Introducción

La minería ha generado sitios altamente contaminados con metales pesados y metaloides, ocasionando que dicha actividad sea un problema ambiental con deterioro del suelo, contaminación de aire y agua, e impacto negativo en la diversidad y riqueza de plantas, insectos y vertebrados. La diversidad y abundancia microbiana en el suelo, y en la rizosfera de las plantas que sobreviven en esos sitios, también se deteriora (^{Tchounwou et al., 2012}; ^{Román-Ponce et al., 2016}). La persistencia de los metales en el ambiente, causa efectos adversos a los ecosistemas, y la restauración ambiental, aún es muy costosa (^{Mosa et al., 2016}). Una estrategia compatible con el ambiente es la biorremediación, la cual consiste en emplear organismos eucariotas o procariotas para restaurar áreas contaminadas. Diversos estudios con microorganismos metalotolerantes han demostrado remover, estabilizar o desintoxicar de una manera eficiente y menos costosa los sitios mineros abandonados (^{O'Brien y Buckling, 2015}).

Los microorganismos, entre ellos las bacterias, han desarrollado la capacidad de sobrevivir en ambientes contaminados debido a su exposición constante a los compuestos tóxicos. Dentro de estas capacidades se incluyen la biosorción, bioacumulación y biotransformación de metales y metaloides, habilidades que pueden ser empleadas para la biorremediación ex situ o in situ de zonas perturbadas por las actividades de la minería. A la fecha, se han descrito géneros bacterianos capaces de tolerar, bioacumular y biotransformar metales pesados; de los que sobresalen Bacillus sp., Pseudomonas sp., Actinomyces sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Thiobacillus sp., Rhodobacter sp., Agrobacterium sp., Acidiothiobacillus sp., entre otros (^{Costa y Duta, 2001}; ^{Hassan et al., 2008}; ^{El Baz et al., 2015}).

Los jales El Fraile, Guerrero, México, están en la zona minera de Taxco, Guerrero, al sur de la Ciudad de México, tienen alrededor de 50 años a la intemperie, contienen residuos portadores de elementos potencialmente tóxicos (EPT) como As³⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Tl²⁺, Hg²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cr⁶⁺, V²⁺ y Zn²⁺. Con volumen aproximado de 5.5 millones de toneladas de EPT, la peligrosidad de estos en el ambiente, está dada por la capacidad de generar lixiviados o drenaje ácido de mina (DAM), debido a la oxidación de la pirita que origina aguas ácidas con concentraciones altas de sulfatos, metales y metaloides en forma de iones disueltos que desembocan en el río Cacalotenango (^{Corrales-Pérez y Martín-Romero, 2013}). ^{Talavera-Mendoza et al. (2006)} cuantificaron en agua y lixiviados los contenidos de metales: SO₄ ^2- (280-29 500 mg L^-1), As (<0.01-12.0 mg L^-1), Fe (0.025-2352 mg L^-1), Mn (0.1-732 mg L^-1), Zn (<0.025-1465 mg L^-1) y Pb (<0.01-0.351 mg L^-1). El contenido de metales solubles en los jales son muy heterogéneos y se liberan: Cd²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, y su acumulación en el suelo ha generado riesgo para los individuos que viven en las cercanías. ^{Toribio-Jiménez et al. (2014)} aislaron cepas de El Fraile tolerantes a Cd²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, y As³⁺, las cuales las identificaron como Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., y Bacillus sp. Las bacterias con capacidad de bioacumular y biotransformar metales pesados y metaloides, son la base para el establecimiento de nuevas alternativas de biorremediación. La hipótesis del presente estudio señala que las bacterias presentes en los alrededores de los jales El Fraile han desarrollado mecanismos de adaptación para sobrevivir en presencia de metales pesados y metaloides; capacidades que se pueden aprovechar para diseñar estrategias de biorremediación de zonas mineras. El objetivo del trabajo se centró en aislar e identificar bacterias capaces de bioacumular Ag, Cd, Cr, Pb y Zn y biotransformar Cr⁶⁺ a Cr³⁺, As⁵⁺ a As³⁺ o As³⁺ a As⁵⁺, estás fueron obtenidas a partir de muestras de suelo, agua, lixiviados, rizosfera, y tallos de algunas especies de plantas silvestres.

Materiales y métodos

Aislamiento de bacterias nativas. Se realizó un estudio observacional descriptivo a partir de 125 muestras (25 por cada matriz ambiental) tomadas de diferentes ambientes; suelo, agua, lixiviados, rizosfera, y tallos de plantas silvestres de los alrededores de los jales El Fraile, Taxco de Alarcón, en Guerrero. Las muestras de suelo se tomaron a una distancia aproximadamente de 50 m de los jales, el agua fue tomada del caudal del río Cacalotenango donde descargan los lixiviados de los jales, los lixiviados fueron tomados de las pozas que había, formadas sobre los jales; en cuanto a la raíz y tejido de las plantas se tomaron 4 especímenes de cada una en las que destacan; Acacia farnesiana, Hypericum perforatum, Paspalum sp., Pityrogramma sp., Prosopis laevigata, Lysiloma sp., según especies reportadas por ^{Gómez-Bernal et al. (2010)}. Todas las muestras se transportaron, en bolsas plásticas o frascos estériles al laboratorio. Para el aislamiento de bacterias se tomó 1 g o 1 mL, de cada muestra, y se prepararon diluciones de 10^-1 a 10^-6, se inocularon 100 µL de la última dilución en agar LB por triplicado, se incubaron a 30 ºC por 24 - 48 h, las colonias fueron seleccionadas con base a sus características macro y microscópicas (^{Yu et al., 2014}). Todos los experimentos se hicieron por triplicado y se expresaron en UFC mL^-1 o g de muestra.

Determinación de la CMI a metales pesados y metaloides. En cajas de agar LB se adicionaron sales metálicas; Pb (NO₃)₂, Zn (NO₃)₂, Cd (NO₃)₂, Cu (NO₃)₂, NaAsO₂, y NaH₂AsO₄, AgNO₃, en concentraciones de ascendentes que van de 0.5 a 20 mM. La CMI se interpretó como la concentración más alta de sales en la cual no se observó crecimiento después de 7 días de exposición (^{Yu et al., 2014}; ^{Román-Ponce et al., 2016}).

Detección de la capacidad de bioacumular metales. Todas las cepas se inocularon en agar LB a la concentración entre 0.5 a 20 mM dependiendo de la sal metálica siguiendo el protocolo e interpretación. Posteriormente, solo se seleccionó una cepa para confirmar la bioacumulación de Pb, Cr y Cd, por microscopia electrónica de transmisión (JOEL JEM-1010 TEM) en el Instituto de Biotecnología de la UNAM (^{Guerrero-Jiménez et al., 2013}; ^{Castellanos-Mendoza et al., 2014}).

Biotransformación de arsénico y cromo. Para la detección de bacterias biotransformadoras de arsénico; se inocularon en caldo LB durante 120 h a 29 ºC, se centrifugaron a 3400 rpm durante 30 min, se lavaron con SSI estéril y se resuspendieron en 2 mL de la misma solución. Se inoculó 1 mL de la suspensión en 5 mL de caldo LB adicionado con As³⁺ y As⁵⁺ incubado a 29 ºC por 120 h. En una microplaca se añadieron 150 µL del inóculo y 150 µL de AgNO₃ (0.1 M) a cada pocillo. Un resultado positivo se interpretó con base a la reacción del inóculo con AgNO₃ formándose una coloración amarilla en As⁵⁺ y café en As³⁺. Como control negativo se utilizó caldo LB con NaAsO₂ y NaH₂AsO₄ sin inocular (^{Simeonova et al., 2004}). En el caso de la biotransformación del cromo; las cepas bacterianas fueron inoculadas en caldo LB suplementado con Cr⁶⁺ durante 120 h a 29 ºC. Se agregó 1.5 mL de difenilcarbanizada, el Cr⁶⁺ contenido en cada sobrenadante se determinó mediante la medición de la absorbancia a 540 nm. El resultado positivo se interpretó con base a la concentración de Cr⁶⁺ en el tubo inoculado con cada una de las cepas y control negativo se utilizó caldo LB adicionado con Cr⁶⁺ sin inocular (^{Verma et al., 2009}).

Identificación molecular y filogenia de las bacterias metalotolerantes. El DNA de las cepas se extrajo de acuerdo al protocolo de ^{Arnold y Lutzoni (2007)}. Después, la amplificación se realizó por PCR del gene 16S ARNr, en un volumen final de 25 µL siguiendo el protocolo de ^{Weisburg et al. (1991)}. Los productos de PCR fueron limpiados, cuantificados, normalizados y secuenciados directamente (Applied Biosystems BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit) en la Universidad de Arizona (Genetics Core. Bidirectional sequencing was performed on an Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer) (Foster City, CA, USA) (^{Hoffman y Arnold, 2010}). El consenso de secuencias se realizó por ChromaSeq (^{Maddison y Maddison, 2005}), implementado en Mesquite v.2.6 (^{Maddison y Maddison, 2009}), los análisis f ilogenéticos se realizaron en MEGA v. 7.0, se agruparon en unidades taxonómicas operacionales (OTU) y se depositaron al GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Estadística. Los datos fueron analizados mediante ANOVA de una vía, comparando las medias mediante el método Holm-Sidak, Sigma Plot 11.0. El nivel de significancia fue con valor de P = 0.05. Los experimentos se realizaron con tres réplicas y tres repeticiones para cada uno.

Resultados y discusión

Aislamientos de cepas nativas. De los jales mineros El Fraile se aislaron 141 cepas basadas en las características macro y microscópica, aisladas de suelo, rizosfera, tallos, agua y lixiviados respectivamente (Figura 1, Cuadro 1). La diversidad bacteriana en los sitios está controlada por diversos factores bióticos y abióticos de cada hábitat que favorecen su establecimiento y crecimiento; por lo cual es favorecida en suelo y rizosfera por la disposición de nutrientes. Los géneros de Bacillus y Pseudomonas en suelo y rizosfera, se adaptan más fácilmente a los cambios de temperatura, pH y desecación entre otros, y la selección de resistencia a sustancias tóxicas que les permiten sobrevivir en sitios contaminados con metales, los cuales representan un sitio hostil para su crecimiento (^{Yu et al., 2014}). Así mismo, las asociaciones entre planta-microorganismo-suelo se dan por medio de interacciones químicas, donde las plantas atraen a diferentes poblaciones microbianas a su rizosfera para su colonización (^{Schlatter et al., 2015}). Mientras que en los tallos, agua y lixiviados representan un ambiente poco propicio para la colonización de bacterias, debido a la cantidad de nutrientes y al pH ácido en lixiviados. Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos en este estudio, donde el mayor número de cepas aisladas corresponden a suelo y rizosfera. ^{Román-Ponce et al. (2016)} evaluaron la interacción entre bacterias endófitas de plantas y la contaminación por As en Prosopis laevigata y Sphaeralcea angustifolia en sitios contaminados en San Luis Potosí, México, destacando seis aislamientos con tolerancia a As⁵⁺ y As³⁺, y concuerdan que la diversidad de las comunidades endófitas es afectada por las concentraciones y el tipo de metal asociado.

Figura 1 Sitios de muestreo en los jales El Fraile, a) agua, b) suelo, c) lixiviados y d) rizosfera. (fuente: LMM y BA). 

Figure 1  Sampling sites in mine tailings from El Fraile, a) water, b) soil, c) leachate, and d) rhizosphere.) 

Concentración mínima inhibitoria a metales pesados y metaloides. En la determinación de la CMI se observaron cambios en la morfología y pigmentación de las colonias en función a la exposición del metal (Figura 2), particularmente las cepas aisladas de agua, suelo y rizosfera presentaron cambios en presencia de Pb²⁺ y Zn²⁺; sin embargo, el mismo fenotipo se observó en S. aureus cuando fue expuesta a HgCl₂. La CMI para cada uno de los metales evaluados en las 141 cepas se presentan en el Cuadro 1. Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los de ^{Moraga et al. (2003)}, con respecto a Pseudomonas sp., y Alcaligenes sp., donde 100% de las cepas fueron tolerantes a Pb²⁺ y As³⁺, 77.7% a Cu²⁺ y 36.4% a Ni.

Figura 2 Ejemplos de los cambios de la morfología colonial de las cepas en presencia y ausencia de metales. a) Control (-) sin metal, b) Pb²⁺ y c) Zn²⁺. 

Figure 2 Examples of morphological changes of bacterial strains in the presence and absence of heavy metals. a) (-) control without metals, b) Pb²⁺ y c) Zn²⁺.) 

Los géneros de Acetobacter, Acinetobacter, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Methylococcus, Xanthomonas, Vibrio, Bacillus, Micrococcus, Planococcus, Staphylococcus, Streptomyces y Pseudomonas; también se describen como tolerantes a Cu²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺ y Zn²⁺ (^{Altalhi, 2009}; ^{Martínez et al., 2010}; ^{Heck et al., 2015}). Las bacterias aisladas de la rizosfera en las plantas silvestres de los jales El Fraile toleran mayores concentraciones de metales que las aisladas de los lixiviados y se debe a que los metales se encuentran disponibles por el pH ácido que presentan; algunos de estos géneros concuerdan con los reportados por ^{Toribio-Jiménez et al. (2014)} en los jales El Fraile tales como; Enterobacter, Klebsiella, Solibacterium. Los reportes anteriores sugieren que las bacterias pueden subsistir en ambientes diversos, perturbados por metales pesados y metaloides en diversas concentraciones y por ende han aprendido a tolerar su efecto con la finalidad de persistir como especie.

Capacidad de bioacumulación de metales pesados. La tolerancia a metales pesados está mediada por diferentes mecanismos celulares; entre ellos, la capacidad de expulsar, bioacumular y biotransformar los metales pesados y metaloides entre otros (^{Marrero-Coto et al., 2010}). Los genes de resistencia a As están codificados en dos operones (arsRDABC y arsRBC). El operón arsRDABC se ha descrito en plásmidos en E. coli R773 (^{Saltikov y Olson, 2002}), el operón arsRBC en cromosoma o plásmidos de S. aureus pI258 (^{Ji y Silver, 1992}). El arsR codifica para una proteína metaloreguladora (ArsR), y modula la sobreexpresión de arsR durante la bioacumulación del arsénico, arsB codifica para proteínas en la membrana plasmática que conforman bombas de expulsión, las cuales exportan al arsenito del citoplasma hacia el exterior de la célula, mientras arsC codifica proteínas que reducen el arsenato a arsenito (^{Yang et al., 2015}; ^{Andres y Bertin, 2016}).

Las bacterias presentes en los alrededores de los jales mineros El Fraile, se observa bioacumulación en 39% de Ag²⁺, 24% Pb²⁺ y 9% de Zn²⁺ respectivamente (Figura 3), esta capacidad se correlaciona a que estos metales están en mayor abundancia en el sitio en concentraciones para Ag²⁺ de 9.5-74.2 mg kg^-1, Pb²⁺ de 780.43-700 mg kg^-1 y Zn²⁺ de 380-10 000 mg kg^-1 según lo reportado por ^{Talavera-Mendoza et al. (2005)}. A diferencia de este estudio, ^{Costa y Duta (2001)} describen cepas de B. sphaericus, B. cereus y B. subtilis, bioacumuladoras de Cu²⁺, Zn²⁺, y Cd²⁺. En el estudio de ^{El Baz et al. (2015)} aislaron 59 cepas de actinobacterias en áreas de minas abandonadas, todas fueron capaces de bioacumular Pb²⁺. La sobrevivencia de las cepas en ambientes altamente tóxicos es posiblemente en gran medida a su capacidad de bioacumular y biotransformarlos. En este estudio logró identificar cepas de los géneros de Enterobacter (rizosfera), Stenotrophomonas y Acinetobacter (agua), capaces de bioacumular Ag²⁺ y Zn²⁺, y Staphylococcus solo bioacumula Ag²⁺ (rizosfera). De los géneros identificados solo se encontraron reportados para Enterobacter de biocumular Zn²⁺ (^{Marrero-Coto et al., 2010}), en cuanto a Stenotrophomonas, Staphylococcus y Acinetobacter, no se encontraron reportes con esa capacidad. Los jales El Fraile por sus características es un ambiente que induce, selecciona y dota a las bacterias nativas con mecanismos para tolerar la toxicidad de metales.

Figura 3 Bioacumulación de metales pesados por TEM en una cepa JM01 aislada de rizosfera. a) Pb, b) Cr, y c) Cd. 

Figure 3 Heavy metal bioaccumulation by TEM of JM01 strain isolated from the rhizosphere. a) Pb, b) Cr, and c) Cd.) 

Biotransformación de arsénico. De las 141 cepas, 9% muestran la capacidad de oxidar As³⁺ a As⁵⁺ y 6% reducir As⁵⁺ a As³⁺ esto fue observado en mayor proporción en las bacterias aisladas de rizosfera, seguido por las de suelo y lixiviados. ^{Drewniak y Sklodowska (2013)} reportaron en suelos mineros a P. azotoformans y A. ferroxidans capaz de oxidar y reducir As y ^{Pandey y Bhatt (2015)} reportan a Exiguobacterium sp., As-9 capaz de biotransformar y remover As hasta en 99% en China, y se atribuye a la posible actividad de enzimas arseniato reductasa, y arsenito oxidasa y arseniato reductasa citoplasmática que facilitan la biotransformación del As, como un mecanismo de detoxificación. ^{Nunes et al. (2014)}, reportan la eficiencia de arseniato reductasa en Desulfovibrio alaskensis G20, todo esto es válido dado que diversas publicaciones comentan que la exposición al As de las bacterias nativas en sitios contaminados tienen la capacidad de oxidarlo o reducirlo.

Biotransformación de cromo. Solo 24% de todas las bacterias en El Fraile reducen el Cr⁶⁺, y las de rizosfera lo biotransforman en 64%. ^{Poornima et al. (2010)} reportó una cepa de Pseudomonas sp., con capacidad de reducir el Cr⁶⁺ hasta 97.8% partiendo de una concentración inicial de 100 µg mL^-1, en 24 h a pH de 5.0. ^{Oves et al. (2013)}, reportan la reducción de 1800 µg mL^-1 del metal en P. aeruginosa OSG41 en 120 h en pH de 6-8., y B. brevis redujo 78.5 % (^{Verma et al., 2009}), la reducción microbiana del Cr⁶⁺ es catalizada por enzimas solubles, excepto en P. maltophila O-2 y B. megaterium TKW3, que utilizan reductasas asociadas a la membrana (^{Cheung y Gu, 2007}). La reducción significativa del Cr⁶⁺ a Cr³⁺ es importante porque transforma al Cr tóxico y móvil en especies reducidas inocuas e inmóviles, fundamental para los procesos de biorremediación (^{Ahemad, 2014}).

Identificación molecular y filogenia de bacterias metalotolerantes. Los géneros bacterianos identificados corresponden a Chryseobacterium, Staphylococcus, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, y Serratia (Cuadro 1 y Figura 4). Por otra parte, ^{Yu et al. (2014)} aislaron 136 cepas de suelo de la mina V-Ti magnetita en China e identificaron que el mayor número de aislamientos fueron B. subtilis (32), B. pumilus (14), Rhizobium sp. (29) y O. intermedium (13).

Figura 4 Árbol filogenético obtenido a partir de la secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr de 10 aislados bacterianas de los jales mineros El Fraile (negritas). Fusobacterium varium (ATCC 8501) fue incluida como grupo externo. El árbol se construyó utilizando el método Neighbor-Joining con 1000 réplicas de Bootstrap (^{Saitou y Nei, 1987}). 

Figure 4  Phylogenetic tree obtained from 16S rRNA gene sequences of ten bacterial isolates from El Fraile mine tailings (bold type). Fusobacterium varium (ATCC 8501) was included as outgroup. The tree was built using the neighbor-joining method with 1000 bootstrap replications (^{Saitou and Nei, 1987}). 

Conclusiones

Se aislaron 141 cepas bacterianas de agua, lixiviados, suelo, rizosfera y tallos de plantas de los jales El Fraile, Guerrero, México. Estás bacterias demostraron capacidad de tolerar, acumular y biotransformar diferentes metales pesados y metaloides. La identificación molecular demostró que pertenecen a los géneros Chryseobacterium sp., Staphyloccoccus sp., Stenotrophomonas sp., Acinetobacter sp., Bacillus sp., Serratia sp., y Enterobacter sp. Estas bacterias han demostrado poseer características importantes que se requieren para la biorremediación de zonas altamente contaminadas por actividades mineras, es necesario realizar más trabajos que permitan conocer su potencial en los procesos de biorremediación de sitios contaminados.