Área de estudio

El experimento se estableció bajo condiciones de vivero en la comunidad de Almagres, municipio de Sayula de Alemán, Veracruz, México. Sitio con coordenadas de 17° 48" N y 94° 56" O (Figura 1) y altitud de 40 m. La zona tiene un clima cálido subhúmedo (Aw2) (^{García, 1998}) y la precipitación y la temperatura media anual es de 1750 mm y 25 ºC, respectivamente.

Figura 1: Sitio experimental bajo condiciones de vivero en Almagres, Veracruz, México. (Fuente: elaboración propia). 

Figure 1: Experimental site under nursery conditions in Almagres, Veracruz, Mexico. (Source: Author design). 

El suelo recolectado para la germinación de las semillas y para el trasplante donde se establecieron las plantas se muestran en el Cuadro 1, los análisis físico químicos se realizaron de acuerdo a la NOM-021-RECNAT-2000 (^{Norma Oficial Mexicana, 2002}) en el Laboratorio Agroindustrial, Suelo, Planta y Agua (LASPA) del Colegio de Postgraduados Campus Tabasco.

Obtención de Azospirillum spp.

Las bacterias del género Azospirillum spp., se obtuvieron por extracción de suelo rizosférico de cacahuate forrajero (Arachis pintoi), localizados en la Facultad de Ingeniería en Sistemas de Producción Agropecuaria de la Universidad Veracruzana (Acayucan, Veracruz, México) a través del método de conteo viable de células vivas por siembra en superficie (^{Madigan et al., 2009}). Se utilizaron diluciones seriadas con base en 10, diluyéndose 10 g de suelo en 90 mL de agua estéril, hasta 1 10^-2. Una vez que se obtuvo la cepa, se purificó y se siguió el procedimiento reportado por ^{Córdova-Bautista et al. (2009)} utilizando el medio de cultivo Rojo Congo Döbereiner para Azospirillum spp. El conteo de células viables se efectuó contabilizando las unidades formadoras de colonias (UFC) que crecieron en la superficie del medio de cultivo de la caja Petri, luego se transformó a UFC mL^-1, dando como resultado 9.8 × 10⁵ UFC de Azospirillum spp.

Proceso de evaluación

De abril a julio de 2016 se evaluaron las etapas de germinación, trasplante y cosecha de la planta moringa. Para la etapa de germinación, las semillas se sumergieron en agua durante 24 horas antes de la siembra de acuerdo a ^{Padilla et al. (2012)}, utilizando bandejas con 60 cavidades de 61.2 cm² cada una, utilizando una semilla por cavidad. Posteriormente, a los 25 días después de la siembra (DDS), se realizó el trasplante a bolsas de polietileno de un tamaño de 15 × 25 cm.

Inoculación de Azospirillum spp.

Se realizaron dos inoculaciones aplicadas al suelo en forma de disolución acuosa. La primera inoculación se realizó a los 10 días después del trasplante (DDT) y la segunda inoculación a los 15 días DDT. Las cantidades de inoculo aplicado fueron: 0.5, 1 y 1.5 mL de suspensión con 9.8 × 10⁵ UFC mL^-1 Azospirillum spp.

Diseño experimental y tratamientos

Se utilizó un diseño de bloques al azar con cuatro tratamientos y seis repeticiones, los cuales fueron: T₁AZ: Tratamiento 1 (0.5 mL de suspensión), T₂AZ: tratamiento 2 (1 mL de suspensión), T₃AZ: tratamiento 3 (1.5 mL de suspensión) y TSI: tratamiento sin inoculación (control). La unidad experimental consistió en una planta de Moringa oleifera Lam., con un arreglo espacial entre plantas de 30 × 30 cm.

Cosecha de las plantas

Las plantas fueron cosechadas a 70 días después de la siembra (DDS). Para todos los tratamientos, los componentes de la planta (hojas compuestas y tallos) fueron colectados y lavados por separado usando agua corriente, posteriormente se realizó el lavado con agua destilada. Finalmente, una vez lavadas y secadas, se colocaron en bolsas de papel para meterlas en estufa de aire forzado a 60 ºC, hasta obtener peso constante; después fueron molidas con criba de 2 mm.

Variables evaluadas

Las variables del material vegetal fueron estimadas de la siguiente manera: Peso seco en hoja y tallo (g) con la fórmula = (biomasa húmeda * % MS)/100. Proteína cruda (%) = método micro Kjeldahl (% N * 6.25) descrito por la ^{AOAC (2000)}.

Los siguientes elementos se determinaron por los métodos descritos por ^{Alcántar y Sandoval (1999)}, los cuales se validaron en el Laboratorio Agroindustrial, Suelo, Planta y Agua (LASPA) del Colegio de Postgraduados Campus Tabasco: el fósforo (P, %) y potasio (K, %) se midieron en el digestado con HNO₃ / HClO₄, la cuantificación del fósforo con espectrofotómetro UV-visible (Marcs Perkin Elmer, Modelo LAMBDA 10) y el potasio por espectrometría de absorción atómica (Perkin Elmer, Modelo 5000). El calcio (Ca, %), magnesio (Mg, %), sodio (Na, %), hierro (Fe, mg kg^-1), cobre (Cu, mg kg^-1), zinc (Zn, mg kg^‑1) y manganeso (Mn, mg kg^-1) se midieron usando un espectrofotómetro UV-visible y por espectrometría de absorción atómica.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante el programa Statistical Analysis System versión 9.0 (^{SAS, 2014}) y la comparación de medias se hizo con las variables que resultaron con diferencias estadísticas significativas con la prueba de Tukey (P ≤ 0. 05). Los datos de porcentaje se transformaron con raíz cuadrada, antes de realizar el análisis de varianza. En general, podemos decir que los datos que requieran la transformación con la raíz cuadrada no violan los supuestos del análisis de varianza debido a que los datos se hicieron más normales.

Peso seco y proteína cruda

No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos en cuanto a las variables peso seco de hoja y de tallo (P ≤ 0.05); en promedio se produjeron valores de 2.3 g en hoja y en el tallo, varió de 1.5 a 1.8 g. Respecto al contenido de proteína cruda en hojas y tallos, no se observaron diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre tratamientos, como se muestra en el Cuadro 3.

En el presente estudio la inoculación de Azospirillum spp. no afectó significativamente el rendimiento, lo que podría ser causado por la concentración del inoculo, la cual se relaciona directamente con los cambios que puede generar Azospirillum a nivel radicular: de acuerdo a ^{Zayed (2012)} encontró que las plántulas de moringa tratadas con Azospirillum brasilense mostraron un aumento significativo en el peso seco de las hojas de moringa en comparación con el control, resultados que difieren a los encontrados en este estudio, donde no se obtuvieron diferencias significativas, cabe mencionar que estos autores utilizaron una mayor concentración de UFC. ^{García et al. (2010)} encontraron que las cepas nativas de Azospirillum spp. aumentaron los niveles de materia seca de hojas y raíces de Oryza sativa L.; ^{Cárdenas Caro et al. (2014)} reportaron incrementos de 45.67% en materia seca foliar en plantas de Panicum maximum Jacq tratadas con Azospirillum y ^{Das et al. (2007)} muestran una mayor producción de biomasa en la planta de Rebaudiana Bert, con la aplicación de Azospirillum.

En cuanto a los contenidos de proteína cruda, ^{Guzmán-Maldonado et al. (2015)} mencionan que se pueden encontrar valores del 21% y ^{Moyo et al. (2011)} refiere que este valor puede llegar a ser de 30.3% en hojas de moringa, lo cual dependerá de la fertilización o no del cultivo. El presente estudio sugiere que la inoculación a 0.5, 1 y 1.5 mL de suspensión con 9.8 × 10⁵ UFC mL^-1 de Azospirillum spp., no aumentó estadísticamente los porcentajes de proteína con respecto a los resultados del control. Sin embargo, se encontró que con 1 mL de suspensión, se obtiene 30.2% de proteína. Los valores de proteína encontrados por (^{Guzmán-Albores et al., 2019}) son menores a los de este estudio, los cuales estuvieron en un rango de 22.9-24% a los 45 días después de la emergencia de la planta.

Aunque no se encontraron diferencias estadísticas en cuanto a PC, los valores más altos se asociaron a la inoculación con Azospirillum spp. Es importante señalar la importancia del N en la determinación de los niveles de PC; y es que los microorganismos benéficos mediante sus procesos metabólicos generan enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces del nitrógeno y del ácido fítico constituyéndose en precursores de reacciones químicas (^{Corrales-Ramírez et al., 2017}), además, las plantas de moringa solo se midieron en sus primeras etapas de crecimiento donde la planta no tiene un sistema de raíces bien desarrollado con raíces cortas y no pudo absorber el N del suelo; así que conforme ocurre el crecimiento aumentaría la utilización de N (^{Leghari et al., 2016}). Esto evidencia que en un periodo más largo de evaluación puede mejorarse los niveles de PC.

Los resultados de ^{Zayed (2012)} también difieren, debido que al aplicar 5 mL de biofertilizante (10⁸ UFC mL^-1) de Azospirillum brasilense y B. megatherium, encontraron diferencias estadísticas con los niveles más altos de proteína en hojas en comparación con el control (0.433 y 0.41 g de proteína respectivamente). ^{El-Baha et al. (2016)} usaron el producto HALEX como biofertilizante que incluye cepas de rizobacterias fijadoras de N₂ (Azospirillum brasilense, Azotobacter chroococcum y Klebsiella pneumoniae) reportando un valor de 23.28%, el cual es inferior a los encontrados en el presente estudio. Adicionalmente, ^{Mazher-Azza et al. (2014)} utilizaron los biofertilizantes fosforina, rizobactrina, microbina y nitrobina, encontraron valores de proteína de 17.1 a 18.4% en hojas y de 15.4 a 16.2% de proteína en tallos. ^{Attia et al. (2014)} reportaron valores entre 12.5 y 26.5% de proteína cuando se aplica la combinación de fertilizante mineral con biofertilizante basado en Azotobacter y Bactria en moringa, sin embargo, los resultados son inferiores a los encontrados en este estudio.

De acuerdo a ^{Davaran-Hagh et al. (2015)} una dosis al 75% de fertilizante químico nitrogenado más la inoculación con Azospirillum afecta significativamente la absorción de nutrientes en maíz. Tal como es el caso del cultivo de sorgo donde la inoculación con Azospirillum brasilense asociada con la fertilización con nitrógeno es beneficiosa para el rendimiento y contenido de N (^{Teixeira Filho et al., 2018}), por lo tanto de proteína.

Calidad nutrimental de hojas y tallos

Con respecto al contenido nutrimentales en hojas de moringa, se observaron diferencias altamente significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos; para la variable contenido de K y de acuerdo a la comparación de medias (P ≤ 0.05) los mejores tratamientos fueron T₁AZ y T₂AZ, como se muestra en el Cuadro 4. Estos resultados muestran que Azospirillum spp. mejoró los contenidos de K en las hojas de moringa y es que, aunque naturalmente, los suelos contienen K en cantidades mayores que cualquier otro nutriente, la mayor parte no está disponible para la absorción de la planta, sin embargo las bacterias beneficias además de proporcionar N para las plantas (a través de fijación de N₂), aumentan el crecimiento y la raíz de las plantas, lo que lleva a una mayor absorción de nutrientes entre ellos el K (^{Etesami et al., 2017}), como se encontró en el estudio realizado. Es necesario precisar que el K es uno de los elementos vitales necesarios para el crecimiento y la fisiología de las plantas, tiene una función reguladora en varios procesos bioquímicos relacionados con la síntesis de proteínas, el metabolismo de los carbohidratos, la activación enzimática, regulación estomática y la fotosíntesis lo que contribuye al crecimiento y desarrollo de las plantas (^{Hasanuzzaman et al., 2018}).

En relación con los contenidos nutrimentales en tallos de moringa, se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (P ≤ 0.05) para las variables: contenido de Ca, Na y Fe. Según la comparación de medias (P ≤ 0.05), el control fue el mejor tratamiento para la variable contenido de Ca, para el contenido de Na los mejores tratamientos fueron los tres con Azospirillum; para el contenido de Fe el mejor resultado fue con T₁AZ, como se muestra en el Cuadro 5. Los resultados en cuanto al Ca, pueden atribuirse a la capacidad de intercambio catiónico y materia orgánica (retención de cationes) del suelo donde se estableció moringa, por lo que Azospirillum spp. no mostró efectos significativos. Los contenidos de Ca se consideran adecuados en concentraciones de 1-5%, ya que las raíces extraen el calcio de la solución del suelo y lo envían a través del xilema, por lo que el flujo de Ca hacia el xilema es alto (^{White y Broadley, 2003}). En cuanto a los efectos significativos de Na por Azospirillum spp. es importante tomar en cuenta que moringa es una planta con metabolismo C3, con capacidad de producir frutos de alto valor energético como alimento humano y animal o combustible (^{Funes-Monzote et al., 2011}). En este sentido, aunque la absorción y el movimiento de Na a través de las plantas es limitado en condiciones naturales, es posible aumentar el ciclo del Na a través de las plantas mediante la implementación de prácticas adecuadas de manejo de nutrientes (^{Subbarao et al., 2003}), como sucedió en el estudio realizado. Otro aspecto importante en tipos de planta C3, es que el K puede ser remplazado por el Na en ciertas funciones metabólicas (^{Gattward et al., 2012}). Lo que puedo haber ocurrido en los contenidos de K en los tallos.

Respecto a los efectos significativos de Azospirillum spp. en los contenidos de Fe, es un resultado importante ya que generalmente su biodisponibilidad en entornos de pH neutro y aeróbico es limitada (aunque es abundante en los suelos), por lo que un desequilibrio entre la solubilidad del Fe en el suelo y la demanda de Fe por parte de la planta son las causas principales de la clorosis de Fe. El Fe juega un papel importante en diversas vías fisiológicas y bioquímicas en las plantas, ej. Síntesis de clorofila y es esencial para el mantenimiento de la estructura y función del cloroplasto (^{Rout y Sahoo, 2015}). En síntesis, Azospirillum spp. mejoró la biodisponibilidad del Fe.

Los valores reportados por ^{Moyo et al. (2011)} para micro y macro nutrientes en hojas provenientes de plantas sin ningún manejo de fertilización, muestran valores similares de P (0.3%) y K (1.5%) pero valores más altos de Ca (3.65%) y Mn (86.8 mg kg^-1) a los encontrados en el presente estudio. Los niveles de Cu (10 mg kg^-1) observados en el presente estudio fueron más altos, en comparación con el autor antes mencionado (8.2 mg kg^-1). Sin embargo, los contenidos de Cu con Azospirillum y el control fueron iguales estadísticamente, esto se debe a que los contenidos de Cu en la planta, están directamente relacionados con los contenidos de Cu en el suelo, ya que la planta de ahí lo adquiere y de ello depende su variación, dónde el contenido es regulado por las células y orgánulos de la planta (^{Yruela, 2005}). También se encontraron contenidos más altos de Cu (10 mg kg^-1) y Fe (95 mg kg^‑1) frente a los encontrados por ^{Zayed (2012)} 0.003 mg kg^-1 y 1.468 mg kg^-1, respectivamente; el mismo autor no encontró efectos significativos de Azospirillum en los contenidos de P y K, vale la pena señalar que el autor utilizó 5 mL de biofertilizante basado en Azospirillum (10⁵ UFC mL^-1). ^{El-Baha et al. (2016)} utilizaron el producto HALEX como biofertilizante que incluye cepas de rizobacterias fijadoras de N₂ (Azospirillum brasilense, Azotobacter chroococcum y Klebsiella pneumoniae) y encontraron valores más altos de P (1.63%), Ca (6.61%) y valores similares de K (1.59%) en hojas. ^{Mazher-Azza et al. (2014)} encontraron valores de P en hojas de 0.20% y K de 1.73% valores más bajos en términos de P y más altos en K en comparación con el estudio. Respecto al contenido de P y K en el tallo, los autores encontraron 0.25 y 1.5%, respectivamente, que son diferentes de los encontrados en este estudio (0.31% P y 0.7% K), estos resultados difieren por el tipo de microorganismo utilizado y su concentración. ^{Attia et al. (2014)} combinaron fertilizante mineral con biofertilizante basado en Azotobacter y Bactria en moringa, encontraron resultados menores de P (0.29%), K (1.32%) y Ca (0.58%) en relación con los valores encontrados en este estudio de 0.35%, 1.6% y 1.4% de P, K y Ca respectivamente, sin embargo, los valores de Mg fueron iguales (0.35%).