Levaduras

Se ensayaron 16 levaduras que presentaron actividad antifúngica frente a B. cinerea (^{Nally et al., 2018}). Estas levaduras pertenecen a las especies S. cerevisiae (BSc15, BSc16, BSc31, BSc47, BSc49, BSc56, BSc61, BSc64, BSc68, BSc81, BSc92, BSc121, BSc140, BSc175, BSc203) y S. pombe (BSch67). Se aislaron de mostos de uva en fermentación de bodegas de la provincia de San Juan, Argentina y se identificaron a nivel molecular (^{Nally et al., 2012}). Estos microorganismos pertenecen al cepario del Instituto de Biotecnología-FI-UNSJ- San Juan. Argentina.

Las levaduras se inocularon en frascos Erlenmeyer de 150 mL de capacidad con 25 mL de medio líquido YEPD (extracto de levadura 10 g L^-1, peptona 20 g L^-1 y dextrosa 20 g L^-1) y se colocaron en agitación (250 rpm) durante 8-12 h a 25 (C, hasta fase exponencial. A partir de cultivos activos de levaduras se realizaron conteos de células de levaduras en cámara de Neubauer, se centrifugaron y posteriormente se realizaron diluciones con agua destilada estéril hasta obtener una concentración final de 10⁶ cel mL^-1.

Evaluación del efecto de las levaduras sobre la germinación de semillas de lechuga y crecimiento de la plántula emergente en bandejas de plástico

Se evaluó la germinación de semillas según las reglas de análisis de semillas de “International Seed Testing Association” (^{ISTA, 2017}). Las semillas de lechuga se esterilizaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 10 min y luego se lavaron dos veces con agua destilada estéril. Las semillas desinfectadas se colocaron sobre papel humedecido con 6 mL de agua destilada estéril en cajas de plástico con tapa. Posteriormente las levaduras fueron inoculadas puntualmente (10µL, 10⁶ cel mL^-1) sobre cada semilla. Las cajas se incubaron en cámara de crecimiento vegetal a 20 (C con alternancia de luz (12 h de luz/12 h de oscuridad) y 90% humedad relativa. Se consideró una semilla germinada cuando el largo de la radícula alcanzó más de 3mm. Se evaluó la capacidad germinativa de 400 semillas por tratamiento (8 bandejas plásticas con 50 semillas cada una) a los 4 y 7 días de haber comenzado el ensayo mediante la siguiente Ecuación 1 (^{ISTA, 2017}):

Control. Semillas inoculadas solo con agua destilada estéril (20µL) e incubadas en las mismas condiciones anteriormente mencionadas.

A 4 y 7 días de haber comenzado el ensayo se tomaron mediciones con un calibre digital en las plántulas emergentes tratadas con y sin levaduras (longitud en cm de la radícula, hipocótilo y cotiledones). La medida de alargamiento de la radícula se consideró desde el nudo (región de transición más gruesa entre la radícula y el hipocótilo) hasta el vértice de la radícula. Se realizaron tres réplicas por tratamiento (cada réplica conformada por 400 semillas). En la Figura 1 se muestra cómo crecen las plántulas de lechugas sobre papel humedecido con agua destilada estéril en bandejas plásticas durante 7 días a 20 °C, con fotoperiodo pre establecido.

Figura 1: Plántulas de lechuga de 7 días de crecimiento previamente inoculadas en forma puntual con levaduras, incubada a 20 °C con alternancia de luz (12 h luz/12 h oscuridad) y 90% humedad relativa. 

Figure 1: Lettuce seedlings of 7 days of growth previously inoculated punctually with yeasts, incubated at 20 °C with alternating light (12 h light/12 h dark) and 90% relative humidity. 

Índice de vigor (IV)

El índice del vigor (IV) de las semillas tratadas con y sin levaduras (ITEM 2) se calculó a los 7 días mediante la siguiente Ecuación 2 (^{Amprayn et al., 2012}):

Análisis estadístico

Los resultados que cumplieron con los supuestos de normalidad, homogeneidad de la varianza e independencia se sometieron a un análisis de la varianza (ANOVA) unifactorial, con diseño completamente al azar (^{InfoStat, 2018}). La prueba de separación de medias se realizó a posteriori por el test de Tukey, con un nivel de significancia de P < 0.05. Los resultados que no se ajustaron a los supuestos del ANOVA fueron sometidos a un análisis de la varianza no paramétrica con la prueba de Kruskal Wallis (^{InfoStat, 2018}).

Evaluación del efecto de las levaduras vitivinícolas sobre la germinación de semillas y crecimiento de las plántulas emergentes de lechuga in vitro

A los cuatro días de haber iniciado el ensayo de germinación de las semillas de lechuga sobre papel húmedo, los simientes inoculados con las levaduras S. cerevisiae BSc92, BSc121, BSc203 y Sch. pombe BSchp67 mostraron un porcentaje de germinación significativamente mayor en relación al control (P < 0.0001) (Cuadro 1). Las semillas inoculadas con las levaduras BSc16, BSc49, BSc64 y BSc68 evidenciaron una tasa germinativa (entre 86.09 y 94.06%) significativamente inferior en relación al control (96.03%). Las demás levaduras ensayadas no aumentaron o disminuyeron la tasa de germinación (Cuadro 1). A los siete días se observó que las semillas inoculadas con las levaduras BSc5, BSc16, BSc61, BSc64, BSchp67, BSc68, BSc92, BSc121 y BSc203 mostraron valores de 100% de germinación, los cuales fueron significativamente superiores al control (P < 0.0001) (Cuadro 2). Las semillas inoculadas con las levaduras restantes no mostraron diferencias significativas en relación al control (Cuadro 2).

Un método simple para la detección de microorganismos fitotóxicos o promotores de crecimiento consiste en la inoculación de estos organismos sobre semillas (^{Kremer et al., 2006}; ^{Carvalho et al., 2007}). Existen investigaciones que reportan los efectos de cultivos microbianos sobre la germinación de semillas. ^{Reyes et al. (2008)} reportaron que semillas de maíz (Zea mays L.), que habían sido previamente embebidas en una solución con Azospirillum sp. (10⁸ cel mL^-1) e incubadas durante 5 días, presentaron mayor cantidad de semillas germinadas en relación al control, utilizando como sustrato agar-agua al 8%. ^{Blanco et al. (2018)} determinaron que semillas de pimiento (Capsicum annuum L.), que habían sido previamente embebidas en los aislados rizobianos RmBorbollón (Ochrobactrum sp.) y ME01 (Ochrobactrum sp.), mostraron un incremento significativo en la tasa de germinación con respecto al control, en similares condiciones a las ensayadas en este trabajo (cuatro días de ensayo sobre papel humedecido). Posteriormente, al séptimo día observaron un aumento significativo del porciento de semillas germinadas (entre un 1.74 y 2.03%) en las semillas inoculadas con las cepas Alf (Pseudomonas sp.), ME01 (Ochrobactrum sp.), Leu2A y Med (Bradyrhizobium sp.), en relación al control. Estos resultados son comparables con los obtenidos en el presente trabajo debido que a los 4 días de haber comenzado el ensayo las semillas de lechugas, inoculadas previamente con levaduras Sch. pombe (BSchp67) y S. cerevisiae (BSc92, BSc121 y BSc203), incrementaron significativamente su tasa germinativa en relación al control (Cuadro 1). Posteriormente, a los 7 días, las levaduras anteriormente mencionadas y otras levaduras como S. cerevisiae BSc5, BSc16, BSc61, BSc64, BSc68, BSc92, aumentaron el porcentaje de semillas germinadas (100% de semillas germinadas) con respecto al control (Cuadro 2). ^{Bab’eva y Belyanin (1966)} también reportaron que la germinación de semillas de repollo (Brassica oleracea var. capitata L.) se incrementó cuando las mismas se inocularon levaduras pertenecientes a la especie Torulopsis sp. Algunos autores relacionan el aumento de la germinación de semillas con la presencia de giberelinas, ya que esta fitohormona induce la hidrólisis del almidón y otras moléculas provocando la liberación de solutos (monómeros), los cuales son absorbidos por el escutelo y transportados al embrión, permitiendo el desarrollo del mismo (^{Matilla, 2008}). Algunos autores mencionaron que levaduras pertenecientes a las especies Candida valida, Rhodotorula glutinis y Trichosporon asahii produjeron giberelinas (^{El‑Tarabily, 2004}). Se ha informado que S. cerevisiae es capaz de sintetizar dicha fitohormona bajo condiciones in vitro (^{Tawfiq et al., 2018}).

El efecto de las levaduras sobre la longitud de la radícula emergente fue variable. A los 4 días las semillas que fueron inoculadas con las levaduras BSc31, BSc49 y BSc56 presentaron radículas con longitudes similares a la del control (P > 0.05) (Cuadro 1). La aplicación de las levaduras restantes provocó una disminución significativa en la longitud de las mismas entre un 26.14 y 64.7% (P < 0.0001) (Cuadro 1). Luego, a los 7 días se observó que la longitud de las radículas, en las plántulas que previamente fueron inoculadas con las levaduras BSc5, BSc47, BSc49, BSc56, BSc68 y BSc92, no varió en forma significativa respecto del control (P > 0.05) (Cuadro 2). Las demás levaduras ensayadas disminuyeron significativamente el largo de la radícula de las plántulas emergentes entre 41.09 y 66.43% en relación al control (P < 0.0001) (Cuadro 2). Ninguna de las levaduras incrementó la longitud de la radícula, a los 4 y 7 días (Cuadros 1 y 2).

Con respecto a la longitud del hipocótilo, a los 4 días, las semillas previamente inoculadas con BSc5, BSc61 y BSc140 no mostraron diferencias significativas en comparación al control. Las demás levaduras provocaron una reducción significativa en la longitud de los mismos entre un 20.12 y 37.19% (P < 0.0001) (Cuadro 1). A los 7 días se evidenció que las plántulas que fueron previamente inoculadas con las levaduras S. cerevisiae (BSc16, BSc31, BSc49, BSc56, BSc61, BSc92, BSc121, BSc140, BSc175, BSc203) y Sch. pombe BSchp67 incrementaron significativamente la longitud del hipocótilo entre un 50 y 104% en comparación con el control (P < 0.0001). Las levaduras restantes no afectaron en forma significativa el crecimiento del hipocótilo (Cuadro 2).

En cuanto a la longitud de los cotiledones, las mediciones a los 4 días indicaron que las levaduras ensayadas disminuyeron significativamente la longitud de los cotiledones entre un 37.19 y 20.12% con respecto al control (P < 0.001), excepto en las plántulas que fueron pre-inoculadas con BSc5, BSc61, BSc140. Los cotiledones de estas plántulas presentaron largo similar al del control (Cuadro 1). Posteriormente, a los 7 días, solo el lote de semillas que fue pre-inoculado con la levadura BSc140 presentó diferencias significativas en comparación con el control (P = 0.0301), mostrando un aumento en la longitud de los cotiledones en un 17.02% (Cuadro 2).

Índice de vigor (IV)

Los índices de vigor de las semillas inoculadas con las levaduras vitivinícolas fueron similares a los del control, excepto las plántulas que fueron tratadas con la levadura BSc81, la cual tuvo un IV significativamente menor en relación al control (P < 0.001) (Cuadro 2).

La evaluación del efecto de las levaduras sobre la elongación de la radícula y del hipocótilo en las plántulas, además de evaluar el porcentaje de semillas germinadas, permite ponderar la acción de compuestos producidos por microorganismos (lectinas, etileno, auxinas, citoquininas, giberelinas, poliaminas, sideróforos, etc.) presentes en niveles de concentración bajos que no son suficientes para inhibir o promover la germinación, pero que sin embargo pueden estimular o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocótilo, dependiendo del modo y sitio de acción del compuesto. De esta manera, la promoción o inhibición en la elongación de la radícula e hipocótilo constituyen indicadores muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación (^{Sobrero y Ronco, 2004}). La promoción del crecimiento de la radícula y del hipocótilo en los primeros estadios del crecimiento podría conferirle una ventaja a la plántula en una etapa crítica de su desarrollo (^{Noel et al., 1996}). ^{Cassán et al. (2009)} reportaron que semillas de soja (Glycine max L.) y maíz (Z. mays L.), pre-inoculadas puntualmente con Azospirillum brasilense y Bradyrhizobium japonicum, mostraron un incremento significativo en la tasa de germinación y en el crecimiento de la radícula e hipocótilo a los 7 y 8 días de haber comenzado el ensayo (sustrato papel humedecido). Por otra parte, ^{Carrillo-Sosa et al. (2017)} informaron que la imbibición de semillas de tomate (S. lycopersicum L.) en una dilución de 5 mL L^-1 del bioproducto LEBAME^®, el cual está compuesto por una combinación de Bacillus subtillis, Lactobacillus bulgaricum y S. cerevisiae, estimuló significativamente la elongación de la radícula y del hipocótilo un 21 y 32%, respectivamente, en comparación con el control utilizando como sustrato papel de filtro humedecido. Estos reportes coinciden parcialmente con los resultados obtenidos en este ensayo debido a que las levaduras S. cerevisiae (BSc16, BSc61, BSc92, BSc121, BSc203) y S. pombe (BSchp67) solo incrementaron significativamente la longitud del hipocótilo en las plántulas emergentes de lechuga (Cuadro 2) y no así la longitud de la radícula emergente. El aumento en la longitud del hipocótilo observado en el presente trabajo puede deberse a la producción de auxinas (^{Garay-Arroyo et al., 2014}). Existen reportes de que algunas cepas de S. cerevisiae poseen la capacidad de sintetizar esta hormona, aún en ausencia de su precursor triptófano (^{Rao et al., 2010}; ^{Liu et al., 2016}).

En cuanto a la longitud de los cotiledones, las mediciones indicaron que las plántulas pre-inoculadas con las levaduras BSc47, BSc49, BSc56, BSc61, BSc64, BSchp67, BSc81, BSc121 y BSc175 (a los 4 días) y con BSc140 (a los 7 días) presentaron cotiledones más largos que el control correspondiente (Cuadros 1 y 2). Este efecto podría deberse a la acción de citoquininas (CKs). Las citoquininas (CKs) promueven la elongación celular en los cotiledones y una aplicación exógena estimula una expansión celular adicional (^{Taiz y Zeiger, 2006}). Se ha reportado que S. cerevisiae es capaz de sintetizar dicha fitohormona bajo condiciones in vitro (^{Tawfiq et al., 2018}). Por otro lado, se ha demostrado que la aplicación exógena de citoquininas (CKs) inhibe la elongación celular de las raíces (^{Taiz y Zeiger, 2006}). Esto explicaría en cierto modo la inhibición del crecimiento radicular y el aumento del tamaño de los hipocótilo observado a los siete días en las plántulas que fueron previamente inoculadas con las levaduras BSc5, BSc61 y BSc140 (Cuadro 2).

El vigor de la semilla determina el rendimiento potencial de un cultivo/planta después de la siembra. Existen varias técnicas para determinar su evaluación, una de ellas es la prueba basada en el crecimiento de plántulas, en las cuales se incluyen el recuento de semillas germinadas, el crecimiento de las plántulas, entre otros (^{Marcos-Filho, 2015}). Estas mediciones también se utilizan para detectar posibles efectos fitotóxicos de sustancias químicas como fungicidas, insecticidas y desecantes en plantas, los cuales pueden afectar el crecimiento normal de la raíz y del hipocótilo (^{Marcos-Filho, 2015}). ^{Gholami et al. (2009)} determinaron a los siete días que las semillas de maíz (Z. mays L.), que habían sido previamente embebidas en soluciones con aislamientos pertenecientes a las especies Pseudomonas putida y A. brasilense, mostraron un aumento significativo en el índice de vigor de un 94 y 117%, respectivamente, en comparación con el control, sobre papel humedecido. Resultados similares fueron reportados por ^{Suliasih y Widawati (2017)} donde la imbibición de semillas de sorgo (Sorghum bicolor L.), con tres cultivos bacterianos por separado (Bacillus sp., Azotobacter sp. y Azospirillum sp.), produjo a los 7 días aumentos significativos en los índices de vigor entre un 11 y 44.4% en relación al control. Es importante destacar que, a diferencia del uso de bacterias, existen escasas investigaciones donde se evalúe el efecto de levaduras sobre el vigor de semillas. ^{Amprayn et al. (2012)} reportaron que la imbibición de semillas de arroz (O. sativa L.), en una suspensión que contenía la levadura Candida tropicalis, incrementó un 50% el índice de vigor con respecto al control (7 días de incubación, sustrato agar-agua). En el presente trabajo, las semillas pre- inoculadas con 15 de las 16 levaduras ensayadas presentaron índices de vigor similar al del control (Cuadro 2), es decir que el rendimiento potencial de las plántulas no se vería afectado negativamente.