de eficiencia para más de una variable (IE), se obtuvo con la Ecuación 2:

donde: IE = índice de eficiencia de una cepa para más de una variable; Vi = valor de la variable i; X-vi = promedio de la variable i de todas las cepas; n = número de variables consideradas.

Resultados y Discusión

Componentes principales

El análisis de componentes principales (CP) de las 27 cepas de Rhizobium y las ocho variables registradas, mostró que los tres primeros explicaron 62.22% de la varianza total, donde el CP1 aportó 27.83% y el CP2 contribuyó con 18.45%. El análisis gráfico de los valores del CP1 y CP2 de mayor contribución a la varianza total, se muestra en la Figura 1. Al observar los valores del CP1, las cepas se separaron en dos conglomerados principales; del lado negativo y con menor valor en la escala, se ubicaron todas las cepas procedentes de la forma silvestre de frijol, excepto la número 3 (Rhizojal VC3) y número 8 (Rhizojal SA2) situadas del lado positivo; del lado positivo se ubicó la mayoría de los rizobios colectados en raíces de frijol cultivado, excepto los identificados con los números 10, 13, 14 y 25.

Figura 1:  Ubicación de las 27 cepas y comportamiento de los vectores-variable con base en el análisis de componentes principales (CP) de ocho variables cuantitativas de Rhizobium. 

Figure 1:  Location of the 27 strains and behavior of the vector-variables based on the principal component analysis (PC) of eight quantitative variables of Rhizobium. 

Las variables asociadas de forma importante al CP1 fueron PSV y PSN; variables asociadas al CP2, fueron NN y PSR. En la Figura 1 y del lado positivo del CP1, se observa un grupo de vectores-variable conformado por LR, CL, PSV, NT y PSN, por el ángulo agudo formado por sus líneas, se puede afirmar que muestran correlación positiva alta. La figura muestra también que las variables NN, PSN y PSV estuvieron bien representadas, NT y LR mal representadas y que la variable LV fue poco relevante en este estudio.

Conclusiones

Los resultados mostraron diferencias significativas entre las 27 cepas de Rhizobium spp. en seis de las ocho variables registradas para evaluar la fijación biológica de nitrógeno. Los índices de eficiencia por variable y por grupos de variables, también mostraron diferencias entre las cepas evaluadas. El componente principal 1 separó a la mayoría de los rhizobios en dos grupos; del lado negativo se ubicaron las cepas de frijol silvestre y del lado positivo las de frijol cultivado. Los resultados mostraron evidencia de mayor eficiencia general en FBN, de las cepas obtenidas en frijol cultivado. Las cepas seleccionadas por su valor per se en las variables de efectos significativos y por índices de eficiencia en la fijación biológica del nitrógeno, fueron Rhizojal VC3 de frijol silvestre y Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2 de frijoles cultivados. Los índices de eficiencia por variable y por grupos de variables, mostraron ser útiles en la evaluación e identificación de cepas de Rhizobium eficientes en fijación biológica del nitrógeno. Los resultados sugieren que existe potencial para identificar cepas de Rhizobium eficientes en la FBN para su uso en el frijol cultivado, en la región occidente de México.

Declaración de Ética

No aplicable.

Consentimiento para Publicación

No aplicable.

Disponibilidad de Datos

Los conjuntos de datos utilizados o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Fondos

La investigación fue financiada con fondos internos institucionales de la Universidad de Guadalajara.

Contribución de los Autores

Conceptualización: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Eduardo López-Alcocer, José de Jesús López-Alcocer. Metodología: José de Jesús López-Alcocer, Eduardo López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Software: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Validación: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte, Ramón Rodríguez-Macías, Eduardo López-Alcocer. Análisis formal: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Investigación: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Recursos, Curación de datos: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Preparación del borrador original: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Revisión y edición: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte, Ramón Rodríguez-Macías, Eduardo López-Alcocer. Visualización: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte. Supervisión: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte. Administración del proyecto: Rogelio Lépiz-Ildefonso. Adquisición de fondos: Rogelio Lépiz-Ildefonso.