Introducción

Las plantas requieren nitrógeno en grandes cantidades porque este elemento es un componente esencial de las proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares (^{Shridhar, 2012}). La elevada cantidad de nitrógeno en la atmósfera terrestre (cerca de 80% en la forma de N₂ gaseoso) no puede utilizarse de manera directa por los sistemas biológicos en la producción de los compuestos químicos necesarios para su crecimiento y reproducción (^{Shin et al., 2016}). La reducción de N₂, comúnmente conocida como “fijación de nitrógeno” se lleva a cabo química o biológicamente (^{Shin et al., 2016}). La fijación biológica de nitrógeno (FBN) es uno de los procesos más importantes que provee la mayor fuente externa de N para los diferentes ecosistemas y agroecosistemas, lo que constituye una opción importante para la recuperación y mantenimiento de la fertilidad edáfica (^{Figueiredo et al., 2013}). Algunas de las bacterias que viven en el suelo se denominan de vida libre porque no dependen de los exudados de la raíz de la planta para su supervivencia (^{Sharma et al., 2014}). Los microorganismos que llevan a cabo la FBN son un grupo limitado de bacterias simbióticas y de vida libre denominadas diazótrofas que tienen la capacidad de reducir y transformar el nitrógeno atmosférico (N₂) a amonio (NH₄ ⁺), una forma de nitrógeno asimilable para las plantas (^{Bano e Iqbal, 2016}). Entre las bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre (BFNVL) se pueden encontrar algunas anaeróbicas obligadas o facultativas como Azospirillum sp., Clostridium pasteurianum, Klebsiella spp., Desulfovibrio sp.; otras aeróbicas obligadas como Azotobacter spp., Beijerinckia sp. y fotosintéticas como las bacterias púrpuras sulfurosas y no sulfurosas y bacterias verdes sulfurosas (^{Allan y Graham, 2002}). Algunas BFNVL pueden promover el crecimiento de las plantas mediante la síntesis y la liberación de fitohormonas como auxinas, giberelinas, citocininas y ácido abscísico (^{Hernández-Rodríguez et al., 2014}). Algunas cepas de Azotobacter, por ejemplo, tienen la capacidad de producir aminoácidos que promueven el crecimiento vegetal, también son capaces de producir sideróforos, los cuales pueden proporcionar hierro a las plantas (^{Jnawali et al., 2015}). Resultados de estudios previos sobre la incorporación a los suelos de BFNVL han mostrado altos rendimientos en una gran diversidad de cultivos, como arroz, maíz, frijol y tomate, minimizando el uso de fertilizantes químicos, especialmente los nitrogenados (^{Hernández, 1998}; ^{Bonilla et al., 2000}; ^{Meunchang et al., 2005}). Hay reportes que muestran que la inoculación con Azospirillum lipoferum en plantas de arroz bajo condiciones de invernadero aumentó el rendimiento por arriba de 6.7 g planta^-1 (^{Mirza et al., 2000}). La altura y la biomasa seca de plantas de algodón incrementaron con la inoculación con Azospirillum brasiliense bajo condiciones de invernadero (^{Bashan, 1998}).

En México, los agaves han tenido y tienen una gran importancia económica y cultural para numerosos pueblos indígenas y mestizos, que los han aprovechado desde hace 7000 años como fuente de alimento, medicina, combustible, cobijo, ornato, ixtle, abono, construcción de viviendas, elaboración de implementos agrícolas y principalmente en la producción de diferentes tipos de bebidas alcohólicas como el mezcal y el tequila (^{García-Mendoza, 2007}). Estudios recientes indican que los agaves también tienen un alto potencial para la fijación de carbono (^{García-Moya et al., 2010}; ^{Núñez et al., 2010}). En el estado de Oaxaca se utilizan alrededor de nueve especies de agave de las cuales Agave angustifolia Haw. es la de mayor demanda y la única que se cultiva de forma significativa en suelos semiáridos, aproximadamente 8422.7 ha se encuentran cultivadas con este agave (^{OEIDRUS-SAGARPA, 2011}). Las otras ocho especies de agave son colectadas de poblaciones silvestres o semi-cultivadas principalmente en cercos vivos con poco o nulo manejo cultural. Tal es el caso del Agave potatorum Zucc., coloquialmente conocido como maguey papalomé o maguey tobalá, una especie de la cual se obtiene un mezcal muy demandado (^{Sánchez-López, 2005}) que se distingue por su alta calidad debido a la proporción de compuestos aromáticos volátiles que contiene (^{Vera et al., 2009}). En el año 2018 se produjeron a nivel nacional 5.9 millones de litros de mezcal. Oaxaca contribuyó con el 92.3% de esta producción, de la cual el 3.3% se elaboró con A. potatorum (^{CRM, 2019}). Este agave se desarrolla en suelos áridos y semiáridos poco fértiles, se estima que hay 42 ha de dicha especie en las regiones de Valles Centrales y Sierra Sur de Oaxaca, lo cual representa 0.45% del total de plantas del género Agave existentes en el estado (^{OEIDRUS-SAGARPA, 2011}). Al ser una especie silvestre, no existe mucha información referente a su manejo agronómico, por lo que es necesario realizar investigación en diferentes aspectos incluyendo su nutrición, dentro de un contexto agroecológico. El análisis de azúcares en los tallos o “piñas” (tallos sin hojas) de agave es importante porque el alcohol obtenido en la fermentación depende de la cantidad de azúcares reductores. En las tequileras y mezcaleras se practican dos tipos de análisis como la medición de grados Brix (°Bx) y la determinación de azúcares reductores empleando el reactivo de Fehling. Los °Brix representan una escala arbitraria para medir densidades de soluciones de azúcares y equivalen al porcentaje en peso de sólidos solubles de una muestra, que principalmente son azúcares. Por ejemplo, en A. tequilana las piñas deben tener al menos 24% de azúcares totales para que se consideren de buena calidad (^{Bautista-Justo et al., 2001}). En este estudio se evaluó el efecto de BFNVL en el crecimiento y contenido de sólidos solubles totales (SST) en plantas de A. potatorum bajo condiciones semi-controladas.

Materiales y Métodos

Se utilizaron tres cepas de BFNVL aisladas previamente de la rizósfera de A. angustifolia cultivado en el distrito de Tlacolula, Oaxaca, México en las comunidades de Magdalena Teitipac (16° 54´ N y 96° 33´ O), San Baltazar Guelavila (19° 80´ N y 96° 29´ O) y San Juan del Río (16° 53´ N y 96° 09´ O). Con base en el sistema Analytical Profile Index (API20 NE, bioMérieux, Inc., Durham, NC, USA) se confirmó la identidad de Burkholderia cepacia con características fenotípicas de bacterias gram negativas, colonias grandes de color blanco, bordes enteros, forma circular mucoide con pigmentación amarilla en su centro; Flavobacterium sp. bacterias gram negativas, colonias de color amarillo con bordes enteros, forma circular con pigmento excretado verdoso; y Paenibacillus amylolyticus bacterias gram positivas, colonias traslucidas con bordes enteros y forma circular. Estas BFNVL se seleccionaron por su alta eficiencia para fijar N atmosférico in vitro mediante la cuantificación del ion NH₄ ⁺. La capacidad diazótrofica obtenida fue de 1.10 µg N-NH₄ ⁺ mL^-1 para B. cepacia, 1.54 µg N-NH₄ ⁺ mL^-1 para Flavobacterium sp. y 1.68 µg N-NH₄ ⁺ mL^-1 para Paenibacillus amylolyticus.

Resultados y Discusión

El análisis de varianza y la prueba de comparación múltiple de medias (Tukey, P ≤ 0.05) revelaron que con respecto al control, B. cepacia incrementó 322.2% el VR, 42.6% el NHD y 72.9% los (Bx. P. amylolyticus incrementó 317.1% la BST (Figura 1). B. cepacia, Flavobacterium sp. y P. amylolyticus incrementaron aproximadamente 50.3% el DT (Figuras 1 y 5), 48.6% el DRO, 127.2% el AF y 51.8% la AP (Figuras 2 y 3). Flavobacterium sp. incrementó 164.8% la BT (Figura 2).

Letras minúsculas diferentes en cada barra indican el efecto del inoculante (Tukey, P ≤ 0.05).

Figura 1: Valor medio ± error estándar en algunas variables de crecimiento y contenido de sólidos solubles totales en el tallo o “piña” (tallo sin hojas) de plantas de Agave potatorum Zucc. inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en ambientes semi-controlados después de 48 semanas de evaluación.  

Letras minúsculas diferentes en cada barra indican el efecto del inoculante (Tukey, P ≤ 0.05).

Figura 2: Valor medio ± error estándar en algunas variables de crecimiento de plantas de Agave potatorum Zucc. inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en ambientes semi-controlados después de 48 semanas de evaluación. 

Divisiones en la escala = 1 mm.

Figura 3: Efecto de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en la altura de plantas de Agave potatorum Zucc. en ambientes semi-controlados después de 48 semanas de evaluación.  

La DR fue la única variable de crecimiento evaluada que no presentó cambios estadísticamente significativos entre las plantas inoculadas y el control. El incremento en las variables de crecimiento de las plantas de agave se puede atribuir a diversos mecanismos llevados a cabo por las BFNVL, las cuáles han sido reportadas previamente como promotoras del crecimiento vegetal (^{Requena et al., 1997}). Entre estos mecanismos se encuentran (1) un incremento en la elongación y multiplicación celular debido a una mejora en la absorción de nutrientes como N; (2) producción de fitohormonas, entre ellas auxinas, citocininas, giberelinas y ácido abscísico; (3) producción de sideróforos, los cuales pueden proporcionar hierro a las plantas; (4) síntesis de enzimas como la 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa, la cual disminuye los niveles de etileno en las plantas (^{Lucy et al., 2004}; ^{Podile y Kishore, 2006}; ^{Appanna, 2007}).

El VR (Figura 4), el NHD y el AF en las plantas de agave incrementó con la inoculación de B. cepacia. Resultados que coinciden con los establecidos por ^{Argüello-Navarro y Moreno-Rozo (2014)}. Estos autores inocularon plantas de cacao con BFNVL, tales como Burkholderia sp. y después de 120 días de evaluación en vivero encontraron incrementos en el número de hojas, AF, BT y longitud de la raíz en las plantas inoculadas con relación al control. Similarmente, ^{Roesch et al. (2005)} evaluaron el efecto de la inoculación de bacterias diazotrófas del género Azospirillum en trigo y observaron un incremento en el tamaño y número de pelos radiculares en comparación con el control. Numerosos estudios han mostrado que las bacterias diazótrofas pueden promover el crecimiento vegetal, principalmente al cambiar la morfología del sistema radicular, mejorando el desarrollo y la productividad de varios cultivos de interés económico (^{Bashan et al., 2004}; ^{Somers et al., 2004}).

Divisiones en la escala = 1 mm.

Figura 4: Efecto de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en el volumen radicular de Agave potatorum Zucc. en ambientes semi-controlados después de 48 semanas de evaluación.  

Figura 5: Efecto de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en el diámetro del tallo o “piña” (tallo sin hojas) de Agave potatorum Zucc. en ambientes semi-controlados después de 48 semanas de evaluación. Divisiones en la escala = 1 mm. 

Flavobacterium sp. incrementó la BT de las plantas de agave, otros estudios también han reportado que la inoculación con BFNVL como Herbaspirillum seropedicae en plantas de arroz incrementó la BT en 71.5% con respecto al control. Bajo condiciones de cultivo en maceta, bacterias del género Paenibacillus sp. RFNB4 aumentaron significativamente la AP y la BT de plantas de canola (Brassica campestris) en 42.3 y 29.5%, respectivamente (^{Islam et al., 2009}). ^{Kifle y Laing (2016)} encontraron que la inoculación con bacterias diazótrofas de los géneros Bacillus, Pseudomonas y Enterobacter en plantas de maíz bajo condiciones de invernadero incrementó la BT en comparación con las plantas no inoculadas. ^{Govindarajan et al. (2006)} evaluaron la inoculación con Burkholderia vietnamiensis MG43 en las variedades Co 86032 y Co 86027 de caña de azúcar micropropagada y encontraron incrementos de 20 y 19% en la producción de materia seca de Co 86032 y Co 86027, respectivamente.

Algunos autores han reportado que cuando las plantas establecen asociaciones con los hongos endófitos o con las BFNVL su contenido de azúcar y desarrollo aumenta (^{Obledo et al., 2003}; ^{Ruiz et al., 2011}). ^{De la Torre-Ruiz et al. (2016)} inocularon plantas de Agave americana con Rhizobium daejeonense, Acinetobacter calcoaceticus y Pseudomonas mosselii y encontraron efectos positivos en la BT, DT, número de hojas, longitud de la raíz y contenido de azúcar en las piñas en comparación con las plantas de agave no inoculadas. Estos resultados concuerdan con lo reportado en este estudio donde la inoculación con B. cepacia aumentó el SST (Bx en las piñas de las plantas de agave. Los (Brix equivalen al porcentaje en peso de sólidos solubles de una muestra, que principalmente son azúcares (^{Bautista-Justo et al., 2001}). El contenido de azúcares en las plantas de agave también puede variar con la etapa fisiológica de la planta (^{Arrizon et al., 2010}). Las plantas jóvenes de A. tequilana, por ejemplo, poseen niveles más altos de monosacáridos (p. ej. glucosa, fructosa) que las plantas adultas, las cuales acumulan fructanos a partir de los 8-10 años de edad (^{Cedeño, 1995}).

Conclusiones

La inoculación con bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre en plantas de Agave potatorum tuvo un efecto positivo en 90% de las variables de crecimiento evaluadas. Burkholderia cepacia incrementó 322.2% el volumen radicular, 42.6% el número de hojas desplegadas y 72.9% los (Brix. Paenibacillus amylolyticus incrementó 317.1% la biomasa seca del tallo. B. cepacia, Flavobacterium sp. y P. amylolyticus incrementaron aproximadamente 50.3% el diámetro del tallo, 48.6% el diámetro de roseta, 127.2% el área foliar y 51.8% la altura de la planta. Flavobacterium sp. incrementó 164.8% la biomasa total. Resultados que sugieren que estas bacterias son capaces de promover el crecimiento de A. potatorum, por lo que pueden ser una tecnología ambientalmente amigable y económica para la producción de este agave en el estado de Oaxaca, México y en otros sitios con condiciones similares de manejo.